專利名稱：來自檀香屬的萜烯合酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的萜烯合酶。本發(fā)明還涉及編碼萜烯合酶的核酸、用于制備變體萜烯合酶的方法和表達(dá)本發(fā)明多肽的宿主生物體。本發(fā)明還包括用于制備萜烯合酶的方法和用于制備萜類化合物(如萜烯)的方法。
背景技術(shù)：
以下技術(shù)背景的討論僅為了便于理解本發(fā)明。該討論并非確認(rèn)或承認(rèn)，截至本申請的優(yōu)先權(quán)日，其所涉及的任何材料是或曾是普通常識的一部分。檀香(印度檀香Santalum album)(檀香科Santalaceae)是具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值的小型半寄生熱帶樹木，其被發(fā)現(xiàn)生長于印度南部、斯里蘭卡、印尼東部和澳大利亞北部。由于其細(xì)粒性、高密度和出色的雕刻特性，檀香木材受到高度追捧。檀香木材含有樹脂和精油，尤其是檀香醇、檀香烯以及數(shù)十種其他微量倍半萜。這些化學(xué)物質(zhì)提供了獨(dú)特的檀香香味。香木通常被磨碎并蒸汽蒸餾，其揮發(fā)油用作許多高端香水的固定劑。幾個(gè)世紀(jì)的過度開采已導(dǎo)致檀香天然林消亡。正在整個(gè)澳大利亞北部建立大型種植園，以滿足需求并保護(hù)剩余的儲備。檀香心材中含有高達(dá)6% (干重)的倍半萜油，主要是a -和-植香醇，a -反式-香梓橡醇和表-P -植香醇，以及倍半職烯經(jīng)a -和-植香烯，a-香檸檬烯和表-￠-檀香烯，￠-紅沒藥烯，a-、￠-和Y-姜黃烯。即使是在近乎相同的生長條件下，產(chǎn)于樹的心材油的量相差很大。這種產(chǎn)量差異的原因還不是很清楚，但可能是遺傳和環(huán)境因素兩者的結(jié)果。關(guān)于檀香中倍半萜類化合物(如倍半萜)的生物合成或其精油產(chǎn)生如何調(diào)控所知甚少。本發(fā)明解決了本領(lǐng)域?qū)τ糜诋a(chǎn)生萜烯的方法的需要，所述萜烯與檀香所產(chǎn)生的萜烯類似。發(fā)明概述在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其編碼萜烯合酶并且選自a)包含SEQ ID NO :I、SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列的核酸分子;b)核酸分子，其為(a)的片段；c)核酸分子，其包含與(a)或(b)互補(bǔ)的核苷酸序列；和d)核酸分子，其編碼萜烯合酶并與(a)-(c)中任一核酸分子具有至少或至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 的相同性；其中所述核酸分子編碼萜烯合酶。其它的實(shí)施方案包括本發(fā)明的核酸所編碼的多肽；包含本發(fā)明核酸的宿主細(xì)胞；非人生物體，其被修改以含有本發(fā)明的核酸；以及產(chǎn)生多肽的方法，其包括培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備至少一種萜烯合酶的方法，其包括在有助于產(chǎn)生所述至少一種萜烯合酶的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞被修改以含有至少一種核酸序列。本發(fā)明還提供分離的職烯合酶,其中所述職烯合酶為檀香屬(Santalum)職烯合酶；并且所述萜烯合酶催化檀香烯的產(chǎn)生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的萜烯合酶，其包括a) SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO 6 所示的氨基酸序列；b)由權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的核酸分子所編碼的氨基酸序列；c)氨基酸序列，其與SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列具有至少或至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高相同性;或 d) (a)、(b)或(C)的片段;其中所述萜烯合酶催化萜烯產(chǎn)生。本發(fā)明還提供萜烯合酶，其中所述萜烯合酶同時(shí)催化a-檀香烯、a-反式-香檸檬烯、表-P -檀香烯和P -檀香烯的產(chǎn)生。本發(fā)明還提供用于檢測樣品中萜烯合酶多肽或核酸的存在的方法。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生萜烯合酶的方法，所述方法包括以下步驟a)選擇宿主生物體和/或細(xì)胞，其不表達(dá)具有SEQ ID NO USEQ ID NO 3或SEQID NO 5所不序列的核酸分子；b)用具有SEQ ID NO :I、SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 5所示序列的核酸分子轉(zhuǎn)化所述生物體；和c)在有助于所述核酸編碼的萜烯合酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)所述生物體。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生萜烯合酶的方法，所述方法包括以下步驟a)選擇宿主生物體和/或細(xì)胞，其不表達(dá)具有SEQ ID NO USEQ ID NO 3或SEQID NO 5所不序列的核酸分子；b)用SEQ ID NO USEQ ID NO 3或SEQ ID NO 5所示序列的核酸分子以較高的量轉(zhuǎn)化所述生物體；和c)在有助于所述核酸編碼的萜烯合酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)所述生物體。本發(fā)明還提供了制備萜烯的方法，包括a)使無環(huán)焦磷酸萜烯前體與本發(fā)明的萜烯合酶接觸，和，b)任選地,分離在步驟(a)中產(chǎn)生的職烯。優(yōu)選地，所述方法實(shí)施于在細(xì)胞中異源表達(dá)的萜烯合酶上；其中無環(huán)焦磷酸萜烯前體與所述萜烯合酶在同一細(xì)胞中表達(dá)；并且接觸無環(huán)焦磷酸萜烯前體的步驟發(fā)生于所述細(xì)胞中。更優(yōu)選地，所述至少一種萜烯選自(+)_表-￠-檀香烯、(-)-P-檀香烯、(+)-3-檀香烯、(+) - a -檀香烯、(-)-a -檀香烯、順式-a -香檸檬烯、反式-a -香檸檬烯，反式_ P _香朽1檬烯和順式_ P _香朽1檬烯。本發(fā)明的萜烯合酶產(chǎn)生的萜烯可進(jìn)一步加工為醇，優(yōu)選為a-檀香醇，￠-檀香醇，a-反式-香檸檬醇和/或表-￠-檀香醇。附圖簡述
圖I :印度檀香(S. album)天然檀香油的色譜圖。4個(gè)主峰是a -檀香烯、E_a -香檸檬烯、表-P -檀香烯和P -檀香烯。圖2 :與FPP溫育后的SaSSy產(chǎn)物譜的GC圖譜(trace)，以及用GC-MS檢測的來自與FPP溫育后的SaSSy產(chǎn)物譜的a -檀香烯、a -反式-香檸檬烯、表-P -檀香烯和P -檀香烯的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。 圖3 :與FPP溫育后的SaSSy、SauSSy和SspiSSy產(chǎn)物譜的疊加GC圖譜，以及用GC-MS檢測的來自與FPP溫育后的SaSSy產(chǎn)物譜的a -檀香烯、a _反式-香檸檬烯、表-P -檀香烯和P -檀香烯、順式-P -金合歡烯和反式-P -金合歡烯的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。圖4 :本發(fā)明的SaSSy萜烯合酶的核酸序列。圖5 :本發(fā)明的SaSSy萜烯合酶的氨基酸序列。圖6A和6B :萜烯合酶的Clustal比對FB299123_125_香根草(Vetiveria zizanoides)職烯合酶(W0 2006134523)、AF484125-煙草(Nicotianaattenuata) 5_ 表-馬 5 鈴烯(aristolochene)合酶、AB438045-梓樣香桃(Backhousiacitriodora)芳樟醇合酶、Santalene-本發(fā)明的來自檀香的SaSSy檀香烯合酶。圖7 :圖6中比對的蛋白質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)生樹。圖8 :28種不同的萜烯合酶基因的UPGMA比對樹。參考代碼如下
ISaSSy [印度擅香(Santalum album) ] ；2 SauSSy [新克里多尼亞擅香(Santalumaustrocaledonicum) ] ；3 SspiSSy[澳洲擅香(Santalum spicatum) ] ；4 ACF24767. I 單職合酶[印度檀香];5 SauMonoTPSl [新克里多尼亞檀香];6 SspiMonoTPSl [澳洲檀香]；7 ACF24768. I SaSesquiTPSl [印度檀香]；8 SausSesquiTPSl [新克里多尼亞檀香];9 SspiSesquiTPSl [澳洲擅香];10 AAS79351. I (-) _a_ 松油醇合酶[葡萄(Vitisvinifera) ] ；11 BAG82825. I 芳樟醇合酶[朽1 樣香桃(Backhousia citriodora) ] ； 12AAV63788. I a -姜烯合酶[羅勒(Ocimum basilicum)] ；13 AAR99061. 1(_)_ 大根香葉烯 D合酶[毛果楊(Populus trichocarpa) X 美洲黑楊(Populus deltoides) ] ； 14 CAA06614. I5-表-馬5 鈴烯[辣椒原變種(Capsicum annuum var. annuum) ] ； 15 CAA77191. I (+) - 5-杜松烯合酶[亞洲棉(Gossypium arboreum) ] ； 16 AA073863. I (+) -3-蒈烯合酶[歐洲云杉(Picea abies) ] ； 17 AAC05727. I d_ 療子稀合酶[大冷杉(Abies grandis) ] ；18AAF61453. I P -水芹烯合酶[大冷杉];19 AAC05728. I Y -蛇麻烯合酶[大冷杉];20AAS47691. I LAS[歐洲云杉]；21 AAC39443. I ent-貝殼杉烯合酶[擬南芥(Arabidopsisthaliana) ] ；22 ADB55710. I (-) _ent_ 貝殼杉烯合酶[北美云杉(Picea sitchensis)]；23 AAM53944. 1AF514287_1(+)-檸檬烯合酶 I [檸檬(Citrus limon)] ；24 AAA86337. Ivetispiradiene 合酶[純天仙子(Hyoscyamus muticus) ] ；25 AAF61439. I 紫穗槐-4,11-二烯合酶[青蒿(Artemisia annua) ] ；26 BAF02832. I 單職合酶[藍(lán)按(Eucalyptusglobulus) ] ；27桉葉素合酶[希臘鼠尾草(Salvia fruticosa) ] ；28香檜烯合酶[Salviapomifera]圖9 :28種不同的職烯合酶基因的Neighber joining比對樹。參考代碼如圖8。圖IOa-IOg :新克里多尼亞檀香、澳洲檀香和印度檀香的萜烯合酶核酸序列的比對。圖lla-c :新克里多尼亞檀香、澳洲檀香和印度檀香的萜烯合酶蛋白質(zhì)氨基酸序列的比對。

圖12a_d:新克里多尼亞檀香、澳洲檀香和印度檀香的萜烯合酶蛋白質(zhì)氨基酸序列的比對，其與DQ785793. I-希臘鼠尾草桉葉素合酶和DQ785794. I-Salvia pomifera香檜烯合酶的氨基酸序列相比較。詳述發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)了來自印度檀香的新的萜烯合酶基因SaSSy。還發(fā)現(xiàn)了來自其它兩個(gè)不同系統(tǒng)發(fā)生的物種的直系同源基因(來自澳洲檀香的SspiSSy和來自新克里多尼亞檀香的SauSSy)。新基因由SEQ ID NO USEQ ID NO :3或SEQ ID NO :5所示的DNA序列表征。
在SEQ ID NO 1中公開的新基因以下一般稱作SaSSy，在SEQ ID NO 3中公開的新基因以下一般稱作SauSSy，而在SEQ ID NO :5中公開的新基因以下一般稱作SspiSSy。SaSSy,SauSSy和SspiSSy的DNA和蛋白質(zhì)序列是非常高度保守的，在ORF的氨基酸上具有94-98%的相同性。該基因的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域是非常高度保守的(見圖4和5)。新的萜烯合酶催化由FPP產(chǎn)生萜類化合物，優(yōu)選為萜烯，更優(yōu)選為選自以下的倍半萜a -檀香烯、a -反式-香檸檬烯、表-0 -檀香烯和P -檀香烯。更具體地，SaSSy、SauSSy和SspiSSy為倍半職合酶，并且最具體地，為檀香烯合酶。如本文中所用，“萜烯合酶”是催化由底物產(chǎn)生一或多種萜類化合物，或更優(yōu)選地產(chǎn)生一或多種萜烯的酶；“倍半萜合酶”是催化合成倍半萜類化合物，或更優(yōu)選地合成倍半萜烯的酶，而“檀香烯合酶”是催化檀香烯合成的酶。由底物形成萜類化合物和/或萜烯可使用本領(lǐng)域已知的任何方法評估，包括但不限于，下述實(shí)施例6和7中描述的酶測定和質(zhì)譜法。萜類化合物在本文定義為通過萜烯合酶活性和可能的其它酶的后續(xù)修飾而衍生自異戊二烯基二磷酸底物的化合物。包含在術(shù)語萜類化合物中的是非氧化的萜類烯烴(萜烯)、氧化的萜烯和其它衍生物如萜醇。如本文中所用，萜烯為基于異戊二烯單元(C5H8)的不飽和烴，并且具有CltlH16的通式。萜烯可以為無環(huán)的、單環(huán)的或多環(huán)的。萜烯包括，但不限于，單萜，其含有10個(gè)碳原子；倍半萜，其含有15個(gè)碳原子；二萜，其含有20個(gè)碳原子；和三萜，其含有30個(gè)碳原子。提及萜烯時(shí)包括所述萜烯的立體異構(gòu)體。本發(fā)明中提及檀香烯時(shí)包括a -檀香烯和0 -檀香烯，以及其任何立體異構(gòu)體，包括，例如，(+)_表-￠-檀香烯、(-)-3-檀香烯、(+)-3-檀香烯、(+)_a-檀香烯和(-)-a -植香烯。這些新萜烯合酶基因的分離將使得可以合成與天然油相似的檀香油。迄今為止，使用其它來源的倍半萜合酶合成一些倍半萜是可能的，但是其組分倍半萜的范圍和每個(gè)組分的終比例與天然檀香油并不相似。優(yōu)選地，本發(fā)明的萜烯合酶基因分離自檀香屬的成員。更優(yōu)選地，其分離自印度檀香(Indian Sandalwood、白擅、Chandana)、澳洲擅香(Australian Sandalwood)或新克里多尼亞檀香。然而，所述基因還可分離自選自以下的植物密花澳洲檀香(S. acuminatum)(Desert Quandong, Sweet Quandong, Native Peach);濱海夏威夷擅香(S. ellipticum)(濱海檀香);智利檀香(S. fernandezianum);垂枝夏威夷檀香(S. freycinetianum);欖綠夏威夷檀香(S. haleakalae);大花澳洲檀香(S. Ianceolatum)(北澳檀香);巴布亞檀香(S. macgregorii)；鉤葉澳洲檀香(S. murrayanum)(苦Quandong);傘花澳洲檀香(S. obtusifolium);亮葉夏威夷擅香(S. paniculatum);柳葉擅香(S. salicifolium)(柳葉檀香);或斐濟(jì)檀香(S. yasi)。因此，提供了分離的萜烯合酶，其中所述萜烯合酶為檀香屬萜烯合酶；并且所述萜烯合酶催化檀香烯產(chǎn)生。優(yōu)選地,這樣的職烯合酶包括a)選自SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6所示序列的氨基酸序列；或
b)氨基酸序列，其與SEQ ID NO :2所示序列具有至少或至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高的相同性；或c) a)或 b)的片段；其中所述萜烯合酶催化檀香烯產(chǎn)生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的萜烯合酶，其包括a) SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO 6 所示的氨基酸序列；b)由權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的核酸分子所編碼的氨基酸序列；c)氨基酸序列，其與SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列具有至少或至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高的相同性；或d) (a)、(b)或(C)的片段；其中所述萜烯合酶催化萜烯產(chǎn)生。優(yōu)選地，這樣的萜烯合酶包含選自對應(yīng)于SEQ ID NO :2的32-42、221-425、321-325,314-315和423-426位氨基酸的氨基酸。更優(yōu)選地，所述職烯合酶催化職烯的產(chǎn)生，所述職烯選自單環(huán)倍半職、雙環(huán)倍半職和三環(huán)倍半萜，特別地，其中所述萜烯是從無環(huán)焦磷酸萜烯前體如焦磷酸金合歡酯(FPP)合成。SEQ ID NO USEQ ID NO 3或SEQ ID NO 5的核苷酸序列涵蓋單一 0RF。本發(fā)明提供了分離的DNA核苷酸序列，其對應(yīng)于SEQ ID NO: I所示的萜烯合酶基因SaSSy的核苷酸序列、SEQ ID NO :3所示的職烯合酶SauSSy的核苷酸序列或SEQ ID NO :5所示的SspiSSy的核苷酸序列，或與SEQ ID NO U SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :5基本同源的序列，或它們的片段。本發(fā)明還提供了 DNA序列，其包含以下序列的互補(bǔ)序列SEQ ID NO USEQ ID NO3或SEQ ID NO :5，或與SEQ ID NO USEQ ID NO :3或SEQ ID NO :5基本上同源的序列，或它們的片段。因此本發(fā)明提供了編碼萜烯合酶的分離的核酸分子，其選自a)包含SEQ ID NO :I、SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列的核酸分子;b)核酸分子，其為(a)的片段；c)核酸分子，其包含與(a)或(b)互補(bǔ)的核苷酸序列；和d)核酸分子，其編碼萜烯合酶并與(a)-(c)中任一核酸分子具有至少或至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 的相同性；其中所述核酸分子編碼萜烯合酶。
分離的核酸分子編碼優(yōu)選地與(a)-(d)中任一核酸分子所編碼的萜烯合酶具有至少或至少約 61%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%相同性的萜烯合酶，其中序列中的差異為氨基酸取代。SaSSy、SauSSy和SspiSSy的核苷酸序列是非常高度保守的(見圖4)。SEQ ID NO :1所示的SaSSy核苷酸序列編碼在第143位氨基酸具有脯氨酸的多肽(SEQ ID NO 2) o然而，所編碼的多肽在第143位還可具有絲氨酸(SEQ ID NO :7和SEQ IDNO 8)。兩種變體序列為基本同源的，尤其由于這兩個(gè)殘基都是極性的，并且隨后的測試已表明，這兩種蛋白質(zhì)在測定時(shí)具有基本相同的活性，并以基本相同的比例產(chǎn)生各種化合物。一般地，兩種變體蛋白具有相同的活性并以相同的比例產(chǎn)生各種化合物。所述DNA序列還可對應(yīng)于SEQ ID NO U SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :5的片段。優(yōu)選地，所述片段選自SEQ ID NO 1的下列位置961-975位(通常對應(yīng)于DDxxD基序)，94-126位(通常對應(yīng)于R(R/P)X8W基序)。不受任何特定理論的約束，相信DDxxD基序負(fù)責(zé)螯合二價(jià)金屬離子(例如，鎂離子)，并且如果被去除，可能造成該蛋白質(zhì)完全無功能。在蛋 白質(zhì)起始處的R(R/P)X8I基序也被相信是萜烯合酶獨(dú)有的，并且被認(rèn)為涉及非手性FPP或GPP分別特定地電離為手性的橙花叔醇二磷酸和橙花基二磷酸。通過Kampranis等人(2007)的工作推斷,其它對本發(fā)明的三種檀香烯合酶的特定功能來說可能是必不可少的區(qū)域是氨基酸位置314和315 (核苷酸位置940-945)。用具有相似極性的較大或較小的殘基取代這些殘基可能會改變活性中心的大小，并因此改變催化產(chǎn)生的產(chǎn)物。如Kampranis等人所證實(shí)的,所述檀香烯合酶的第422-426位氨基酸殘基(核苷酸1264-1278)還可能負(fù)責(zé)終產(chǎn)物譜。在a 19螺旋起始處的脯氨酸殘基的重要性是緊緊把握底物，而去除該脯氨酸可能引起功能性缺失。氨基酸位置221-426定義了涵蓋許多優(yōu)選保留的更重要區(qū)域的較大的區(qū)域。因此，在這些位置的殘基優(yōu)選為保守的(完整功能)，或有稍微變化(改變的功能)。因此，DNA序列還可能優(yōu)選對應(yīng)于SEQ ID N0U SEQID NO 3 或 SEQ ID NO 5 的片段，其選自 SEQ ID NO 1 的如下位置940-945、661_1278 或1264-1278 位。同源核酸分子是指預(yù)先確定的相同或同源的核苷酸數(shù)目。同源性包括不改變所編碼氨基酸的取代(即“沉默取代”)和相同的殘基。基本同源的核酸分子通常以中度嚴(yán)格性或高度嚴(yán)格性與感興趣的核酸分子的全長或至少約70 %、80 %或90 %的全長雜交。也考慮這樣的核酸分子，其含有替換雜交核酸分子中的密碼子的簡并密碼子。可用已知的計(jì)算機(jī)算法來確定任何兩個(gè)核酸分子是否具有至少
90 %、95 %、96 %、97 %、98 % 或 99 % 的“相同性”，例如 “FAST A” 程序，其使用如 Pearson等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 =2444(1988)所述的默認(rèn)參數(shù)(其它的程序包括GCG程序包(Devereux, J.等人，Nucleic Acids Research 12(1) :387 (1984))、BLASTP、BLASTN, FASTA (Atschul, S. F.等人，J. Molec. Biol. 215 :403 (1990) ;Guide to HugeComputers, Martin J. Bishop, ed. , Academic Press, San Diego (1994)和 Carillo 等人，SIAM J Applied Math 48:1073(1988))。其它的商業(yè)或公開可用的程序包括DNAStar的“MegAlign”程序(Madison，WI)和威斯康星大學(xué)遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(UWG)的“Gap”程序(Madison WI))。例如，核酸分子同源性或相同性的百分比可通過使用GAP計(jì)算機(jī)程序(例如，Needleman 等人，J. Mol. Biol. 48 :443 (1970),如 Smith 和 Watermand 所修改的(Adv.AppI. Math. 2 :482(1981))來比較序列信息而確定。簡言之，GAP程序?qū)⑾嗨菩远x為相似的比對符號(即核苷酸)的數(shù)目除以兩條序列中較短那條的符號總數(shù)。GAP程序的默認(rèn)參數(shù)可包括(I) 一元比較矩陣(對與相同性，值為I ;和對于非相同性，值為0)和加權(quán)比較矩陣，Gribskov 等人，Nucl. Acids Res. 14 :6745 (1986)，如 Schwartz 和 Dayhoff, eds.，Atlasof Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation,pp. 353-358(1979)中所描述的；(2)對每個(gè)缺口 3. 0的罰分和每個(gè)缺口中每個(gè)字符0. 10的額外罰分；和(3)對末端缺口不罰分。當(dāng)本發(fā)明的多核苷酸序列或其片段特異性地與另一 SaSSy、SauSSy或SspiSSy多核苷酸(或其互補(bǔ)鏈)在選擇性的雜交條件下雜交時(shí)，貝1J存在基本上的同源性或相同性。如本文中所用，“特異性雜交”是指核酸分子(如，寡核苷酸)與靶核酸分子通過互補(bǔ)的堿基配對退火。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉影響特異性雜交的體外和體內(nèi)參數(shù)(如特定分子的長度和組成)。與體外雜交特別相關(guān)的參數(shù)進(jìn)一步包括退火和洗滌溫度、緩沖液組成和鹽濃度。去除非特異性結(jié)合的核酸分子的示范性洗滌條件在高度嚴(yán)格性下為0. 1XSSPE,0. 1%SDS，65°C，而在中度嚴(yán)格性為0. 2 X SSPE,0. 1% SDS，50°C。等效的嚴(yán)格性條件是本領(lǐng)域已 知的。技術(shù)人員可輕易地調(diào)整這些參數(shù)，以在低、中或高度嚴(yán)格性條件下實(shí)現(xiàn)核酸分子與靶核酸分子(適合于特定應(yīng)用的)的特異性雜交。一般地，當(dāng)至少約14個(gè)核苷酸的片段存在至少約55%，優(yōu)選至少約65%，更優(yōu)選至少約75%，最優(yōu)選至少約90%相同性時(shí)，選擇性雜交將會發(fā)生。同源性長度比較，如所描述的，可在更長的片段上進(jìn)行并且在某些實(shí)施方案中經(jīng)常會在至少約9個(gè)核苷酸、通常至少約20個(gè)核苷酸、更通常至少約24個(gè)核苷酸、一般至少約28個(gè)核苷酸、更通常至少約32個(gè)核苷酸并且優(yōu)選至少約36個(gè)或更多核苷酸的片段上進(jìn)行。因此，本發(fā)明的多核苷酸序列優(yōu)選與本文中的序列表所示的序列具有至少75%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%的同源性。更優(yōu)選具有至少95%、更優(yōu)選至少98%的同源性。核苷酸同源性比較可如下描述的用于多肽的比對進(jìn)行。優(yōu)選的序列比較程序是GCGWisconsin Bestfit 程序。在本發(fā)明中，同源性序列包括在核酸水平上與相應(yīng)的SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3或 SEQ ID NO 5 所示的核苷酸序列在至少 20、50、100、200、300、500、1000、1500 或 1710 個(gè)核苷酸上具有至少60、70、80或90%相同性，優(yōu)選至少95%或98%相同性的核苷酸序列。尤其是，同源性一般應(yīng)考慮編碼已知對萜烯合酶基因功能是必不可少的連續(xù)氨基酸序列的核酸序列區(qū)域，而不是非必要的鄰近序列。例如，編碼氨基酸位置32-42(核苷酸94-126)和/或氨基酸位置321-325(核苷酸961-975)的核酸序列，和/或可選地編碼氨基酸位置221-426 (核苷酸661-1278)，位置314-315 (核苷酸940-945)和/或位置422-426 (核苷酸1264-1278)的核酸序列。本發(fā)明的SaSSy、SauSSy或SspiSSy多核苷酸序列片段將優(yōu)選為至少15個(gè)核苷酸的長度，更優(yōu)選至少20、30、40、50、100或200個(gè)核苷酸的長度。一般地，多核苷酸序列的長度越短，獲得選擇性雜交所要求的同源性越高。因此，當(dāng)本發(fā)明的多核苷酸序列由少于約30個(gè)核苷酸組成時(shí)，與本文中序列表所列出的多核苷酸序列相比，應(yīng)優(yōu)選相同性的百分比高于75%，優(yōu)選高于90%或95%。相反地，當(dāng)本發(fā)明的多核苷酸序列由例如多于50或100個(gè)核苷酸組成時(shí)，與本文中序列表所列出的多核苷酸序列相比，相同性的百分比可較低，例如高于50%，優(yōu)選高于60%或75%。本發(fā)明的與SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 5所示序列同源的核酸序列可根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)表征并分離，如通過序列特異性的引物擴(kuò)增、在較高或較低嚴(yán)格性條件下與序列特異性的探針雜交、血清學(xué)篩查方法或通過LiPA分型系統(tǒng)。SaSSy的基因組DNA序列在SEQ ID NO 9中提供。還提供了 SaSSy、SauSSy和SspiSSy基因的RNA。RNA序列優(yōu)選源自以上描述并提供于 SEQ ID NO USEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO 5 的 DNA 序列。本發(fā)明還提供了可與SaSSy、SauSSy或SspiSSy基因組DNA雜交的RNA片段。所述RNA或RNA片段序列還可源自SaSSy、SauSSy或SspiSSy或其片段的cDNA序列。本發(fā)明還提供了包含一些不會實(shí)質(zhì)上改變其與SaSSy、SauSSy或SspiSSy雜交能 力的缺失或突變的核酸序列和片段。這樣的變體被認(rèn)為形成了上述DNA、RNA或片段的顯而易見的等效物。本發(fā)明其它優(yōu)選的變體核酸序列包括與任何上述給定的本發(fā)明的核酸序列相比冗余的序列，冗余由遺傳密碼簡并性導(dǎo)致。這些變體核酸序列會因此與其所來源的核酸序列一樣編碼相同的氨基酸序列。優(yōu)選地，這些變體的DNA、RNA或CDNA可與SaSSy、SauSSy或SspiSSy基因序列相應(yīng)的部分雜交。本發(fā)明還包括SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 5的DNA序列或相應(yīng)的RNA序列或其片段的序列變體，其包含一或多個(gè)核苷酸的缺失和/或插入，尤其是一或多個(gè)密碼子的插入或缺失。還包括一些非必須核苷酸由其它核苷酸(包括修飾的核苷酸和/或肌苷)的取代。本發(fā)明特別優(yōu)選的變體多核苷酸還包括在嚴(yán)格性條件下與任何本發(fā)明的核酸序列雜交的序列。因此，優(yōu)選與如上描述的本發(fā)明的任何序列顯示有高程度同源性(相似性)的序列。尤其優(yōu)選的是與所述本發(fā)明的核酸序列具有至少80^^85^^90^^95%或更高同源性的序列。優(yōu)選地，所述序列將具有所述核酸序列原始核苷酸的少于20 %、15 %、10 %或5%的變異。還提供了引物和探針，其可從本發(fā)明的任何DNA或RNA序列或序列片段出發(fā)來制備。優(yōu)選地，這樣的探針或引物長約5至50核苷酸，更優(yōu)選約10至25核苷酸。優(yōu)選地，探針或引物寡核苷酸包含來自萜烯合酶核酸分子的至少或至少約15、20、25、30、35、40、45、
50、60個(gè)或更多的連續(xù)的核苷酸。本發(fā)明的探針和引物可用于PCR、測序反應(yīng)、雜交反應(yīng)和技術(shù)人員已知的其它應(yīng)用。優(yōu)選地，探針和/或引物會從易于由技術(shù)人員確定的高G和C含量的區(qū)域生成。本發(fā)明還涉及寡核苷酸引物，其包含SEQ ID NO USEQ ID NO :3或SEQ ID NO 5的部分，所述引物能夠作為特異性擴(kuò)增SaSSy、SauSSy或SspiSSy核酸的引物。優(yōu)選地，所述引物是單鏈DNA寡核苷酸序列，其能夠作為弓I物延伸產(chǎn)物的合成起始點(diǎn)，所述引物延伸產(chǎn)物與待復(fù)制的核酸鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的。所用引物的具體長度和序列取決于所需的DNA或RNA靶的復(fù)雜度以及引物使用的條件，如溫度和離子強(qiáng)度。擴(kuò)增引物不是必須與對應(yīng)的模板序列準(zhǔn)確匹配以保證正確的擴(kuò)增的事實(shí)在文獻(xiàn)(Kwok等人，1990)中充分記錄。所用擴(kuò)增方法可為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR ;Saiki等人，1988)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR ；Langdren 等人，1988 ；ffu 和 Wallace, 1989 ；Barany, 1991)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA ；Guatelli 等人，1990 ；Compton, 1991)、基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS ；Kwoh 等人，1989)、鏈置換擴(kuò)增(SDA ;Duck，1990 ;Walker等人，1992)或通過Q 3復(fù)制酶的擴(kuò)增(Lizardi等人，1988 ；LomeIi等人，1989)或任何其它合適的使用引物延伸擴(kuò)增核酸分子的方法。在擴(kuò)增期間，擴(kuò)增產(chǎn)物可通過使用標(biāo)記的引物或摻入標(biāo)記的核苷酸被方便地標(biāo)記。標(biāo)記可能為同位素的(32P、35S等)或非同位素的(生物素、地高辛等)。擴(kuò)增反應(yīng)重復(fù)20-70次，最好25-45次。本發(fā)明還涉及寡核苷酸探針，其包含SEQ ID NO USEQ ID NO 3或SEQ ID NO 5的部分，所述探針能夠作為SaSSy、SauSSy或SspiSSy基因的雜交探針。優(yōu)選地,所述探針為單鏈的序列特異性寡核苷酸序列，其具有與待測定的SaSSy、SauSSy或SspiSSy基因的靶序列互補(bǔ)的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)可雜交的嚴(yán)格性會由這樣的條件所影響鹽濃度、溫度或有機(jī)溶劑，還有堿基組成、互補(bǔ)鏈長度和雜交核酸間錯(cuò)配核苷酸堿基的數(shù)目。嚴(yán)格性溫度條件一般會包括超過30°C的溫度，通常超過37°C，并且優(yōu)選超過45°C。嚴(yán)格性鹽條件通常會低于IOOOmM, —般低于500mM，并且優(yōu)選低于200mM。然而，參數(shù)的組合比任何單個(gè)的參數(shù)更重要。嚴(yán)格性雜交條件的一個(gè)實(shí)例是65°C、0. 1XSSC(1XSSC = 0. 15M NaCl，0. 015M檸檬酸鈉，pH 7.0)。任選地，本發(fā)明的探針被標(biāo)記和/或連接至固體基質(zhì)。固體基質(zhì)指寡核苷酸探針可偶聯(lián)的任何基質(zhì)，條件是所述寡核苷酸探針保持雜交特性并使雜交背景保持低水平。固體基質(zhì)通常是微量滴定板、膜(如尼龍膜或硝酸纖維素膜)或微球(珠)。在施加至膜或固定之前，可方便地修飾核酸探針以促進(jìn)固定或改進(jìn)雜交效率。這樣的修飾可涵蓋同聚物加尾、偶聯(lián)不同的活性基團(tuán)(如脂肪基團(tuán)、NH2基團(tuán)、SH基團(tuán)、羧基基團(tuán))或偶聯(lián)生物素或半抗原。本發(fā)明的探針還包括連接至標(biāo)記或報(bào)告分子的分離的多核苷酸并 且可用于通過標(biāo)準(zhǔn)方法分離其它具有序列相似性的多核苷酸序列。用于制備和標(biāo)記探針的技術(shù)見，如Sambrook 和 Russell (2001)或 Ausubel 等人，(2001)。本發(fā)明的用作引物或探針的寡核苷酸還可能含有或由核苷酸類似物(如硫代磷酸酯(Matsukura 等人，1987)、燒基磷酸酯(alkylphosphoriate) (Miller 等人，1979)或肽核酸(Nielsen等人，1991 ;Nielsen等人，1993))組成,或可能包含插層劑(Asseline等人，1984)。為了積極地影響如雜交動(dòng)力學(xué)、雜交物形成的可逆性、寡核苷酸分子的生物學(xué)穩(wěn)定性等等性狀，引入這些修飾可能是有益的。本發(fā)明還提供了含有SaSSy、SauSSy或SspiSSy基因DNA序列片段的重組DNA，并且其可能用作，例如，探針。優(yōu)選地，用于產(chǎn)生重組DNA的質(zhì)粒是在原核或真核細(xì)胞中可擴(kuò)增的并攜帶所述片段的質(zhì)粒。例如，使用含有SaSSy基因DNA片段的克隆的DNA作為分子雜交探針，通過放射性核苷酸或熒光試劑標(biāo)記，例如在檀香樹的不同組織中，該基因可被直接檢測。SaSSy、SauSSy或SspiSSy多核苷酸序列(優(yōu)選以探針的形式)還可被固定到固相支持物上來檢測SaSSy基因。在本發(fā)明可選的形式中，SaSSy、SauSSy或SspiSSy多核苷酸序列與其他多核苷酸序列(如來自其他萜烯合酶基因)一起可以這樣的方式被固定于固相支持物，即其允許確定結(jié)合固相支持物的適當(dāng)萜烯合酶基因和/或任何其他多核苷酸序列在材料(如樹樣品)中的存在。在本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了用于產(chǎn)生DNA分子的固定化文庫的技術(shù)。一般地，多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)方法描述了單鏈核酸分子文庫的合成，例如使用屏蔽技術(shù)在固體基質(zhì)上的不同的離散位置建立不同的序列排列(permutation)。美國專利號5，837，832描述了用于產(chǎn)生固定于硅基質(zhì)上的DNA陣列的基于非常大規(guī)模的整合技術(shù)的改進(jìn)方法。特別地，美國專利號5，837，832描述了叫做“覆瓦(tiling) ”的用于在基質(zhì)上空間限定的位置合成特定探針組的策略，其可用于產(chǎn)生本發(fā)明的固定化DNA文庫。美國專利號5，837，832還提供了關(guān)于可使用的早期技術(shù)的參考文獻(xiàn)。因此多核苷酸序列探針可在基質(zhì)表面原位合成。另外，單鏈分子可不在固體基質(zhì)上合成而將每個(gè)預(yù)先形成的序列施加至固體基質(zhì)上的離散位置。例如，多核苷酸序列可用配備了針腳或壓電器件的機(jī)械設(shè)備直接印于基質(zhì)上。
文庫序列一般固定于固體基質(zhì)的離散區(qū)域上或離散區(qū)域內(nèi)。基質(zhì)可以是多孔的(以允許在基質(zhì)內(nèi)的固定)或基本上非多孔的(在該情況下文庫序列通常固定于基質(zhì)表面)。固體基質(zhì)可由多肽可直接地或間接地結(jié)合的任何材料制成。適當(dāng)?shù)墓腆w基質(zhì)的實(shí)例包括平板玻璃、硅片、云母、陶瓷和有機(jī)聚合物(如塑料，包括聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯)。也還可能使用半透膜(如廣泛可獲得的硝酸纖維素或尼龍膜)。所述半透膜可安裝于更堅(jiān)硬的固體表面如玻璃上。其表面可任選地涂有金屬層，如金、鉬或其它過渡族金屬。合適的固體基質(zhì)的具體實(shí)例是商業(yè)可得的BiaCoreTM芯片(Pharmacia Biosensors)。優(yōu)選地，固體基質(zhì)通常為具有剛性或半剛性表面的材料。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述基質(zhì)的至少一個(gè)表面為基本平的，不過在一些實(shí)施方案中，可能需要用例如凸起區(qū)域或蝕刻坑道為不同聚合物進(jìn)行物理上的分區(qū)。所述固體基質(zhì)還優(yōu)選為適合于在一般為50至100 u m的離散區(qū)域以高密度施加DNA序列，給出10000至40000點(diǎn)/cnT2的密度。所述固體基質(zhì)可方便地分為區(qū)段(section)。這可通過例如光蝕刻技術(shù)，或通過應(yīng)用疏水性油墨，例如基于聚四氟乙烯的油墨(Cel-line, USA)來實(shí)現(xiàn)。多核苷酸序列與基質(zhì)的連接可通過共價(jià)或非共價(jià)的方法。所述多核苷酸序列可通過文庫序列所結(jié)合的一層分子連接于基質(zhì)。例如，多核苷酸序列可標(biāo)記有生物素并且基質(zhì)用抗生物素蛋白和/或鏈霉親和素包被。使用生物素化多核苷酸序列的一個(gè)便利的特點(diǎn)是可容易地測定偶聯(lián)至固體基質(zhì)的效率。由于多核苷酸序列可能與一些固體基質(zhì)僅很差地結(jié)合，因此通常有必要在固體基質(zhì)(例如玻璃)與核酸序列之間提供化學(xué)界面。適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)界面的實(shí)例包括六乙二醇。另一個(gè)實(shí)例是使用聚賴氨酸包被的玻璃，然后使用標(biāo)準(zhǔn)方法化學(xué)修飾聚賴氨酸來引入親和配體。其它的通過使用偶聯(lián)劑將分子連接到固體基質(zhì)表面的方法是本領(lǐng)域已知的，見例如W098/49557。互補(bǔ)多核苷酸序列與被固定的核酸文庫的結(jié)合可用各種方法測定，如結(jié)合的多核苷酸序列的光學(xué)特征的變化(即通過使用溴化乙錠)或通過使用標(biāo)記的核酸如用熒光團(tuán)標(biāo)記的多核苷酸。其它不需要使用標(biāo)記的檢測技術(shù)包括光學(xué)技術(shù)如光聲學(xué)、反射法、橢圓偏光法和表面等離子共振(見W097/49989)。因此，本發(fā)明提供了固體基質(zhì)，其具有固定于其上的至少一種本發(fā)明的多核苷酸，優(yōu)選兩或多種不同的本發(fā)明的多核苷酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中固體基質(zhì)還含有源自除SaSSy、SauSSy或SspiSSy多核苷酸序列以外的基因的多核苷酸序列。優(yōu)選地，SaSSy、SauSSy或SspiSSy基因的轉(zhuǎn)錄被上調(diào)或促進(jìn)(例如在人工系統(tǒng)如宿主細(xì)胞或重組植物中)，其可導(dǎo)致提高的油產(chǎn)量。這種上調(diào)或提高可由極多方法完成，如插入額外的或可選的調(diào)控序列至考慮中的基因的上游和/或下游，或產(chǎn)生已存在的調(diào)控序列的突變體，所述突變體能夠由于例如其調(diào)控元件結(jié)合的提高而提高轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明還覆蓋了由上述RNA和DNA核苷酸序列及其片段所編碼的多肽。本發(fā)明還提供了如 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO 6 所示的分離的 SaSSy、SauSSy 或SspiSSy氨基酸序列及其片段。更合乎需要地，所述SaSSy、SauSSy或SspiSSy氨基酸序列以基本上純化的形式提供。也提供多肽片段，其具有更低分子量并具有與SEQ ID N0:2、SEQID NO :4或SEQ ID NO :6所示那些一樣的肽序列或片段。如本文中所用，“氨基酸”為含有氨基基團(tuán)和羧酸基團(tuán)的有機(jī)化合物。多肽含有兩個(gè)或多個(gè)氨基酸。為了本文中的目的，氨基酸包括20種天然存在的氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸類似物(即其中的a碳具有側(cè)鏈的氨基酸)。為了符合在 J. Biol. Chem.，243 :3552-3559(1969)中描述的和 37C. F. R. . § § I. 821-1. 822所采用的標(biāo)準(zhǔn)多肽命名法，氨基酸殘基的縮寫示于下列的對應(yīng)表
中
權(quán)利要求
1.分離的核酸分子，其編碼萜烯合酶并選自 a)包含SEQID NO USEQ ID NO 3或SEQ ID NO 5所示核苷酸序列的核酸分子； b)核酸分子，其為(a)的片段； c)核酸分子，其包含與(a)或(b)互補(bǔ)的核苷酸序列；和 d)核酸分子，其編碼萜烯合酶并與(a)-(c)的任一核酸分子具有至少或至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 的相同性； 其中所述核酸分子編碼萜烯合酶。
2.權(quán)利要求I的分離的核酸分子，其編碼與(a)-(d)的任一核酸分子所編碼的萜烯合酶具有至少或至少約 61%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%的相同性的萜烯合酶，其中序列上的差異為氨基酸取代。
3.權(quán)利要求I或2的核酸分子，其包含編碼SEQID NO :2所示氨基酸序列的32-42、221-426、321-325、314-315或422-426位氨基酸的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的核酸分子,其中所編碼的職烯合酶是檀香屬(Santalum)職烯合酶。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的核酸分子，其編碼選自印度檀香(S.album)、澳洲檀香(S. spicatum)、新克里多尼亞檀香(S. austrocaledonicum)、密花澳洲檀香(S. acuminatum)、濱海夏威夷擅香(S. ellipticum)、智利擅香(S. fernandezianum)、垂枝夏威夷檀香(S. freycinetianum)、欖綠夏威夷檀香(S. haleakalas)、大花澳洲檀香(S. Ianceolatum)、巴布亞擅香(S. macgregorii)、鉤葉澳洲擅香(S. murrayanum)、傘花澳洲擅香(S. obtusifolium)、亮葉夏威夷擅香(S. paniculatum)、柳葉擅香(S. salicifolium)和斐濟(jì)檀香(S. yasi)職烯合酶的職烯合酶。
6.分離的萜烯合酶，其中 所述萜烯合酶為檀香屬萜烯合酶；和 所述萜烯合酶催化檀香烯產(chǎn)生。
7.權(quán)利要求6的萜烯合酶，其包含 a)選自SEQID NO :2、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6所示序列的氨基酸序列；或 b)氨基酸序列，其與SEQID N0:2所示氨基酸序列具有至少或至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高的相同性；或 c)a)或b)的片段； 其中所述萜烯合酶催化檀香烯產(chǎn)生。
8.分離的萜烯合酶，其包含 a)SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO 6 所示的氨基酸序列； b)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的核酸分子所編碼的氨基酸序列； c)氨基酸序列，其與SEQID N0:2所示的氨基酸序列具有至少或至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高的相同性；或 d)(a)、(b)或(c)的片段； 其中所述萜烯合酶催化萜烯產(chǎn)生。
9.權(quán)利要求8的萜烯合酶，其包含選自對應(yīng)于SEQID NO :2的32-42、221-425、321-325,314-315和423-426位氨基酸的氨基酸。
10.權(quán)利要求8或9的職烯合酶,其催化職烯的產(chǎn)生,所述職烯選自單環(huán)倍半職、雙環(huán)倍半萜和三環(huán)倍半萜。
11.權(quán)利要求6-10中任一項(xiàng)的職烯合酶,其中所述職烯是由無環(huán)焦磷酸職烯前體合成。
12.權(quán)利要求11的萜烯合酶，其中所述前體為焦磷酸金合歡酯(FPP)。
13.權(quán)利要求6-12中任一項(xiàng)的萜烯合酶，其中所述萜烯合酶能夠在FPP的C3和C7碳原子之間形成鍵以產(chǎn)生至少一種包含C3-C7鍵的雙環(huán)或三環(huán)倍半萜。
14.權(quán)利要求13的萜烯合酶，其中所述具有C3-C7鍵的倍半萜構(gòu)成所述萜烯合酶所合成的倍半萜產(chǎn)物總量的至少或至少約1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80% 或更多。
15.權(quán)利要求13或14的萜烯合酶，其中所述倍半萜為檀香烯。
16.權(quán)利要求15的萜烯合酶，其中所述檀香烯為a-檀香烯或0 -檀香烯。
17.權(quán)利要求15或16的萜烯合酶，其中所述檀香烯為選自(+)_表-￠-檀香烯、(-)-3-檀香烯、(+)-3-檀香烯、(+) - a -檀香烯和(-)-a -檀香烯的立體異構(gòu)體。
18.權(quán)利要求6-17中任一項(xiàng)的萜烯合酶，其中所述萜烯合酶能夠在FPP的C2和C7碳原子之間形成鍵以產(chǎn)生至少一種包含C2-C7鍵的雙環(huán)或三環(huán)倍半萜。
19.權(quán)利要求18的萜烯合酶，其中所述具有(2-(7鍵的倍半萜構(gòu)成了所述萜烯合酶所合成的倍半萜產(chǎn)物總量的至少或至少約1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80% 或更多。
20.權(quán)利要求18或19的萜烯合酶，其中所述倍半萜為香檸檬烯。
21.權(quán)利要求18-20中任一項(xiàng)的萜烯合酶，其中所述倍半萜為選自順式-a-香檸檬烯、反式-a -香檸檬烯、反式-香檸檬烯和順式-P -香檸檬烯的香檸檬烯立體異構(gòu)體。
22.權(quán)利要求6-21中任一項(xiàng)的萜烯合酶，其中 所述萜烯合酶催化a-檀香烯產(chǎn)生，并且所產(chǎn)生的a-檀香烯的量至少為或至少約為所產(chǎn)生的萜烯總量的 1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80% 或更多。
23.權(quán)利要求6-22中任一項(xiàng)的萜烯合酶，其中 所述萜烯合酶催化￠-檀香烯產(chǎn)生，并且所產(chǎn)生的￠-檀香烯的量至少為或至少約為所產(chǎn)生的萜烯總量的 1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80% 或更多。
24.權(quán)利要求6-23中任一項(xiàng)的萜烯合酶，其中所述萜烯合酶催化兩種或多種萜烯產(chǎn)生。
25.權(quán)利要求24的職烯合酶,其中至少一種職烯選自(+)_表-P-檀香烯、(-)_0 -檀香烯、(+)-0-檀香烯、(+) - a -檀香烯和(-)-a -檀香烯、E- a -香朽1檬烯、Y -姜黃烯、3 -紅沒藥烯、￠-姜黃烯、a -姜黃烯、反式-反式-金合歡醇、a -菔烯、茨烯、朽1檬烯和a-異松油烯。
26.權(quán)利要求6-25中任一項(xiàng)的萜烯合酶，其中所述萜烯合酶同時(shí)催化a-檀香烯、a -反式-香檸檬烯、表-P -檀香烯和P -檀香烯的產(chǎn)生。
27.權(quán)利要求26的萜烯合酶，其在同一反應(yīng)混合物中、在相同反應(yīng)條件下催化至少a -檀香烯、a -反式-香檸檬烯、表-0 -檀香烯和P -檀香烯的產(chǎn)生。
28.權(quán)利要求26的萜烯合酶，其催化a-檀香烯、a-反式-香檸檬烯、表-￠-檀香烯和￠-檀香烯以下述彼此之間的比例產(chǎn)生a-檀香烯(38.0%)、a-反式-香檸檬烯(12. 1% )、表-￠-檀香烯(4.7% )和 ￠-檀香烯(45.2% )。
29.權(quán)利要求6-28中任一項(xiàng)的萜烯合酶，其催化a-檀香烯、a-反式-香檸檬烯、表-3 -檀香烯和3 -檀香烯的產(chǎn)生，使得進(jìn)一步處理后，所述化合物產(chǎn)生以下彼此之間的比例的各自的醇a -檀香醇(25-65% )、a -反式-香檸檬醇(1-20% )、表-P -檀香醇(1-15% )和 ￠-檀香醇(20-50% )。
30.編碼權(quán)利要求6-29中任一項(xiàng)的萜烯合酶的核酸分子。
31.引物或探針寡核苷酸，其含有來自權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的核酸分子的至少或至少約15、20、25、30、35、40、45、50、60個(gè)或更多的連續(xù)核苷酸。
32.用于檢測樣品中萜烯合酶存在的方法，包括以下步驟 a)使可能含有權(quán)利要求6-29中任一項(xiàng)的萜烯合酶的樣品與特異性結(jié)合萜烯合酶的抗體在使得包含所述抗體和萜烯合酶的反應(yīng)復(fù)合物形成的條件下相接觸；和 b)檢測樣品中包含所述抗體和萜烯合酶的反應(yīng)復(fù)合物的形成，其中檢測出所述反應(yīng)復(fù)合物的形成表明在樣品中存在萜烯合酶。
33.權(quán)利要求32的方法，其進(jìn)一步包括步驟 c)評估所形成的反應(yīng)復(fù)合物的量，從而確定生物學(xué)樣品中萜烯合酶的量。
34.用于檢測生物學(xué)樣品中的核酸分子的方法，包括以下步驟 a)在合適的雜交條件下使所述生物學(xué)樣品與權(quán)利要求31的引物或寡核苷酸相接觸；和 b)檢測引物或寡核苷酸與所述樣品中的核酸分子之間形成的任何雙鏈體。
35.用于檢測生物學(xué)樣品中的萜烯合酶核酸分子的方法，包括以下步驟 a)用至少一種權(quán)利要求31的引物或寡核苷酸來擴(kuò)增所述核酸分子，和 b)檢測擴(kuò)增的核酸分子。
36.載體,其包含權(quán)利要求1-5或權(quán)利要求30中任一項(xiàng)的核酸分子。
37.權(quán)利要求36的載體,其中所述載體為原核載體、病毒載體或真核載體。
38.權(quán)利要求36或37的載體，其為表達(dá)載體。
39.細(xì)胞，其包含權(quán)利要求36-38中任一項(xiàng)的載體。
40.權(quán)利要求39的細(xì)胞，其為原核細(xì)胞。
41.權(quán)利要求39的細(xì)胞，其為細(xì)菌細(xì)胞。
42.權(quán)利要求39的細(xì)胞，其為真核細(xì)胞。
43.權(quán)利要求42的細(xì)胞，其中所述真核細(xì)胞為酵母細(xì)胞或植物細(xì)胞。
44.權(quán)利要求43的細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞來自茄科(Solaniaceae)或唇形科(Lamiaceae)植物。
45.權(quán)利要求39-44中任一項(xiàng)的細(xì)胞所產(chǎn)生的萜烯合酶。
46.用于制備萜烯合酶的方法，其包括步驟在使所編碼的萜烯合酶表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求39-44中任一項(xiàng)的細(xì)胞。
47.權(quán)利要求46的方法,其進(jìn)一步包括純化所述職烯合酶。
48.產(chǎn)生萜烯合酶的方法，所述方法包括以下步驟 a)選擇宿主生物體和/或細(xì)胞，其不表達(dá)具有SEQID NO U SEQ ID NO :3或SEQ IDNO 5所不序列的核酸分子； b)用具有SEQID NO USEQ ID NO :3或SEQ ID NO :5所示序列的核酸分子轉(zhuǎn)化所述生物體；和 c)在有助于由所述核酸編碼的萜烯合酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)所述生物體。
49.產(chǎn)生萜烯合酶的方法，所述方法包括以下步驟 a)選擇宿主生物體和/或細(xì)胞，其表達(dá)具有SEQID NO USEQ ID NO :3或SEQ ID NO:5所不序列的核酸分子； b)用具有SEQID NO USEQ ID NO :3或SEQ ID NO :5所示序列的核酸分子以較高的量轉(zhuǎn)化所述生物體；和 c)在有助于由所述核酸編碼的萜烯合酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)所述生物體。
50.制備萜烯的方法，其包括 a)使無環(huán)焦磷酸萜烯前體與權(quán)利要求6-29或45中任一項(xiàng)的萜烯合酶相接觸，和， b)任選地，分離在步驟(a)中產(chǎn)生的職烯。
51.權(quán)利要求50的方法，其中 所述萜烯合酶在細(xì)胞異源表達(dá)； 所述無環(huán)焦磷酸萜烯前體與所述萜烯合酶表達(dá)于同一細(xì)胞中；和 所述與無環(huán)焦磷酸前體接觸的步驟發(fā)生在所述細(xì)胞中。
52.制備至少一種萜烯的方法，其包括 a)在有助于萜烯產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，其中所述細(xì)胞異源表達(dá)權(quán)利要求6-29中任一項(xiàng)的萜烯合酶；并且所述細(xì)胞表達(dá)無環(huán)焦磷酸萜烯前體；和 b)任選地，從非人生物體分離所述職烯。
53.權(quán)利要求50-52中任一項(xiàng)的方法，其中所述無環(huán)焦磷酸萜烯前體選自焦磷酸香葉酯(GPP)、焦磷酸金合歡酯(FPP)和焦磷酸香葉基香葉酯(GGPP)。
54.權(quán)利要求50-53中任一項(xiàng)的方法,其中所述職烯選自倍半職、二職和單職。
55.權(quán)利要求50-54中任一項(xiàng)的方法，其中所述萜烯為雙環(huán)或三環(huán)倍半萜。
56.權(quán)利要求50-55中任一項(xiàng)的方法,其中所述職烯選自a-檀香烯、a-反式-香朽1檬烯、表-￠-檀香烯、￠-檀香烯、Y-姜黃烯、￠-紅沒藥烯、￠-姜黃烯、a-姜黃烯、反式-反式-金合歡醇、a -菔烯、莰烯、檸檬烯和a -異松油烯。
57.權(quán)利要求50-55中任一項(xiàng)的方法，其中所述職烯選自(+)-表-P-檀香烯、(-)-3-檀香烯、(+) - 3 -檀香烯、(+) - a -檀香烯和(-)-a -檀香烯。
58.權(quán)利要求50-57中任一項(xiàng)的方法，其中產(chǎn)生兩種或多種萜烯。
59.權(quán)利要求58的方法，其中至少一種萜烯選自a-檀香烯、￠-檀香烯、香檸檬烯、Y-姜黃烯、￠-紅沒藥烯、￠-姜黃烯、a-姜黃烯、反式-反式-金合歡醇、a-菔烯、莰烯、檸檬烯和a -異松油烯。
60.權(quán)利要求58的方法，其中至少一種萜烯選自(+)_表-￠-檀香烯、(-)-P-檀香烯、(+)-3-檀香烯、(+) - a -檀香烯、(-)-a -檀香烯、順式-a -香檸檬烯、反式-a -香檸檬烯、反式_香朽1檬烯和順式_香朽1檬烯。
61.權(quán)利要求50-60中任一項(xiàng)的方法，其中 所述萜烯為a-檀香烯；和 所產(chǎn)生的a -檀香烯的量至少或至少約為所產(chǎn)生的萜烯總量的1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80% 或更多。
62.權(quán)利要求50-60中任一項(xiàng)的方法，其中 所述萜烯為￠-檀香烯；并 所產(chǎn)生的P -檀香烯的量至少或至少約為所產(chǎn)生的萜烯總量的I %、2 %、3 %、4 %、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80% 或更多。
63.權(quán)利要求53-62中任一項(xiàng)的方法，其中 至少產(chǎn)生四種萜烯； 所述四種萜烯包括a -檀香烯、a -反式-香檸檬烯、表-0 -檀香烯和P -檀香烯；和a-檀香烯、a-反式-香檸檬烯、表-￠-檀香烯和￠-檀香烯以下述彼此之間的比例產(chǎn)生a-檀香烯(38.0% )、a-反式-香檸檬烯(12. I %)、表-P -檀香烯(4.7%)和￠-檀香烯(45. 2% )。
64.權(quán)利要求50-63中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括將所述萜烯處理為醇。
65.權(quán)利要求64的方法，其中所述醇選自a-檀香醇、￠-檀香醇、a-反式-香檸檬醇和表-檀香醇。
66.權(quán)利要求64或65的方法,其中 至少產(chǎn)生四種萜烯； 所述四種萜烯包括a -檀香烯、a -反式-香檸檬烯、表-0 -檀香烯和P -檀香烯；和在進(jìn)一步處理后，a -檀香醇、a -反式-香檸檬醇、表-3 -檀香醇和0 -檀香醇以下述彼此之間的比例產(chǎn)生a -檀香醇(25-65% )、a -反式-香檸檬醇(1-20% )、表-P _檀香醇(1-15% )和P -檀香醇(20-50% )。
67.權(quán)利要求66的方法，其中a-檀香醇、a-反式-香檸檬醇、表-￠-檀香醇和￠-檀香醇彼此之間的比例為a_檀香醇(59. 28%)、a-反式-香檸檬醇(7. 32% )、表-P -檀香醇(3. 45% )和￠-檀香醇(29. 0% )0
68.用于證明萜烯合酶存在的試劑盒，其包括 a)預(yù)定量的至少一種配體，其結(jié)合權(quán)利要求6-29中任一項(xiàng)的萜烯合酶，其中所述配體包含可檢測的標(biāo)記； b)其它試劑；和 c)使用所述試劑盒的說明書。
69.用于證明編碼萜烯合酶的核酸分子存在的試劑盒，其包括 a)預(yù)定量的至少一種標(biāo)記的權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的核酸分子或權(quán)利要求35的引物； b)其它試劑；和 c)使用所述試劑盒的說明書。
70.權(quán)利要求32-35中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品來自檀香樹。
71.權(quán)利要求70的方法，其中 在來自兩種不同檀香樹的至少兩個(gè)樣品上實(shí)施所述方法； 測定每個(gè)樣品中的萜烯合酶或編碼萜烯合酶的核酸的量； 選擇含有最高量的萜烯合酶或編碼萜烯合酶的核酸的樣品所來源的檀香樹；并 對所選擇的檀香樹進(jìn)行選擇性育種或收獲以獲取檀香油。
72.權(quán)利要求6-29中任一項(xiàng)的萜烯合酶，其還包括化學(xué)、酶學(xué)或翻譯后修飾。
73.權(quán)利要求72的萜烯合酶，其中所述化學(xué)、酶學(xué)或翻譯后修飾選自乙酰化、糖基化、羧基化、羥基化、硫酸化、磷酸化、泛素化和標(biāo)記。
74.標(biāo)記的權(quán)利要求6-29中任一項(xiàng)的萜烯合酶，其中所述標(biāo)記選自放射性同位素、抗配體、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光劑和酶。
75.權(quán)利要求6-29中任一項(xiàng)的萜烯合酶，其為融合蛋白或嵌合蛋白。
76.權(quán)利要求6-29中任一項(xiàng)的萜烯合酶，其中位于對應(yīng)于SEQID NO :2的143位氨基酸位置的氨基酸殘基為絲氨酸。
全文摘要
分離的核酸分子，其編碼萜烯合酶并選自a)包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO5所示核苷酸序列的核酸分子；b)核酸分子，其為(a)的片段；c)核酸分子，其包含與(a)或(b)互補(bǔ)的核苷酸序列；和d)核酸分子，其編碼萜烯合酶并與(a)-(c)的任一核酸分子具有至少或至少約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的相同性；其中所述核酸分子編碼萜烯合酶。
文檔編號C12N15/63GK102725410SQ201080038885
公開日2012年10月10日 申請日期2010年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月29日
發(fā)明者C·瓊斯, J·博爾曼, J·莫尼奧迪斯, K·G·楚拉克 申請人:森林產(chǎn)品委員會, 英屬哥倫比亞大學(xué), 西澳大學(xué)