專利名稱：一種水稻萜烯合成酶，編碼其的基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物分子生物學領域，特別涉及一種水稻萜烯合成酶，編碼其的基因及其應用。
背景技術：
植物的間接防御反應首次是在玉米上被發現的(Turlings et al.，1990)，這種防御反應的特點是被植食性昆蟲取食之后，植物依靠特異性揮發物的釋放來吸引昆蟲的天敵，從而達到防御植食性昆蟲的目的。許多植物在被植食性昆蟲取食之后可以提高特異性揮發物釋放的量，一些植食性昆蟲誘導的揮發物可以吸引植食性昆蟲的天敵(捕食性或寄生性)，這些揮發物就成為植物間接防御的媒介(信號)物質，所以植物間接防御研究的核心是植物特異性的揮發性信號物質及其調控機制(Takabayashi and Dicke, 1996 ； Pichersky and Gershenzon, 2002 ；Dudareva et al.，2006)。相對于已經有一定研究基石出的生態方面的研究，植物間接防御反應在分子生物學方面的研究還是剛剛起步的。利用分子生物學技術以及轉基因技術研究植物特異性的揮發物可以最大程度的去除背景干擾，容易地找到植食性昆蟲誘導后表達量特異性上升的揮發物。目前植物間接防御反應在分子生物學方面的研究主要進行以下兩方面一方面是有多少基因直接參與植食性昆蟲誘導后， 植物特異性揮發物的生物合成；另一方面是這些基因怎樣調控揮發物的合成，產物是什么以及這些產物具有什么樣的作用等等(Yuanet al.，2008)。植物萜烯(單萜烯、倍半萜烯、雙萜烯)類化合物是植物在被植食性昆蟲誘導后最常見，最多樣的植物揮發物類群(Pare and Tumlinson，1999)。一些特定種類的萜烯化合物在植物間接防御方面的功能，已經通過人工合成標準化合物，從生態學方面進行了研究 (Kessler and Baldwin，2001)。在基因水平上，從調控植物萜烯合成酶基因的表達出發， 也驗證了部分萜烯化合物在植物間接防御方面的功能(Kappers et al. ,2005 ；Schnee et al.，2006)。所有的萜烯化合物都是由萜烯合成酶調控合成的，萜烯合成酶是合成植物萜烯類揮發物末端合成酶。因此，研究萜烯合成酶以及萜烯合成酶基因對于確定植食性昆蟲誘導的植物特異性揮發物具有重要意義。

發明內容
為了解決上述問題，本發明提供一種水稻萜烯合成酶，編碼其的基因及其應用。為實現上述目的，本發明首先提供一種水稻萜烯合成酶Ostps，其為由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質。應當理解，本領域技術人員可根據本發明公開的氨基酸序列，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。因此，本發明水稻萜烯合成酶還包括由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列中經取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等活性的由SEQ ID N0. 2所示的蛋白質衍生的蛋白質。優選的，衍生蛋白的氨基酸序列與SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的同源性可為
370%以上，優選80%以上，更優選90%以上。本發明還提供編碼上述蛋白的基因。優選的，本發明提供的編碼水稻萜烯合成酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。應理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領域技術人員可以根據需要使用適合特定物種表達的密碼子。本發明還提供的含有水稻萜烯合成酶基因的載體、宿主細胞及宿主菌均屬于本發明的保護范圍。其中，優選的宿主細胞為植物宿主細胞。當1-2齡二化螟幼蟲取食水稻時，水稻會上調基因Ostps的表達量，此基因及其產物可以幫助水稻更加吸引二化螟絨繭蜂雌蟲，從而水稻依靠自身的間接防御機制抵抗二化螟的取食。


圖1為構建消減文庫的水稻總RNA電泳圖，(A) 二化螟誘導水稻不同時間段的總 RNA電泳圖，(B)沒有經過二化螟誘導的水稻不同時間段的總RNA電泳圖。圖2為構建消減文庫的水稻mRNA電泳圖。1 :Takara 2000bpmarker ；2 對照水稻總RNA純化后的mRNA ；3 二化螟誘導水稻后總RNA純化后的mRNA。圖3為反向Northern斑點雜交圖譜。A由經過水稻抑制性消減文庫正向文庫合成的探針雜交后的圖譜；B由經過水稻抑制性消減文庫反向文庫合成的探針雜交后的圖譜；C 由二化螟誘導的水稻總RNA未經過消減雜交合成探針雜交后的圖譜；D沒有經過二化螟誘導的水稻總RNA未經過消減雜交合成探針雜交后的圖譜。圖4為目的片段構建過程圖。圖5為RNA干擾載體pTCK303-RNAi-0stps連接成功后的酶切電泳圖譜。1 =Takara 2000bp Marker ；2 基因 Ostps干擾片段的PCR產物；3 :pMD-18T-simple_0stps BamH I/Kpn I 雙酶切產物；4 :pTCK303-RNAi-0stps-Sac I/Spe I 雙酶切；5 :pTCK303-RNAi_0stpsSac I/Spe I 雙酶切；6 :pTCK303-RNAi-0stps BamH Ι/Κρη I 雙酶切；7 :pTCK303-RNAi_0stps Sac I 單酶切產物；8 :pTCK303-RNAi-0stpsSpe I 單酶切產物；9 :pTCK303-RNAi_0stps Sac Ι/Κρη I 雙酶切產物；10 :pTCK303-RNAi-0stps Kpn I 單酶切產物。圖6為分蘗期Tl代轉基因水稻的Southern blot分子檢測圖，(A)為轉空載體對照陽性植株Southern blot雜交圖譜。雜交探針為RNA干擾載體pTCK303上的Hyg-B片段。圖7為Tl代轉基因水稻抗性植株的⑶S活性檢測圖。A為轉基因水稻幼苗的⑶S 活性檢測；B為轉基因水稻葉片的GUS活性檢測；C為轉基因水稻葉鞘的GUS活性檢測；D為轉基因水稻莖桿的GUS活性檢測；E為轉基因水稻根部的GUS活性檢測；F為轉基因水稻剛發芽種子的GUS活性檢測。圖8為分蘗期Tl代轉基因水稻植株的Northern blot檢測圖。A為七種水稻品系葉片組織Northern blot雜交圖；B為七種水稻品系葉鞘組織Northern blot雜交圖；WT 為野生型對照植株，VC為轉空載體對照植株，Ril 5為RNA干擾基因Ostps的轉基因水稻植株。圖9為分蘗期Tl代轉基因水稻植株的熒光定量PCR檢測圖。A為七種水稻品系葉片組織熒光定量PCR檢測圖；B為七種水稻品系葉鞘組織熒光定量PCR檢測圖；WT為野生型對照植株，VC為轉空載體對照植株，Ril 5為RNA干擾基因Ostps的轉基因水稻植株。圖10為二化螟絨繭蜂雌蟲的行為選擇實驗(對于轉空載體對照植株與沉默水稻基因Ostps的陽性水稻植株)，N為成功作出選擇的二化螟絨繭蜂雌蟲的數量；NR為不選擇的二化螟絨繭蜂雌蟲的數量；VC為轉空載體對照的水稻株系；RNAi3 5為沉默基因Ostps 的單拷貝轉基因陽性水稻株系。圖11為二化螟絨繭蜂雌蟲的行為選擇實驗(對于轉空載體對照植株與野生型對照植株)。N為成功作出先擇的二化螟絨繭蜂雌蟲的數量，NR為不選擇的二化螟絨繭蜂雌蟲的數量；WT為野生型對照株系；VC，為轉空載體對照的水稻株系。圖12為二化螟絨繭蜂雄蟲的行為選擇實驗(對于轉空載體對照植株與沉默水稻基因Ostps的陽性水稻植株)。N為成功作出先擇的二化螟絨繭蜂雄蟲的數量；VC為轉空載體對照的水稻株系；RNAi3 5為沉默基因Ostps系的單拷貝轉基因陽性水稻株。圖13為二化螟絨繭蜂雄蟲的行為選擇實驗(對于轉空載體對照植株與野生型對照植株)。N為成功選擇的二化螟絨繭蜂雄蟲的數量；VC為轉空載體對照的水稻株系；WT為野生型對照株系。圖14為分蘗期轉空載體水稻對照植株的揮發物氣質聯用圖譜。圖15為分蘗期沉默基因Ostps的水稻陽性植株的揮發物氣質聯用圖譜。圖16為檸檬烯(limonene)標準樣品氣質聯用圖譜。圖17為(E) - β -法尼烯((E) - β -farnesene)標準樣品氣質聯用圖譜。圖18為分蘗后期沉默基因Ostps的水稻陽性植株的揮發物氣質聯用圖譜。圖19為分蘗后期野生型對照水稻植株的揮發物氣質聯用圖譜。圖20為分蘗后期轉空載體對照植株的揮發物氣質聯用圖譜。圖21為水稻種植的花盆及土樣的揮發物氣質聯用圖譜。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1構建水稻抑制性消減cDNA文庫將水稻日本晴進行二化螟取食危害處理當日上午10時，將1-2齡二化螟幼蟲接到長勢相同的水稻葉鞘，計12株，每株接10頭，設置12株長勢相同的不接蟲水稻作為對照。分別在接蟲lh、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、12h、Mh、36h、72h收集植株的葉鞘組織，同時收集對應時間對照葉鞘組織。將處理的水稻葉片在液氮中研磨，利用Trizol提取RNA，電泳檢測RNA的質量(見圖1)，分光光度計測定RNA的濃度，分離純化出mRNA(見圖2、。根據 Clontech公司的PCRIelect cDNA Subtraction kit的方法進行抑制差減雜交，電擊轉化感受態細胞(Electro MAXTMDH5 α -ETM Cells)，菌液檢測文庫重組率及插入片段的大小。 進行反向Northern斑點雜交(見圖3)，選取差異表達克隆，并對差異性表達的cDNA克隆測序，得到水稻萜烯合成酶基因Ostps的cDNA片段。實施例2獲得Ostps cDNA全長利用Trizol提取野生型水稻日本晴的RNA，電泳檢測RNA的質量，分光光度計測定RNA的濃度，分離純化mRNA。根據消減文庫得到的水稻基因Ostps的cDNA片段設計合成特異性引物Gspl :5，-TTCAAAGAGCTGTTCAAGATA-3，(SEQ ID No. 5), Gsp2 5‘-TCTTTCCACCATCGTGTGATA-3‘ (SEQ ID No. 6)，用于 RACE-PCR 反應，利用 RACE 試劑盒(購自Initrogen公司)獲得基因全長，序列如SEQ ID No. 1所示，編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。實施例3鑒定水稻萜烯合成酶基因在水稻防御害蟲取食過程中的功能根據消減文庫得到的水稻基因Ostps cDNA片段設計引物tRi，正向引物tRiF 5，-tcaggtaccactagttCTACACGAAACGAATCCATA-3' (SEQ ID No. 3)，含 KpnI 和 SpeI 酶切位點；反向引物 tRiR :5，-catggatccgagctcAGTTCCAGGTGTTCCTCTAT-3，(SEQ ID No. 4)，含 BamHI和McI酶切位點。以水稻日本晴cDNA為模板擴增Ostps基因片段。利用膠回收試劑盒(Axygen公司)回收目的片段并連入pMD_18T simple克隆載體(Takara公司)構建成 pMD-18T-simple-0stps (圖 4)，并測序。采用AxyPerp質粒DNA小量提取試劑盒提取pMD-18T-simple-0stps，分別用BamHI和Kpnl、SpeI和McI雙酶切，雙酶切后，將酶切產物電泳檢測，并凝膠回收目的片段。用SpeI和McI雙酶切pTCK303載體，回收載體片段后與前述用相同酶酶切pMD-lST-simple-Ostps回收的目的片段進行連接，構建成TPS反向連接的 pTCK303-RNAi-0stps-。將構建的 pTCK303-RNAi_0stps-用 BamHI 和 Kpn I 雙酶切，回收載體片段，與前述用相同酶酶切pMD-lST-simple-Ostps回收的目的片段相連，構建成 pTCK303-RNAi-0stpso經農桿菌EHA105介導，將水稻基因Ostps的RNA干擾載體pTCK303-RNAi_0stps 和pTCK303空載體分別導入水稻愈傷組織中。每個品系獲得30株以上的TO代轉基因植株，即轉空載體對照品系，RNA干擾水稻基因Ostps的pTCK303-RNAi-0stps品系，并收獲了大量的TO代轉基因種子。種植得到Tl代轉基因植株，進行Southern blot檢測(圖6)，并進行⑶S活性檢測(圖7)，Northern blot (圖8)以及熒光定量PCR檢測(圖9)，確定單拷貝插入載體pTCK303-RNAi-0stps的Tl代轉基因陽性植株。對其分蘗期揮發物收集鑒定 (見圖14-21)，并采用Y形管嗅覺儀測定二化螟絨繭蜂(雄蟲、雌蟲)，1-2齡和3-4齡二化螟幼蟲對分蘗期不同處理水稻植株(沉默基因陽性植株、轉空載體對照植株和野生型對照植株)的趨性選擇行為(見圖10-13)。結果表明，水稻同一種萜烯合成酶基因，在水稻不同的生長發育時期所調控的揮發物是不同的；二化螟幼蟲(1-2齡，3-4齡)對三種品系的水稻(野生型對照，轉空載體對照，沉默基因Ostps的水稻)選擇沒有差異，表明，水稻基因Ostps對于二化螟幼蟲尋找寄主水稻可能沒有明顯的引誘作用(圖10)，但當1-2齡二化螟幼蟲取食水稻時，水稻會上調水稻基因Ostps的表達量，可以幫助水稻更加吸引二化螟絨繭蜂雌蟲(圖11)，從而水稻依靠自身的間接防御機制抵抗二化螟的取食，但對二化螟絨繭蜂雄蟲沒有引誘作用(圖12， 圖13)。一旦該基因的表達被抑制，水稻對二化螟絨繭蜂雌蟲的引誘作用隨即急劇降低。這些結果表明，水稻萜烯合成酶的催化產物具有引誘二化螟絨繭蜂雌蟲的作用，從而提高抗二化螟的取食。經過揮發物的收集以及氣質聯用(GC-MS)鑒定(圖14、15、16、17)，發現，水稻植株沉默基因Ostps后相比于對照植株(轉空載體對照，野生型對照)，在分蘗期和分蘗后期會缺失多種揮發物(圖18、19、20、21)，其中檸檬烯與(Ε)-β-法尼烯的缺失已經經過標準樣品的氣質聯用試驗的進一步驗證。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種水稻萜烯合成酶蛋白，其為1)由SEQID No. 2所示的氨基酸組成的蛋白質，或2)在SEQID NO. 2所示的氨基酸序列中經取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因。
3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
4.含有權利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權利要求4所述載體的宿主細胞。
6.根據權利要求5所述的宿主細胞，其特征在于，其為植物宿主細胞。
7.權利要求2或3所述的基因或權利要求4所述的載體在制備轉基因植物中的應用。
8.權利要求2或3所述的基因在合成萜烯化合物中的應用。
9.權利要求2或3所述的基因在增加植物間接防御中的應用。
全文摘要
本發明提供一種水稻萜烯合成酶蛋白，其為1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸組成的蛋白質，或2)在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中經取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質。本發明還提供編碼該蛋白質的基因。當1-2齡二化螟幼蟲取食水稻時，水稻會上調水稻基因Ostps的表達量，本發明的基因及其產物可以幫助水稻更加吸引二化螟絨繭蜂雌蟲，從而水稻依靠自身的間接防御機制抵抗二化螟的取食。
文檔編號A01H5/00GK102533706SQ20111044482
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者吳孔明, 孫洋, 張永軍, 徐綺霞, 郭予元 申請人:中國農業科學院植物保護研究所