專利名稱：使用微生物生產(chǎn)天冬氨酸族氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用重組微生物生產(chǎn)天冬氨酸族氨基酸、特別是L-賴氨酸及其前體的方法。此外，本發(fā)明還涉及一種重組微生物，以及這種微生物在生產(chǎn)天冬氨酸族氨基酸、特別是L-賴氨酸及其前體中的應(yīng)用，該重組微生物與其初始微生物相比，具有改造的天冬氨酸族氨基酸合成途徑。
背景技術(shù)：
氨基酸和它們的衍生物是制藥行業(yè)中的重要前體，它們被加入至廣泛多種的食物和飼料中作為補(bǔ)充物。幾種氨基酸，如谷氨酸、賴氨酸和蘇氨酸使用它們天然生物合成途徑生產(chǎn)。在天然氨基酸生物合成中，氨基酸天冬氨酸作為生產(chǎn)其它氨基酸，如賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸和甲硫氨酸的前體。具有900，000t/a的世界市場，必需氨基酸L-賴氨酸是最重要的生物技術(shù)發(fā)酵產(chǎn)物之一(Kohl和Tauch，2009)，它主要是作為動物飼料的補(bǔ)充物(Anastassiadis，2007)。向這樣的飼料材料中補(bǔ)充大量的賴氨酸導(dǎo)致如豬或雞的優(yōu)勢生長。過去的幾十年中，白肉消費(fèi)的持續(xù)增長已經(jīng)導(dǎo)致對賴氨酸的需求增加。可以通過例如發(fā)酵方法生產(chǎn)賴氨酸。對于這個目的，已經(jīng)證明一些微生物如谷氨酸棒桿菌(C. glutamicum)是特別合適的。發(fā)酵作為工業(yè)生產(chǎn)氨基酸的技術(shù)隨著分泌谷氨酸細(xì)菌谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)的發(fā)現(xiàn)而出現(xiàn)。在發(fā)現(xiàn)它的幾年間，第一批分泌賴氨酸的谷氨酸棒桿菌突變體用于大量生產(chǎn)(Kinoshita等，1961)。研究工作繼續(xù)朝向新的技術(shù)以建立高效發(fā)酵，包括優(yōu)化發(fā)酵過程、下游加工以及菌株改造。常規(guī)地，菌株通過重復(fù)過程的用UV光或化學(xué)誘變劑進(jìn)行隨機(jī)突變和后續(xù)菌株篩選而制造。在這些過程中，成功的關(guān)鍵是使用有毒的賴氨酸類似物如S-(2-氨乙基)半胱氨酸來選擇反饋抑制菌株(Nakayama和Araki, 1973)。這些常規(guī)菌株代表性地共享天冬氨酸激酶基因中的點(diǎn)突變，這些菌株由于賴氨酸和蘇氨酸的反饋抑制而釋放編碼的酶(Kalinowski等，1991 ;Thierbach等，1990)。通過這些常規(guī)來源的菌株,可以實(shí)現(xiàn)顯著的生產(chǎn)性質(zhì)，如達(dá)到50%的轉(zhuǎn)化率和IOOg I/1的賴氨酸 Cl的滴定度(Leuchtenberger等，
2005)。但是，這代表性地與2-3天的廣泛的發(fā)酵時間相聯(lián)系，限制了生產(chǎn)力。此外，由在菌株生長中積累的不期望突變所產(chǎn)生的營養(yǎng)缺陷型和弱的脅迫耐受度(Ohnishi等，2002)，進(jìn)一步展示了常規(guī)生產(chǎn)菌株的嚴(yán)重劣勢。在近幾年中，重組DNA技術(shù)和分子生物學(xué)開啟了菌株工程的新紀(jì)元一通過代謝工程合理優(yōu)化(Ikeda等，2006)。許多這些研究已經(jīng)聚焦于通過直接改造賴氨酸生物合成途徑的酶而優(yōu)化賴氨酸生物合成的通量。現(xiàn)在，從反饋控制釋放天冬氨酸激酶被認(rèn)為是工業(yè)生產(chǎn)菌的最重要性質(zhì)之一。除了關(guān)于途徑調(diào)節(jié)的改造之夕卜，生物合成途徑的速率決定酶的細(xì)胞內(nèi)活性也是菌株改造的關(guān)鍵點(diǎn)。增加細(xì)胞內(nèi)酶活性的策略包括通過使用更強(qiáng)的啟動子、突變啟動子序列或基因上游調(diào)控區(qū)、或增加編碼基因的拷貝數(shù)而過表達(dá)。在本文中，質(zhì)粒相關(guān)的過表達(dá)適于實(shí)現(xiàn)更高的酶活性和更好的賴氨酸產(chǎn)量(Eggeling，1998)，但幾乎無法在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用。
鑒定除了生物合成途徑本身之外的有益目標(biāo)不久變得對于消除向競爭性生產(chǎn)菌的產(chǎn)生提供前體和輔因子中的瓶頸是必要的。但是，這更加具有挑戰(zhàn)性和難度，因?yàn)樗枰谙到y(tǒng)水平理解生物體。在這點(diǎn)上，谷氨酸棒桿菌基因組序列的可用性成為代謝工程的里程碑(Haberhauer 等，2001 ；Kalinowski 等，2003 ；0hnishi 等，2002 ；Pompejus 等，2002)。它提供了以下基礎(chǔ)(i)通過對常規(guī)產(chǎn)生的生產(chǎn)菌和野生型菌進(jìn)行比較性序列分析而完善基因組(Ohnishi等，2002)，(ii)詳細(xì)的經(jīng)由硅芯片計算機(jī)的谷氨酸棒桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)改造(Kjeldsen和Nielsen, 2009),包括化學(xué)計量模式方法以分析理論生產(chǎn)能力以及涉及的代謝途徑(Kr6mer等，2006 ;Wittmann和Becker，2007)，以及(iii)通過基因組內(nèi)的特定序列基序的方式發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)網(wǎng)(Kohl和Tauch，2009)。但是，作為理解系統(tǒng)的關(guān)鍵特征和菌株設(shè)計的指導(dǎo)，這些模式不能用于預(yù)測體內(nèi)代謝途徑的活性，即通量組。通量分析是 代謝工程的中心要素(St印han0p0Ul0S，1999)，如通過重要過程所顯示的以評估體內(nèi)代謝流(Christensen 和 Nielsen,2000 ；Christensen 等，2000 ；Frick 和 Wittmann, 2005 ；VanDien 等，2006 ；ffittmann, 2007 ；ffittmann 和 Heinzle, 2002)。除了觀察生物系統(tǒng)之外，13C代謝流分析已經(jīng)證明對于菌株表征和用于賴氨酸生產(chǎn)的有益目標(biāo)的鑒定是有用的(Kiefer等,2004 ;Wittmann和Heinzle, 2002)。與從測定活性系列的基因(轉(zhuǎn)錄組)(Hayashi等，
2006)和蛋白(蛋白組)(Bendt等，2003)和從量化細(xì)胞內(nèi)代謝水平(代謝組)(Borner等，
2007)所獲得的補(bǔ)充發(fā)現(xiàn)一起，提供了擴(kuò)展數(shù)據(jù)系列以在全球水平獲得對細(xì)胞生理學(xué)的深度觀察。該系統(tǒng)導(dǎo)向的方法展示了對于代謝工程極好的平臺(Lee等，2005)。在20世紀(jì)50年代日本的大量篩選程序中發(fā)現(xiàn)了主要的生產(chǎn)賴氨酸微生物谷氨酸棒桿菌。使用反復(fù)過程的隨機(jī)突變和篩選改進(jìn)的生產(chǎn)特征對菌株進(jìn)行連續(xù)的賴氨酸生產(chǎn)優(yōu)化。這產(chǎn)生了有效的生產(chǎn)菌，但也導(dǎo)致了引起生長減弱、弱的脅迫耐受性或增加營養(yǎng)需要的副突變的累積。因此，對于谷氨酸棒桿菌，目前獲得的生產(chǎn)性能明顯低于預(yù)測的理論能力。現(xiàn)在，分子生物學(xué)和用于分析細(xì)胞的代謝和調(diào)節(jié)狀態(tài)的系統(tǒng)導(dǎo)向方法的進(jìn)步將菌株改造轉(zhuǎn)變成更加精確和目標(biāo)優(yōu)化的系統(tǒng)代謝工程。這個的目標(biāo)在于具有表現(xiàn)出增加的產(chǎn)量、滴定度和生產(chǎn)力的完整系列的有益修飾的高產(chǎn)菌。在過去，已經(jīng)做過多種嘗試使用微生物增加L-賴氨酸的生產(chǎn)。通過上調(diào)和/或下調(diào)涉及甲硫氨酸或賴氨酸生物合成的基因的表達(dá)來增加如甲硫氨酸或賴氨酸的生產(chǎn)的常規(guī)嘗試在如 W002/10209、W0 2006/008097 和 WO 2005/059093 中描述。之前在谷氨酸棒桿菌中鑒定的中心分解代謝網(wǎng)包括糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑(PPP)、三羧酸(TCA)循環(huán)和乙醛酸支路。WO 03/042389涉及一種遺傳改良的微生物，其中G6H)基因(zwf)已經(jīng)引入至該微生物中，或該微生物中的G6ro基因已經(jīng)改良；還涉及該微生物在制備目標(biāo)化合物如氨基酸(特別優(yōu)選的是賴氨酸)中的應(yīng)用。WO 0220542涉及一種發(fā)酵制備L-氨基酸、特別是L-賴氨酸的方法，其中使用如增強(qiáng)的gap2基因至少部分地排除了減少期望的L-氨基酸形成的代謝途徑。同樣提及了長列表的可以被修飾的其它基因。EP 0435132公開了棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或短桿菌屬(Brevibacterium)的微生物,所述微生物包含重組DNA并適于獲得氨基酸,特別是L-賴氨酸。所述DNA序列特別源自于棒狀桿菌屬或短桿菌屬的生產(chǎn)L-賴氨酸的菌，優(yōu)選地源自于通過谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的突變獲得的突變體，所述谷氨酸棒桿菌ATCC 13032具有減少的天冬氨酸激酶的反饋抑制。EP1067193公開了一種具有增加的pyc(丙酮酸羧化酶)基因的生產(chǎn)L-賴氨酸的短棒桿菌(A)，其中其它基因dapA ( 二氫吡啶二羧酸合酶)、IysC (天冬氨酸激酶)、IysE (賴氨酸輸出物載體)和/或dapB (二氫吡啶二羧酸還原酶)中至少一種被增加，優(yōu)選地過表達(dá)。EP0854189公開了一種含有天冬氨酸激酶的短棒桿菌，其中通過L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制被充分降低，并包含增加的編碼二氫吡啶二羧酸還原酶的DNA序列、增加的編碼二氫吡啶二羧酸合酶的DNA序列、增加的編碼二氨基庚酸脫羧酶的DNA序列和增加的編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的DNA序列。EP0857784涉及一種DNA，所述DNA包含沒有L-賴氨酸等的反饋抑制的天冬氨酸激酶基因并包含二氨基庚二酸脫羧酶基因，并改良了短棒桿菌生產(chǎn)L-賴氨酸的能力。 W0/2007/017526公開了一種使用微生物制備天冬氨酸和衍生氨基酸如賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸或高絲氨酸的方法，所述微生物具有提高的異檸檬酸裂解酶和/或蘋果酸合酶的表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的主要目的是通過合理的菌株改造優(yōu)化賴氨酸生產(chǎn)。作為模型微生物，谷氨酸棒桿菌用在系統(tǒng)導(dǎo)向方法中。由于在工業(yè)賴氨酸生產(chǎn)中，原料成本是主要的生產(chǎn)成本，菌株優(yōu)化的目標(biāo)是增加賴氨酸產(chǎn)率、滴定度和生產(chǎn)力。該主要策略的目標(biāo)是最新水平的技術(shù)以在系統(tǒng)導(dǎo)向水平解決谷氨酸棒桿菌的代謝和調(diào)節(jié)狀態(tài)以及使用獲得的知識以鑒定有助于優(yōu)化生產(chǎn)性能的遺傳目標(biāo)。在谷氨酸棒桿菌中，賴氨酸生物合成與中央代謝通過對碳前體和作為還原力的NADPH的需要而緊密聯(lián)系。由于這個，本研究包括中央合成途徑的反應(yīng)作為菌株優(yōu)化的有希望的目標(biāo)。該策略主要聚焦于NADPH代謝、TCA循環(huán)、草酰乙酸供應(yīng)工程以及賴氨酸生物合成。首先，在賴氨酸生產(chǎn)菌株中通過目標(biāo)評估研究針對提高賴氨酸生產(chǎn)的幾個設(shè)計策略的值。通過比較培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)以及轉(zhuǎn)錄組、代謝組和通量組的水平詳細(xì)地研究了本發(fā)明的菌株，以(i)獲得細(xì)胞生理學(xué)的深度觀察，(ii)評估使用的策略關(guān)于工業(yè)應(yīng)用的益處和(iii)提供對于合理設(shè)計生產(chǎn)菌的有價值的信息。此外，根據(jù)本發(fā)明的微生物中生物合成途徑(特別是NADPH代謝、TCA循環(huán)、草酰乙酸供應(yīng)工程)的改變不僅對L-賴氨酸的生產(chǎn)很重要，對其它天冬氨酸族氨基酸及其前體的生產(chǎn)也很相關(guān)。考慮本文提供的信息，同樣可以生產(chǎn)天冬氨酸來源的氨基酸的其它家族成員，如甲硫氨酸、蘇氨酸或異亮氨酸。從本發(fā)明以下的描述中顯現(xiàn)的這些和其它目標(biāo)將通過在獨(dú)立權(quán)利要求中描述的本發(fā)明得以解決。從屬權(quán)利要求涉及優(yōu)選的實(shí)施方式。問題的解決本發(fā)明特別涉及高產(chǎn)天冬氨酸來源氨基酸的微生物，特別是基于野生型谷氨酸棒桿菌的高產(chǎn)賴氨酸的微生物菌的產(chǎn)生，以及涉及使用所述微生物的方法。這樣的菌株已經(jīng)通過在本工作中鑒定的有益改造而獲得。該特制的細(xì)胞工廠具有高的碳轉(zhuǎn)化率以及高的時空產(chǎn)率、高的最終賴氨酸滴定度、好的生長行為以及優(yōu)選地副產(chǎn)物形成減少。這些生產(chǎn)特性保證了提供的底物快速及有效的轉(zhuǎn)化并因此劃算地生產(chǎn)賴氨酸。此外，使用遺傳改造的微生物、優(yōu)選地棒狀桿菌屬、更優(yōu)選地谷氨酸棒桿菌改善天冬氨酸來源的氨基酸、特別是L-賴氨酸的生產(chǎn)。在生產(chǎn)天冬氨酸來源的氨基酸、更優(yōu)選地生產(chǎn)L-賴氨酸的優(yōu)選方法中，使用具有如改造的賴氨酸生物合成和改造的賴氨酸前體供給的微生物。優(yōu)選地，所述微生物是重組微生物。在一種特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述微生物可能具有改造的如增加的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因和酶活性。更優(yōu)選地，所述改造的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因(zwf)包括改造的啟動子，優(yōu)選地zwf基因的野生型啟動子由異源的(即非天然)啟動子(更優(yōu)選地，超氧化物歧化酶(sod)的啟動子)取代。所述非天然的啟動子可以源自相同的生物體，但來自另一種基因或其它種類。更優(yōu)選地，所述微生物還包括zwf基因中的點(diǎn)突變A243T。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述微生物包括改造的tkt操縱子，其中，tkt操縱子的野生型啟動子由異源啟動子取代，優(yōu)選地由sod啟動子取代，同樣導(dǎo)致葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因和酶的活性分別增加。使用強(qiáng)的sod啟動子，所述zwf基因同樣可以通過過表達(dá)tkt操 縱子而過表達(dá)，所述tkt操縱子其中包括轉(zhuǎn)酮醇酶基因(tkt)、編碼轉(zhuǎn)醛醇酶的基因(tal)和 ZWfo在另一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述微生物進(jìn)一步還具有增加的果糖-1，6- 二磷酸酶基因和酶(fbp)的活性。這個目標(biāo)通過一種微生物實(shí)現(xiàn)，所述微生物除了上述的改造，還包括用強(qiáng)的異源啟動子(如所述SOd啟動子或優(yōu)選的eftu啟動子)取代初始啟動子。同樣優(yōu)選地，所述微生物進(jìn)一步包括削弱的異檸檬酸脫氫酶基因(icd)和相應(yīng)減少的酶活性，優(yōu)選地，通過用GTG起始密碼子取代初始ATG起始密碼子實(shí)現(xiàn)。在另一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述微生物進(jìn)一步具有增加的二氨基庚二酸脫氫酶基因和酶活性。這可以通過過表達(dá)編碼二氨基庚二酸脫氫酶的相對基因(ddh)而實(shí)現(xiàn)。更優(yōu)選地，由包括至少一個額外拷貝的ddh基因的微生物過表達(dá)二氨基庚二酸脫氫酶。此外，特別優(yōu)選的是，除了上述的改造，所述微生物包括具有增加的基因和酶活性的改造的天冬氨酸激酶(IysC)，優(yōu)選地通過氨基酸交換T311I改造。優(yōu)選的實(shí)施方式涉及包括除上述改造以外的至少一種以下改造的微生物(i)過表達(dá)二氫吡啶二羧酸還原酶(dapB)、二氨基庚二酸脫羧酶(IysA) ；(ii)通過引入包括氨基酸交換V59A的突變變異體的高絲氨酸脫氫酶的改造；(iii)丙酮酸羧化酶的過表達(dá)和改造，以及(iv) PEP羧化激酶的缺失。[優(yōu)選地在本發(fā)明方法中使用的微生物是谷氨酸棒桿菌，優(yōu)選地是谷氨酸棒桿菌ATCC13032的衍生物，更優(yōu)選地是根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2010年5月11日保藏在德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)的保藏號是DSM23586的微生物。]本發(fā)明有益效果根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明微生物適于用在生產(chǎn)天冬氨酸來源的氨基酸(優(yōu)選地，L-賴氨酸)的方法中。本發(fā)明更優(yōu)選的方面可以來自于下面詳細(xì)的說明和實(shí)施例。用于生產(chǎn)方法中的細(xì)胞可以是原核細(xì)胞、較低等的真核生物、分離的植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、分離的昆蟲細(xì)胞或分離的哺乳動物細(xì)胞，特別是細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“微生物”用作所述種類的細(xì)胞。用于實(shí)施本發(fā)明的一種優(yōu)選類型的微生物是棒狀桿菌屬，特別優(yōu)選的是谷氨酸棒桿菌。


圖I :例示的通過部分刪除開放閱讀框(ORF)序列的基因缺失的插入物-構(gòu)建體的PCR策略。使用位點(diǎn)特異引物(如被指定為P1、P2、P3和P4的引物)在三步PCR步驟中將兩段分離的DNA片段融合。圖2 :具有選擇標(biāo)記物KanK和sacB、大腸桿菌ORI和多克隆位點(diǎn)的整合轉(zhuǎn)化載體pCliko圖3 :谷氨酸棒桿菌BSl (實(shí)心菱形)、谷氨酸棒桿菌BS87 (實(shí)心圓形)和谷氨酸棒桿菌BS205(空心圓形)的光密度(0D_，Libra Sll)和細(xì)胞干重之間的相互關(guān)系，每種菌株以三份生物學(xué)復(fù)制品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖4:谷氨酸棒桿菌BSl(lysCT3111)在以葡萄糖作為單一碳源的基本培養(yǎng)基中生長的培養(yǎng)概圖(A)和生長和生產(chǎn)特性(B)。生物量和賴氨酸形成和葡萄糖消耗之間的線性關(guān)系分別顯示了代謝穩(wěn)定狀態(tài)。圖5 :谷氨酸棒桿菌BS13基于[I-13C]葡萄糖(A)和[U-13C]葡萄糖與天然標(biāo)記的葡萄糖的等摩爾混合物(B)生長的同位素穩(wěn)定狀態(tài)的確認(rèn)。在培養(yǎng)過程中在不同細(xì)胞干重(CDM)濃度下測量氨基酸的標(biāo)記模式。這里顯示的氨基酸代表性地來自于代謝網(wǎng)的不同部分，并包括丙氨酸(實(shí)心方形)、苯丙氨酸(空心方形)、纈氨酸(實(shí)心圓形)、甘氨酸(空心圓形)、谷氨酸(實(shí)心三角形)、蘇氨酸(空心三角形)和絲氨酸(實(shí)心菱形)。MO (未標(biāo)記的)、M1 (單一標(biāo)記的)和M2 (雙標(biāo)記的)表示相應(yīng)的質(zhì)量同位素異構(gòu)體的相對分?jǐn)?shù)。圖6:用[U-13C]葡萄糖與天然標(biāo)記的葡萄糖的等摩爾混合物對谷氨酸棒桿菌的丙酮酸節(jié)點(diǎn)處的通量參數(shù)量化的實(shí)驗(yàn)設(shè)計。天冬氨酸(m/z 418)的質(zhì)量同位素異構(gòu)體分布的相對變化對應(yīng)變化的OPEPC、纈氨酸(m/z 288)的質(zhì)量同位素異構(gòu)體分布的相對變化對應(yīng)變化的(PEPC/PEPCK、丙氨酸(m/z 260)的質(zhì)量同位素異構(gòu)體分布的相對變化對應(yīng)變化的^PC/MalE。圖7 :在基于99% [I-13C]葡萄糖和50% [U-13C]葡萄糖培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌BSl過程中，細(xì)胞蛋白的氨基酸和分泌的海藻糖的實(shí)驗(yàn)測量的和模擬的質(zhì)量同位素異構(gòu)體分?jǐn)?shù)的相關(guān)性。所述數(shù)據(jù)包括實(shí)驗(yàn)的GC-MS數(shù)據(jù)和通過相對于優(yōu)化系列通量的數(shù)學(xué)模型方案所預(yù)測的值。圖8 :在基于葡萄糖生長過程中，生產(chǎn)賴氨酸的谷氨酸棒桿菌BSl的丙酮酸節(jié)點(diǎn)處的碳通量分布。以葡萄糖比吸收速率的摩爾百分比給出所有通量，所述葡萄糖比吸收速率為qGlc = 4. 6mmol g^tT1,這被設(shè)為100%。誤差反映了通過Monte-Carlo分析獲得的不同通量的相對90 %置信區(qū)間。圖9 :谷氨酸棒桿菌BS87和6個突變體的天然細(xì)胞提取物中異檸檬酸脫氫酶(ICD)、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(PGI)、丙酮酸脫氫酶(TOH)和葡萄糖6-磷酸脫氫酶(G6TOH)的比活性，所述6個突變體來自第二次重組事件，作為核苷酸交換的可能候選物。數(shù)據(jù)代表在復(fù)雜培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞的單一測量值。圖10 :谷氨酸棒桿菌 ATCC 13032,BSl (IysC13111)、BS5 (PsodZwf)和 BS6 (PsodzwfA243T)的G6P脫氫酶的體外比活性(A);通過添加NADPH作為抑制劑的野生型和A243T突變體的體外比活性[% ] (B)。所述數(shù)據(jù)表示來自細(xì)胞提取物的三次不同測量值的平均值和相對偏差，所述細(xì)胞提取物來自以葡萄糖作為碳源的基本培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞。圖11:基于[I-13C]葡萄糖培養(yǎng)的谷氨酸棒桿菌BS1、谷氨酸棒桿菌BS5、谷氨酸棒桿菌BS6和谷氨酸棒桿菌BS7的細(xì)胞內(nèi)通量和相對的90%置信區(qū)間(從上到下)。以統(tǒng)一成葡萄糖吸收速率的相對值)給出這些數(shù)據(jù)(表15)。參考菌株谷氨酸棒桿菌BSl的通量數(shù)據(jù)取自(Becker等，2005)。圖12 :響應(yīng)通過超氧化物歧化酶(sod)啟動子的tkt操縱子的過表達(dá)的葡萄糖6-磷酸脫氫酶(A)、轉(zhuǎn)醛醇酶(B)和轉(zhuǎn)酮醇酶(C)的比活性。圖13 :分別基于葡萄糖和果糖生長的谷氨酸棒桿菌WT、谷氨酸棒桿菌BSl (IysC13111)和谷氨酸棒桿菌BS6(PS()dZWfA243T)的天然細(xì)胞提取物中的蘋果酸酶比活性。一式三份進(jìn)行測量并給出相對偏差。 圖14:在基于葡萄糖的分批培養(yǎng)過程中，不同的生產(chǎn)賴氨酸菌株谷氨酸棒桿菌的生產(chǎn)特性。分別以生物量或賴氨酸形成和整個培養(yǎng)時間過程中底物消耗之間的線性最好適合的斜度測量為產(chǎn)率。從三個生物復(fù)制品中測量產(chǎn)率。圖15 :考慮PPP、異檸檬酸脫氫酶和蘋果酸酶作為NADPH供給反應(yīng)、生物量形成和賴氨酸分泌作為NADPH消耗反應(yīng)，從體內(nèi)通量計算的谷氨酸棒桿菌BSl (IysC13111)的NADPH平衡。圖16 :谷氨酸棒桿菌ATCC 13032 (三角形)、谷氨酸棒桿菌BSl (IysC13111)(方形)和谷氨酸棒桿菌BS6 (PsmlZWfA243T)(圓形)中NADPH/NADP比例和蘋果酸酶比活性之間的關(guān)系。圖17:在使用葡萄糖作為單一碳源的標(biāo)準(zhǔn)基本培養(yǎng)基中生長的谷氨酸棒桿菌BSl (斑紋柱)和谷氨酸棒桿菌BS222(灰色柱)的天然細(xì)胞提取物中二氨基庚二酸脫氫酶的比活性。圖18 :不同硫酸銨濃度下的谷氨酸棒桿菌BSl(lySCT3111)的比生長速率。圖19 :在具有不同的硫酸銨濃度的基本培養(yǎng)基中生長的谷氨酸棒桿菌BS222的賴
氨酸產(chǎn)率。圖20:分別在2g L—1和15g L—1硫酸銨時，谷氨酸棒桿菌BSl和谷氨酸棒桿菌BS222
的二氨基庚二酸脫氫酶的比活性。圖21 :生產(chǎn)賴氨酸的谷氨酸棒桿菌BSl (A、B)和它的pyk缺失衍生物BS13(C、D)在基于葡萄糖的分批培養(yǎng)中的定量生理學(xué)特性。生長、賴氨酸生產(chǎn)和二羥基丙酮(DHA)和葡萄糖消耗之間的線性關(guān)系顯示培養(yǎng)中的代謝穩(wěn)定狀態(tài)。圖22 :生產(chǎn)賴氨酸的谷氨酸棒桿菌BSl (上面)和它的丙酮酸激酶缺乏衍生物谷氨酸棒桿菌BS13(下面)在基于葡萄糖生長過程中，中心代謝中的體內(nèi)碳通量分布。以平均葡萄糖比吸收速率(對于BSl, qGlc = 4. 6mmol g—V1 ;對于BS13,是4. 5mmol g—V1 ;該吸收速率被設(shè)為100% )的摩爾百分比給出所有通量。對于可逆的代謝反應(yīng)，另外地在括號中給出通量可逆性并且通過箭頭指示凈通量的方向。

圖23 :生產(chǎn)賴氨酸的谷氨酸棒桿菌BSl (A)和它的丙酮酸激酶缺乏衍生物谷氨酸棒桿菌BS13(B)在基于葡萄糖培養(yǎng)時，在丙酮酸節(jié)點(diǎn)處的碳凈通量分布。實(shí)際的通量值通過相關(guān)箭頭的厚度表不。圖24 :谷氨酸棒桿菌BSl (左)和它的丙酮酸激酶缺乏衍生物谷氨酸棒桿菌BS13(右)的NADPH平衡。圖25 :從母本菌株谷氨酸棒桿菌BS87、來自第二次重組事件具有減少的TOH比活性的兩種突變體和用于菌株構(gòu)建的轉(zhuǎn)化載體的序列比對提取的起始密碼子區(qū)域。圖26 :基于葡萄糖生長的谷氨酸棒桿菌BS87(斑紋柱)和它的aceEatt衍生物谷氨酸棒桿菌BS238(白色柱)中丙酮酸脫氫酶的酶比活性。灰色柱表示在系列分批培養(yǎng)中永久生長50代后起始密碼子突變體的酶比活性。一式三份測定所述值并通過誤差棒反映相對偏差。圖27 :在基本培養(yǎng)基中測定的來自三個生物復(fù)制品的谷氨酸棒桿菌BS87(斑紋柱)和谷氨酸棒桿菌BS238(灰色柱)的賴氨酸產(chǎn)率和生物量產(chǎn)率。給出相對偏差。以產(chǎn) 物形成和底物消耗之間的線性最佳適合的斜度測量為產(chǎn)率。圖28 :谷氨酸棒桿菌BS87的icd基因、用于icd基因的起始密碼子交換的轉(zhuǎn)化載體和來自第二次重組事件的4個克隆的起始密碼子區(qū)的比對。圖29 :以葡萄糖作為單一碳源的基本培養(yǎng)基中生長的谷氨酸棒桿菌BS87(斑紋柱)和谷氨酸棒桿菌BS205(icdatt)(白色柱)的天然細(xì)胞提取物中異檸檬酸脫氫酶的比活性。灰色柱表示在系列分批培養(yǎng)中生長50代后起始密碼子突變體的ICD比活性。數(shù)據(jù)代表來自三次平行實(shí)驗(yàn)的平均值和相對偏差。圖30 :在基于葡萄糖的分批培養(yǎng)過程中，生產(chǎn)賴氨酸的谷氨酸棒桿菌BS87(A、B)和谷氨酸棒桿菌BS205(icdatt) (C、D)的生長和生產(chǎn)特性。生物量和賴氨酸生產(chǎn)與葡萄糖消耗之間的線性關(guān)系分別顯示培養(yǎng)過程中的代謝穩(wěn)定狀態(tài)。給出的數(shù)據(jù)表示來自三個生物復(fù)制品的值。圖31 :基于葡萄糖生長的谷氨酸棒桿菌BS87和谷氨酸棒桿菌BS205 (Icdatt)的通過TCA循環(huán)a和丙酮酸羧化酶b的體內(nèi)通量。所述誤差反映了通過Monte-Carlo分析獲得的90%置信區(qū)間。a作為通過檸檬酸合酶的進(jìn)入通量給出。b作為通過合成代謝羧化作用的集總的凈通量給出。圖32:通過途徑改造的特制賴氨酸高產(chǎn)菌株的設(shè)計和構(gòu)造。改造包括IysC13111 (I)、2 X ddh (2)、A pck (3)、PsoddapB (4)、2 X IysA (5)、PsodIysC13111 (6)、homV59A(7)、pycP458S (8)、PsodpycP458S (9)、icdatt (10)、Pe伽fbp (11)和 Psodtkt (12)，它們可以連續(xù)地被實(shí)現(xiàn)以構(gòu)建菌株谷氨酸棒桿菌BSl (空心菱形)、谷氨酸棒桿菌BS222 (實(shí)心菱形)、谷氨酸棒桿菌BS87 (實(shí)心方形)、谷氨酸棒桿菌205 (空心方形)、谷氨酸棒桿菌BS242 (實(shí)心圓形)和谷氨酸棒桿菌244 (空心圓形)。圖33:在裝有包含15gL_i硫酸銨和葡萄糖作為單一碳源的基本培養(yǎng)基的搖瓶中檢測基于野生型種系的賴氨酸生產(chǎn)者的賴氨酸產(chǎn)率。數(shù)據(jù)代表來自三個生物學(xué)復(fù)制品的平均值和相對偏差。展示的菌株是谷氨酸棒桿菌WT(ATCC13032)、谷氨酸棒桿菌BSl(lysCT3111)(I)、谷氨酸棒桿菌BS222 (ddh) (2)、谷氨酸棒桿菌BS87 (9)、谷氨酸棒桿菌BS205 (Icdatt)
(10)、谷氨酸棒桿菌 BS242(Peftufbp) (11)和谷氨酸棒桿菌 BS244(PS()dtkt) (12)。圖34 :在基于糖蜜的復(fù)雜培養(yǎng)基的分批補(bǔ)料式發(fā)酵過程中，生產(chǎn)賴氨酸的谷氨酸棒桿菌BS244的培養(yǎng)概圖。分別以葡萄糖、果糖和蔗糖的集總濃度給出糖濃度。圖35 :在分批補(bǔ)料式發(fā)酵過程中谷氨酸棒桿菌BS244的兩相賴氨酸生產(chǎn)特性。相對總的糖消耗繪制總的賴氨酸生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式谷氨酸棒桿菌的酶和基因與本工作相關(guān)的谷氨酸棒桿菌的酶和基因在表I中列出，并列出根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫的對應(yīng)的EC號和基因系統(tǒng)名稱。表I

權(quán)利要求
1.一種使用微生物生產(chǎn)天冬氨酸來源氨基酸、優(yōu)選地賴氨酸的方法，與初始微生物相t匕，所述微生物包括至少以下特性 (a)增加的葡萄糖6-磷酸脫氫酶活性； (b)增加的果糖1，6_二磷酸酶活性； (C)減弱的異檸檬酸脫氫酶活性； (d)增加的二氨基庚二酸脫氫酶活性；以及 (e)增加的天冬氨酸激酶活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述微生物是重組微生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于， (a)增加的葡萄糖6-磷酸脫氫酶活性歸因于(i)zwf基因的過表達(dá)，優(yōu)選地基于用異源啟動子取代zwf基因的天然啟動子和/或(ii)氨基酸殘基交換A243T，或(iii)用異源啟動子取代tkt操縱子的天然啟動子； (b)增加的果糖1，6_二磷酸酶活性歸因于fbp基因的過表達(dá)，優(yōu)選地基于用異源啟動子取代天然啟動子； (c)減弱的異檸檬酸脫氫酶活性基于用不同的起始密碼子取代icd基因的天然起始密碼子； (d)增加的二氨基庚二酸脫氫酶活性是基于ddh基因的過表達(dá)，優(yōu)選地通過基因增加實(shí)現(xiàn)過表達(dá)； (e)增加的天冬氨酸激酶活性是基于IysC基因的過表達(dá)，優(yōu)選地通過導(dǎo)致氨基酸交換T311I的IysC基因的改造實(shí)現(xiàn)過表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，在特性(a)和/或(b)中的所述異源啟動子選自超氧化物歧化酶(sod)啟動子或伸長因子tu(eftu)啟動子。
5.根據(jù)任何一項前述權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述重組微生物進(jìn)一步包括至少一種以下改造 (f)二氫吡啶二羧酸還原酶的過表達(dá)； (g)二氨基庚二酸脫羧酶的過表達(dá)； (h)丙酮酸羧化酶的過表達(dá)和突變； (i)PEP羧化激酶的缺失；和 (j)高絲氨酸脫氫酶的突變。
6.根據(jù)任何一項前述權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述微生物已經(jīng)作為DSM23586保藏在DSMZ，或其衍生物。
7.根據(jù)任何一項前述權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述重組微生物是改造的棒狀桿菌，優(yōu)選地是改造的谷氨酸棒桿菌。
8.根據(jù)任何一項前述權(quán)利要求所述的方法，進(jìn)一步包括收獲和純化天冬氨酸來源的氨基酸，優(yōu)選地賴氨酸的步驟。
9.一種具有以下特性的重組微生物 (a)增加的葡萄糖6-磷酸脫氫酶活性； (b)增加的果糖1，6_二磷酸酶活性；(C)減弱的異檸檬酸脫氫酶活性；(d)增加的二氨基庚二酸脫氫酶活性；以及 (e)增加的天冬氨酸激酶活性。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組微生物，其特征在于， (a)增加的葡萄糖6-磷酸脫氫酶活性歸因于(i)zwf基因的過表達(dá)，優(yōu)選地基于用異源啟動子取代zwf基因的天然啟動子和/或(ii)氨基酸殘基交換A243T，或(iii)用異源啟動子取代tkt操縱子的天然啟動子； (b)增加的果糖1，6_二磷酸酶活性歸因于fbp基因的過表達(dá)，優(yōu)選地基于用異源啟動子取代天然啟動子； (c)減弱的異檸檬酸脫氫酶活性基于用不同的起始密碼子取代icd基因的天然起始密碼子； (d)增加的二氨基庚二酸脫氫酶活性是基于ddh基因的過表達(dá)，優(yōu)選地通過基因增加實(shí)現(xiàn)過表達(dá)； (e)增加的天冬氨酸激酶活性是基于IysC基因的過表達(dá)，優(yōu)選地通過導(dǎo)致氨基酸交換T311I的IysC基因的改造實(shí)現(xiàn)過表達(dá)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10任何一項所述的微生物，其特征在于，所述異源啟動子選自超氧化物歧化酶(sod)啟動子或伸長因子tu(eftu)啟動子。
12.根據(jù)權(quán)利要求9-11任何一項所述的微生物，進(jìn)一步包括至少一種以下改造 (f)二氫吡啶二羧酸還原酶的過表達(dá)； (g)二氨基庚二酸脫羧酶的過表達(dá)； (h)丙酮酸羧化酶的過表達(dá)和突變； (i)PEP羧化激酶的缺失；和 (j)高絲氨酸脫氫酶的突變。
13.根據(jù)權(quán)利要求9-12任何一項所述的微生物，其特征在于，所述重組微生物是改造的棒狀桿菌，優(yōu)選地是改造的谷氨酸棒桿菌。
14.根據(jù)權(quán)利要求9-13任何一項所述的微生物，已經(jīng)作為DSM23586保藏在DSMZ，或其衍生物。
15.在權(quán)利要求9-14任何一項中所定義的微生物在生產(chǎn)天冬氨酸來源的氨基酸的方法中的應(yīng)用，優(yōu)選地在L-賴氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用重組微生物生產(chǎn)源自天冬氨酸的氨基酸及其前體、特別是生產(chǎn)L-賴氨酸的方法。此外，本發(fā)明涉及一種重組微生物，以及這種微生物在生產(chǎn)所述氨基酸及其前體和衍生物中的應(yīng)用，特別是在L-賴氨酸的合成中的應(yīng)用；該重組微生物與初始微生物相比，具有改善的天冬氨酸來源的氨基酸合成活性。
文檔編號C12N15/63GK102753692SQ201080062068
公開日2012年10月24日 申請日期2010年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月15日
發(fā)明者C·維特曼, J·貝克爾 申請人:白光產(chǎn)業(yè)株式會社