專利名稱：酶法合成5-羥基色氨酸的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術生產氨基酸的技術領域，涉及通過色氨酸酶催化5-羥基吲哚和L-半胱氨酸合成L-5-羥基色氨酸的方法。
背景技術：
5-羥基色氨酸(又名L-5-羥基色氨酸，簡稱5-HTP)是ー種天然芳香族氨基酸，是人體內重要的神經遞質5-羥色胺的前體，5-羥色胺是腦部分泌的一種荷爾蒙，會影響我們的情緒、睡眠和食欲，造成腦中的血清素不平衡時需5-HTP來維持身體處于正常狀態?，F代醫學已經證明5-HTP具有多種明顯的藥理作用，包括控制情緒、減少焦慮、治療抑郁癥；改善睡眠；減弱食欲，治療肥胖；治療纖維性肌痛綜合征；緩解慢行頭痛等癥狀。5-HTP已在醫 藥和保健食品行業得到了廣泛的應用。在歐美5-HTP已成為最重要的抗抑郁補劑和非處方藥物。目前，5-HTP生產方法主要包括(I)提取法，是從豆科植物如加納籽(專利CN101648900)中提取。該エ藝是目前5-HTP生產的主流エ藝，條件穩定，產品純度高。但是，原料加納籽的產量和采收期決定了該エ藝的生產成本，而且近年來隨著非洲地區原料采收成本的逐年走高，導致5-HTP的價格居高不下。(2)化學合成法，是以色氨酸和羥基こ酸為原料，在高壓反應釜中進行化學羥化反應得到多羥基色氨酸，然后在催化劑色氨酸酶的作用下，在堿性條件下水解最終得到5-HTP。該エ藝反應復雜、反應條件嚴格、能耗巨大，且產物5-HTP的產量不穩定，因此一直未能擴大生產。(3)生物轉化法，是以微生物細胞或從生物體中提取的酶作為生物催化劑，利用酶的專ー性制備5-HTP，具有反應條件溫和、反應速度快和專ー性強等優點。傳統的酶法是以色氨酸羥化酶作為催化劑，以色氨酸為底物，特異性地生成5-HTP。國內外已有報道對動物體內色氨酸羥化酶基因克隆并測定DNA序列和蛋白序列。繼而，在CDNA文庫中篩選相應的基因序列并利用成熟的質粒轉化方法將該基因導入工程菌株進行大規模發酵生產，將體外獲得的色氨酸羥化酶用于5-HTP生產。國內專利CN101864466利用已有報道的家兔Oryctolagus cuniculus色氨酸輕化酶基因構建重組表達載體,通過質粒轉化BL21獲得エ程菌株，利用該菌株進ー步發酵，在發酵成熟期添加底物色氨酸獲得終產物5-HTP。色氨酸酶,也稱色氨酸卩引哚裂和酶(tryptophanase, EC4. I. 99. I),是由含有ー個磷酸吡哆醛結合位點的相同亞基組成的四聚體，該四聚體在NH4+、K+或Rb+存在下具有催化活性，但活性受Na+和Li+抑制。該酶在微生物中特別是大腸桿菌中有大量存在，主要催化色氨酸厭氧分解產生吲哚、丙酮酸和氨，對半胱氨酸和絲氨酸已有一定作用。中國專利(申請號CN201010031351. 0)采用重組枯草芽孢桿菌高效表達色氨酸酶，用于酶法拆分DL-半胱氨酸制備D-胱氨酸和L-色氨酸。目前，還未見該酶用于制備5-HTP的報道。

發明內容
本發明的目的是提供ー種新的酶法合成5-羥基色氨酸(5-HTP)的方法，該方法以色氨酸酶為催化劑，以5-羥基吲哚和L-半胱氨酸為底物，エ藝簡単、環保無污染。本發明提供的酶法合成5-羥基色氨酸(5-HTP)的方法包括以表達色氨酸酶的大腸桿菌基因工程重組菌BL21 (DE3)-pET21a(+)-tnaA的發酵菌體細胞或裂解液或枯草芽孢桿菌基因工程重組菌WB600-pWB980-tnaA的發酵液為酶源，以5-羥基吲哚和L-半胱氨酸為底物，酶促反應液中，底物5-羥基吲哚的加入量為5至20g/L，L-半胱氨酸的加入量為6至24g/L，酶源的添加量為2000至8000U/L，在40至60°C下，pH7至9，經酶法轉化反應3至12h，生產5-HTP。酶促反應液中還包括輔酶磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的加入量為0. 005至 0.02g/L。底物5-羥基吲哚的用量優選為15g/L，底物L-半胱氨酸的用量優選為18g/L，酶源的添加量優選為6000U/L，磷酸吡哆醛的用量優選為0. 015g/L，優選轉化溫度為45°C，優選轉化PH8，優選轉化時間12h。所述的表達色氨酸酶的枯草芽孢桿菌基因工程重組菌WB600-pWB980-tnaA來自專利 CN201010011351. O。在本發明實施例中，采用高效液相色譜法來測定5-HTP的含量，具體方法如下高效液相色譜采用Agilent Z0RBASB-C18柱(250X4. 6mm, 5 u m)對5-HTP的含量進行測定，該液相條件為流動相A相為ImM/L磷酸ニ氫鉀水溶液，B相為100%甲醇，O-IOmin時20%B-40%B, 10-20min 時 40%B_20%B，23min 時停止；進樣量 IOy I ;總流速為 I. OmL/min ;檢測波長225nm;柱溫為25で。本發明的優點和有益效果本發明創新性地以5-羥基吲哚和L-半胱氨酸為底物，利用高效表達色氨酸酶的大腸桿菌基因工程菌的發酵菌體細胞/裂解液或枯草芽孢桿菌基因工程菌的發酵液為酶源，生產5-HTP，具有條件溫和、周期短、酶促體系中雜質少、產物分離提取方便、エ藝步驟簡單、操作安全等優點，為5-HTP的緑色生產提供了ー種新方法。


圖I是反應機理；圖2是5-HTP標準曲線；A :標準品5-HTP色譜圖；B 5-HTP定量分析標準曲線；圖3是催化條件的優化；A :反應溫度與轉化率的關系；B pH與轉化率的關系；C :反應時間與轉化率的關系；D :底物5-羥基吲哚與轉化率的關系；E :L-半胱氨酸與轉化率的關系；F:固定化酶與轉化率的關系；G :磷酸吡哆醛與轉化率的關系；圖4是反應液中5-HTP和5-羥基吲哚的HPLC檢測。
具體實施例方式實施例I枯草芽孢桿菌基因工程菌表達色氨酸酶的制備色氨酸酶基因工程菌株的發酵參見中國專利(申請號CN201010011351.0)。
下罐發酵液4°C下3，OOOrpm離心15min去除，得到表達色氨酸酶的上清液，測定酶活力為550U/mL。實施例2大腸桿菌基因工程菌表達色氨酸酶的制備根據NCBI數據庫收錄的E. coli K12的色氨酸酶基因序列(序列號NP418164)，設計上游引物tnaAl :5，-CCG GM TTC ATG GMAAC TTT AAA CAT CTC C_3，(SEQ ID No. 1)，下游引物 tnaA2 :5，_CCC AAG CTT TTA AAC TTC TTT CAG TTT TGC GG_3，(SEQ ID No. 2)。提取E. coli JM109菌株的基因組DNA，PCR擴增色氨酸酶基因。采用基因工程方法，構建重組表達質粒pET_21a(+)_tnaA。將重組表達載體pET_21a(+)_tnaA轉化至E. coli BL21 (DE3),獲得基因工程菌株 BL21 (DE3) -pET21a (+) -tnaA。將陽性重組菌株接種于4mL含有氨芐青霉素100 U g/mL的LB培養基中過夜培養，隨后以1%轉接量接入IOOmL含有氨芐青霉素100 u g/mL的新鮮LB培養基中，37°C振蕩培養3h，然后，加入終濃度為ImM的IPTG誘導液，特異性誘導色氨酸酶的表達。 所得培養液于4°C下6，OOOrpm離心lOmin，收集菌體，獲得表達色氨酸酶的基因エ程重組菌，用50mmol/L的磷酸緩沖液(pH8. 0)懸浮洗滌后再離心，收集發酵菌體作為酶源，測定酶活力為1000U/g。將發酵菌體進行超聲波破碎，獲得色氨酸酶的粗酶液，測定酶活力為200U/mL。實施例3HPLC法測定5-HTP高效液相色譜采用Agilent ZORBA SB-C18 柱(250 X 4. 6mm, 5 y m)對 5-HTP 的含量進行測定，該液相條件為流動相A相為ImM/L磷酸ニ氫鉀水溶液，B相為100%甲醇，O-IOmin 時 20%B-40%B, 10_20min 時 40%B-20%B, 23min 時停止；進樣量 10 y I ;總流速為
I.OmL/min ;檢測波長225nm ;柱溫為25°C。精確配制系列濃度的5-HTP標準液，連續進樣5次，計算峰面積并取平均值，以5-HTP濃度(X，mmol/L)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線。酶促反應所產生的5-HTP經適當稀釋后以HPLC測定，依據標準曲線進行精確定量，如圖2。實施例4考察色氨酸酶法合成5-HTP中，反應溫度與5_羥基吲哚的轉化率的關系以上述實施例I或實施例2中制備的色氨酸酶為催化劑，分別在每升的轉化體系中，加入酶量5000U/L，底物5-羥基吲哚5g/L，L-半胱氨酸用量6g/L，輔酶磷酸吡哆醛0. 005g/L，轉化pH值為8，轉化時間6h?？疾燹D化溫度40-60°C時對5-羥基吲哚轉化率的影響，采用實施例2中的方法檢測5-HTP的含量。結果如圖3A所示。實施例5考察色氨酸酶法合成5-HTP中，反應pH值與5_羥基吲哚的轉化率的關系以上述實施例I或實施例2中制備的色氨酸酶為催化劑，分別在每升的轉化體系中，加入酶量5000U/L，底物5-羥基吲哚5g/L，L-半胱氨酸用量6g/L，輔酶磷酸吡哆醛0. 005g/L,轉化溫度為45°C，轉化時間6h?？疾燹D化pH值7-9時對5-羥基吲哚轉化率的影響，采用實施例2中的方法檢測5-HTP的含量。結果如圖3B所示。實施例6考察色氨酸酶法合成5-HTP中，反應時間與5_羥基吲哚的轉化率的關系以上述實施例I或實施例2中制備的色氨酸酶為催化劑，分別在每升的轉化體系中，加入酶量5000U/L，底物5-羥基吲哚5g/L，L-半胱氨酸用量6g/L，輔酶磷酸吡哆醛0. 005g/L,轉化溫度為45°C，轉化pH值為8。考察轉化時間3_12h時對5-羥基吲哚轉化率的影響，采用實施例2中的方法檢測5-HTP的含量。結果如圖3C所示。實施例7考察色氨酸酶法合成5-HTP中，底物5_羥基吲哚的投入量與5_羥基吲哚的轉化率的關系以上述實施例I或實施例2中制備的色氨酸酶為催化劑，分別在每升的轉化體系中，加入酶量5000U/L，L-半胱氨酸用量24g/L，輔酶磷酸吡哆醛0. 005g/L，轉化溫度為450C，轉化pH值為8，轉化時間12h?？疾斓孜?-羥基吲哚的投入量為5-20g/L時對5-羥基吲哚轉化率的影響，采用實施例2中的方法檢測5-HTP的含量。結果如圖3D所示。實施例8考察色氨酸酶法合成5-HTP中，L-半胱氨酸的投入量與5_羥基吲哚的轉化率的關系以上述實施例I或實施例2中制備的色氨酸酶為催化劑，分別在每升的轉化體系中，加入酶量5000U/L，5-羥基吲哚用量15g/L，輔酶磷酸吡哆醛0. 005g/L，轉化溫度為 45°C，轉化pH值為8，轉化時間12h?？疾霯-半胱氨酸的投入量為6-24g/L時對5-羥基吲哚轉化率的影響，采用實施例2中的方法檢測5-HTP的含量。結果如圖3E所示。實施例9考察色氨酸酶法合成5-HTP中，酶量與5_羥基吲哚的轉化率的關系以上述實施例I或實施例2中制備的色氨酸酶為催化劑，分別在每升的轉化體系中，5-羥基吲哚用量20g/L，L-半胱氨酸用量為24g/L，輔酶磷酸吡哆醛0. 02g/L，轉化溫度為45°C，轉化pH值為8，轉化時間12h。考察酶量為2000-8000U/L時對5-羥基吲哚轉化率的影響，采用實施例2中的方法檢測5-HTP的含量。結果如圖3F所示。實施例10考察色氨酸酶法合成5-HTP中，磷酸吡哆醛的濃度與5-羥基吲哚的轉化率的關系以上述實施例I或實施例2中制備的色氨酸酶為催化劑，分別在每升的轉化體系中，加入酶量8000U/L，底物5-羥基吲哚20g/L，L-半胱氨酸用量24g/L，轉化溫度為45°C，轉化PH值為8，轉化時間12h?？疾炝姿徇炼呷┑臐舛葹?. 005-0. 02g/L時對5-羥基吲哚轉化率的影響，采用實施例2中的方法檢測5-HTP的含量。結果如圖3G所示。從以上結果可見，以磷酸吡哆醛0.005-0.02g/L，* 40-60°C，pH值為7_9，酶量2000-8000U/L，反應3-12h，色氨酸酶可以催化底物5-羥基吲哚和L-半胱氨酸生產5-HTP。同時，優選的轉化條件為5_羥基吲哚15g/L，L-半胱氨酸18g/L，磷酸吡哆醛0. 015g/L，酶量6000U/L，反應溫度45°C，pH值8，反應時間12h。在該優選條件下進行驗證實驗，5-羥基吲哚的轉化率為73. 4% (見圖4)。
權利要求
1.一種色氨酸酶催化5-羥基吲哚和L-半胱氨酸合成5-羥基色氨酸的方法，其特征在于該方法以色氨酸酶為酶源，以5-羥基吲哚和L-半胱氨酸為底物，酶促反應液中，底物5-羥基吲哚的加入量為5至20g/L，L-半胱氨酸的加入量為6至24g/L，酶源的添加量為2000至8000U/L，在40至60°C下，pH7至9，經酶法轉化反應3h至12h，生產L-5-羥基色氨酸。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述的色氨酸酶來自大腸桿菌基因工程重組菌BL21 (DE3)-pET21a(+)-tnaA的發酵菌體細胞或裂解液，或枯草芽孢桿菌基因工程菌 WB600-pWB980-tnaA 的發酵液。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于酶促反應液中還包括輔酶磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的加入量為O. 005至O. 02g/L。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于輔酶磷酸吡哆醛的用量優選為O.015g/L。
5.根據權利要求I至4中任一項所述的方法，其特征在于酶促反應液中，底物5-羥基吲哚的用量優選為15g/L，底物L-半胱氨酸的用量優選為18g/L，酶源的添加量優選為6000U/L,，優選轉化溫度為45°C，優選轉化pH8，優選轉化時間12h。
全文摘要
一種新的利用色氨酸酶催化5-羥基吲哚和L-半胱氨酸合成L-5-羥基色氨酸的方法。本發明創新性地利用色氨酸酶作為酶源，以5-羥基吲哚和L-半胱氨酸為底物，經酶促反應生成L-5-羥基色氨酸。所述的色氨酸酶來自大腸桿菌基因工程重組菌BL21(DE3)-pET21a(+)-tnaA的發酵菌體細胞或裂解液，或枯草芽孢桿菌基因工程菌WB600-pWB980-tnaA的發酵液。本發明提供了一種新的L-5-羥基色氨酸的綠色生產工藝路線。
文檔編號C12P13/04GK102808008SQ20121030342
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月23日 優先權日2012年8月23日
發明者高智慧, 丁國鈺 申請人:天津啟仁醫藥科技有限公司