專利名稱：同時檢測人ebv、bkv和 cmv的三重實時熒光定量pcr方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫學分子生物檢測技術。特別是一種可同時檢測人EBV、BKV和CMV的三重實時熒光定量PCR方法及試劑盒?？蓱糜谝浦埠蟛∪嘶蚱渌庖咭种茽顟B下病人血清或其他樣品中三種病毒載量的同時監測。
背景技術：
器官移植是現代醫學的標志性學科之一。自1959年首例腎移植成功以來目前世界上已有70多萬尿毒癥患者接受了器官移植而獲得新生，而且這個數字還在以每年近5萬的速度增加。截至2003年，我國累計完成腎臟移植5萬多例，現在每年完成超過5000例， 數量僅次于美國位居世界第二位。中國約有100多萬尿毒癥患者，每年還有近12萬的新增病人。對這些患者，腎臟移植是目前最重要的治療手段。然而移植腎臟的長期存活，始終是腎移植成功與否的主要問題。感染是器官移植手術后重要的并發癥之一，也是造成器官移植失敗的重要原因。 在移植早期，感染造成的死亡率達40% -78%。隨著新的免疫抑制藥物的出現及其聯合應用，使單一藥物用量有所下降，從而使感染引起的移植早期死亡率顯著下降。盡管如此，在導致器官移植受者死亡的原因中，感染仍居首位，其中病毒感染占很大的比例。移植后病毒感染早期可能沒有明顯的臨床表現，對移植腎的損傷也不易被發現，感染后期卻會影響移植腎的功能。同時，不同的病毒感染，往往需要不同的治療方案才能奏效，因此，盡早診斷和預防病毒感染，同時進行病毒載量與感染情況的不斷監測，對降低腎移植后病毒感染的危害有很大的臨床意義。巨細胞病毒(Cytomegalovirus CMV)，EB 病毒，Epstein-Barr virus (EBV)以及 BK病毒BK(p0ly0maViruS BKV)是實體器官移植后最常見的病毒感染。即使在無癥狀的感染情況下，也會對移植器官造成影響。目前已經有多種檢測方法用于病毒滴度或載量的檢測。最常用的為免疫學方法和定量PCR方法。然而這些方法都只能同時檢測一種病毒感染情況，病人要想了解這三種病毒的感染情況，至少得做三個檢測。最近有前瞻性研究表明， 這三種病毒存在共感染的情況，如果能有一種同時檢測這三種病毒載量的方法，將會使檢測過程變得方便、快速。實時焚光定量PCR技術(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction， Real Time PCR)以其快速、靈敏、特異、重復性好等特點前最常用病毒基因載量檢測方法之一，廣泛的應用在各種病毒上。特別是Taqman探針技術，應用更加廣泛。在移植相關病毒檢測領域目前已經有成熟的CMV，BKV, EBV病毒Taqman探針定量PCR檢測試劑盒，均能夠準確迅速的檢測病毒的載量。然而如前所述，這些檢測試劑盒均只能檢測一個靶標。多重熒光定量PCR技術是在熒光定量PCR基礎上發展起來的一個新技術，它強調在同一個反應體系里同時擴增多個靶標。最近已有多項研究將多重定量PCR技術應用于病毒診斷檢測領域。在移植后病毒檢測方面，Kaoru Wada等用多重定量PCR技術，同時檢測27例造血干細胞病人和19例肝移植病人全血樣品中的HHV-6病毒，CMV以及EBV病毒共計303份樣品，結果顯示多重PCR體系與單一擴增結果在靈敏度和特異性方面基本相同。 YasuhitoFunahashi等用多重定量PCR技術同時檢測BKV病毒、JCV病毒以及腺病毒，同樣取得良好結果。這些結果都說明了多重PCR技術用于病毒檢測可靠性。但是到目前為止， 尚無報道有同時檢測CMV病毒，EBV病毒以及BKV病毒的試劑盒。
發明內容
本發明的目的在于提供一種能同時檢測CMV病毒，EBV病毒以及BKV病毒的多重定量Taqman PCR方法，同時基于該方法提供相應的試劑盒。該試劑盒可用于人全血或尿液標本的檢測。一種同時檢測人EBV、BKV和CMV的三重實時熒光定量PCR方法，其特征在于，所述實時熒光定量PCR的反應體系中同時采用以下三套引物及探針CMV-FP =ATC AAC ATA AGG ACT TTT CAC ACT TT,CMV-RP :GAA TAC AGA CAC TTA GAG CTC GGG GT,CMV-探針:CTG GCC AGC ACG TAT CCC AAC AGC A-BHQl ；EBV-FP :GGA ACC TGG TCA TCC TTT GC,EBV-RP :ACG. TGC. ATG. GAC. CGG. TTA. AT,EBV-探針CGC. AGG. CAC. TCG. TACTGC. TCG. CT-BHQl ；BKV-FP :AGT GGA TGG GCA GCC TAT GTA,BKV-RP :TCA TAT CTG GGT CCC CTG GA,BKV-探針A GG TAG AAG A GG TTA GGG TGT TTG ATG GCA CA G-BHQ2 ；CMV-探針，EBV-探針和BKV-探針的5，端標記的熒光素不同，分別為FAM，HEX和 ROX。所述實時熒光定量PCR的體系如下2XQuantitech Multiplex PCR NoRox Master Mix :12.5ul，5uM CMV-FP :0.5ul, 5uM CMV-RPO. 5ul, uM CMV-探針 lul，5uM EBV-FP 0. 5ul,5uM EBV-RP 0. 5ul,5uM EBV-探針 lul，5uMBKV-FP 0. 5ul，5uM BKV-RP 0. 5ul，5uM BKV-探針 lul，待測模板 1 !3ul，補充雙蒸水至25ul。所述實時熒光定量PCR的反應程序如下Step 1 95 °C 15min,Step 2 94°C 60s,Step 3 60°C 60s,Step 4 讀數，Go to step 2 for 40 個循環。同時檢測人EBV、BKV和CMV病毒的三重實時熒光定量PCR試劑盒，其特征在于包括如以下核苷酸序列所示的引物及熒光探針CMV-FP =ATC AAC ATA AGG ACT TTT CAC ACT TT,CMV-RP :GAA TAC AGA CAC TTA GAG CTC GGG GT,CMV-探針:CTG GCC AGC ACG TAT CCC AAC AGC A-BHQl ；EBV-FP :GGA ACC TGG TCA TCC TTT GC,
EBV-RP :ACG. TGC. ATG. GAC. CGG. TTA. AT,EBV-探針CGC. AGG. CAC. TCG. TACTGC. TCG. CT-BHQl ；BKV-FP :AGT GGA TGG GCA GCC TAT GTA,BKV-RP :TCA TAT CTG GGT CCC CTG GA,BKV-探針A GG TAG AAG A GG TTA GGG TGT TTG ATG GCA CA G-BHQ2 ；CMV-探針，EBV-探針和BKV-探針的5，端標記的熒光素不同，分別為FAM，HEX和 ROX。還包括EBV、BKV和CMV病毒基因的三種病毒，每種病毒分別6個濃度梯度的18個標準品。所述標準品的濃度梯度分別為1 X IO6拷貝/ul，1 X IO5拷貝/ul，1 X IO4拷貝/ul， IX IO3 拷貝 /ul，lX102 拷貝 /uiaxio1 拷貝 /ul。還包括病毒DNA提取試劑。還包括實時熒光定量PCR擴增所需的PCR緩沖液、Taq酶，dNIPs。所述引物、熒光探針、PCR緩沖液、Taq酶和dNII^s混合呈PCR預混液。本發明根據三種病毒的基因組序列特征，分別設計三種病毒的特異性引物和探針，探針分別用三種不同熒光素標。經試驗證明，三套探針引物同時擴增待測模板或人工配置的驗證標準品，都能夠特異地正確反映三種病毒在樣品中的存量，且互不干擾。根據設計得到的三套引物及熒光探針，本發明提供了實時熒光定量PCR方法和試劑盒，并提供了優化的PCR體系和程序。當然本領域技術人員根據實時熒光定量PCR的一般要求可以調整PCR體系和程序，也同樣能夠實現檢測的目的。在本發明提供的試劑盒的一種優選實施方式中，在試劑盒中裝入包括含有EBV、 BKV和CMV三種病毒模板的呈濃度梯度的6份標準品，用于制備標準曲線。為了更進一步提高試劑盒的方便程度，在制備的一些試劑盒中，裝入病毒DNA提取試劑，實時熒光定量PCR所需的緩沖液，Taq酶，dNTPs等試劑。在一個優選實施例中，優選將引物，探針，緩沖液，Taq酶，dNTPs等試劑按比例混合制成預混液，用于檢測時，加入待測模板即可。
圖1單重擴增系統與三重擴增系統擴增三種病毒標準品建立的標準曲線
具體實施例方式實施例1三種病毒引物以及Taqman探針的設計和體系優化根據NCBI公布的CMV、EBV和BKV病毒基因組序列，使用Primer Express 3 (Applied Biosystems)以及 Primer Premier 5 (Premier Biosoft International)弓|物設計軟件，所設計引物以及探針序列如表1所示表1所設計的檢測引物和熒光標記
權利要求
1.同時檢測人EBV、BKV和CMV的三重實時熒光定量PCR方法，其特征在于，所述實時熒光定量PCR的反應體系中同時采用以下三套引物及探針CMV-FP =ATC AAC ATA AGG ACT TTT CAC ACT TT,CMV-RP :GAA TAC AGA CAC TTA GAG CTC GGG GT,CMV-探針:CTG GCC AGC ACG TAT CCC AAC AGC A-BHQl ；EBV-FP :GGA ACC TGG TCA TCC TTT GC,EBV-RP :ACG. TGC. ATG. GAC. CGG. TTA. AT,EBV-探針CGC. AGG. CAC. TCG. TACTGC. TCG. CT-BHQl ；BKV-FP :AGT GGA TGG GCA GCC TAT GTA,BKV-RP :TCA TAT CTG GGT CCC CTG GA,BKV-探針A GG TAG AAG A GG TTA GGG TGT TTG ATG GCA CA G-BHQ2 ；CMV-探針，EBV-探針和BKV-探針的5，端標記的熒光素不同，分別為FAM，HEX和R0X。
2.根據權利要求1所述的三重實時熒光定量PCR方法，所述實時熒光定量PCR的體系如下2XQuantitech Multiplex PCR NoRox Master Mix :12.5ul，5uM CMV—FP :0.5ul，5uM CMV-RPO. 5ul,uM CMV-探針 lul，5uM EBV-FP 0. 5ul，5uM EBV-RP 0. 5ul，5uM EBV-探針 lul， 5uMBKV-FP 0. 5ul，5uM BKV-RP 0. 5ul，5uM BKV-探針 lul，待測模板 1 3ul，補充雙蒸水至 25uL·
3.根據權利要求1所述的三重實時熒光定量PCR方法，所述實時熒光定量PCR的反應程序如下Step 1 95 °C 15min, Step 2 94°C 60s, Step 3 60°C 60s,Step 4 讀數，Go to step 2 for 40 個循環。
4.同時檢測人EBV、BKV和CMV的三重實時熒光定量PCR試劑盒，其特征在于包括如以下核苷酸序列所示的引物及熒光探針CMV-FP =ATC AAC ATA AGG ACT TTT CAC ACT TT,CMV-RP :GAA TAC AGA CAC TTA GAG CTC GGG GT,CMV-探針:CTG GCC AGC ACG TAT CCC AAC AGC A-BHQl ；EBV-FP :GGA ACC TGG TCA TCC TTT GC,EBV-RP :ACG. TGC. ATG. GAC. CGG. TTA. AT,EBV-探針CGC. AGG. CAC. TCG. TACTGC. TCG. CT-BHQl ；BKV-FP :AGT GGA TGG GCA GCC TAT GTA，BKV-RP :TCA TAT CTG GGT CCC CTG GA,BKV-探針A GG TAG AAG A GG TTA GGG TGT TTG ATG GCA CA G-BHQ2 ；CMV-探針，EBV-探針和BKV-探針的5，端標記的熒光素不同，分別為FAM，HEX和R0X。
5.根據權利要求4所述的三重實時熒光定量PCR試劑盒，還包括EBV、BKV和CMV病毒基因的三種病毒，每種病毒分別6個濃度梯度。
6.根據權利要求5所述的三重實時熒光定量PCR試劑盒，所述標準品的濃度梯度分別為 IX IO6 拷貝 /ul，IX IO5 拷貝 /ul，IX IO4 拷貝 /ul，IX IO3 拷貝 /ul，IX IO2 拷貝 /ul， IXlO1 拷貝 /ul。
7.根據權利要求4所述的三重實時熒光定量PCR試劑盒，所還包括病毒DNA提取試劑。
8.根據權利要求4所述的三重實時熒光定量PCR試劑盒，還包括熒光實時定量PCR擴增所需的PCR緩沖液、Taq酶和dNIPs。
9.根據權利要求8所述的三重實時熒光定量PCR試劑盒，所述引物、熒光探針、PCR緩沖液、Taq酶和dNII^s混合呈PCR預混液。
全文摘要
本發明“同時檢測人EBV、BKV和CMV的三重實時熒光定量PCR方法及試劑盒”，屬于醫學分子生物檢測技術。采用自己設計的三種病毒的三套引物和探針同時檢測待測樣本，試驗證明，三套探針引物同時擴增待測模板或人工配置的驗證標準品，都能夠特異地正確反映三種病毒在樣品中的存量，且互不干擾。
文檔編號C12Q1/68GK102363818SQ20111017710
公開日2012年2月29日 申請日期2011年6月28日 優先權日2011年6月28日
發明者李全, 焦守恕 申請人:同昕生物技術(北京)有限公司