專利名稱：長效重組人生長激素的Fc融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種長效重組人生長激素的Fe融合蛋白及其制法和用途。
背景技術(shù)：
人生長激素(hGH)是由腦下垂體產(chǎn)生和釋放，全長191個氨基酸、分子量為22kDa的肽類激素。它參與了大部分人的正常生長和發(fā)育的調(diào)控，是刺激身體生長的主要激素，并呈現(xiàn)出多種生物效應(yīng)，包括線性增長、體質(zhì)形成、泌乳、巨噬細胞活化以及類似胰島素作用等。此外，生長激素還可以刺激骨骼、軟骨和肌肉的代謝。生長激素與其特異生長激素受體(hGHR)在靶點細胞表面相互結(jié)合，介導(dǎo)出生化串聯(lián)反應(yīng)，從而激活生物效應(yīng)。生長激素與受體分子的結(jié)合通常遵循一種序貫機制；先通過生長激素內(nèi)的結(jié)合位點I與第一個受體分子結(jié)合，其后再通過生長激素的結(jié)合位點2與第二個受體分子結(jié)合。這種由一個生長激素分子與兩個生長激素受體分子的結(jié)合是激化生物活性、調(diào)節(jié)生長和發(fā)育所必需的步驟。具體地，結(jié)合位點2包含了生長激素分子N端的8個氨基酸和其他幾個來自屬于螺旋線I和螺旋線3內(nèi)的氨基酸。結(jié)合位點I則包括生長激素分子在螺旋線I之內(nèi)的氨基酸以及C-端附近的氨基酸。結(jié)合位點I的8個氨基酸占了結(jié)合總能量的85%。換言之，這8個氨基酸在與受體結(jié)合的過程中扮演了決定性的角色。若將這8個氨基酸殘基的位置以其它氨基酸取代，將會迅速改變其與生長激素受體結(jié)合的能力(例如見，Wells et al. Recent Prog. Horm. Res. ,48 :253-75,1993) 這 8 種氨基酸位于螺旋線I和螺旋線2之間段(K41，L45，P61，R64)和螺旋線4內(nèi)的羧基C端半段(K172，T175，F(xiàn)176，R178)，而其后段4個氨基酸殘基正好位于全長191個氨基酸的生長激素的C-終端附近。因此生長激素C端附近的氨基酸在與受體結(jié)合的過程中舉足輕重。換言之，生長激素C端的氨基酸與其功能密切相關(guān)，故目前對GH進行基因工程改造時通常避開C端，也不采用人GH的C末端與其他蛋白進行融合的方式。兒童和成人在生長激素缺乏情況下，補充重組人生長激素(rhGH)是理想的治療方式。但其缺點是重組人生長激素在人體內(nèi)藥效甚短，其靜脈注射的血清清除半衰期約20分鐘。若以皮下注射重組人生長激素，其高峰血藥濃度通常要幾個小時后才能達到，而其消除半衰期則為3至8小時。因此，重組人生長激素的治療需要每周注射3次，或每天一次，以保持適當(dāng)?shù)难迳L激素水平。對于那些需要長期接受生長激素治療的病人，往往由于不能按時注射，造成治療效果降低。長效、高活性的重組人生長激素因而成為此藥劑改善的目標(biāo)。在1999年到2004年間，基因技術(shù)(Genentech)公司和阿爾凱默斯(Alkermes)股份有限公司開發(fā)出Nutropin D印ot在市場銷售，該產(chǎn)品是一種持續(xù)釋放形式的生長激素，具長效特性，接受治療的病人其注射次數(shù)可減至每2或4周一次，而不需每天注射。不過由于生產(chǎn)成本過高，該產(chǎn)品在2004年被撤出市場。在此期間，數(shù)種治療性蛋白藥物藉著與某些聚合物如聚乙二醇(PEG)進行結(jié)構(gòu)上的修改來延長半其衰期和改善體內(nèi)效價而創(chuàng)建了這些蛋白質(zhì)藥物的第二代產(chǎn)品。蛋白藥物與聚乙二醇共價性的結(jié)合通?？稍黾拥鞍踪|(zhì)的有效期限，并降低其在人體內(nèi)的清除率。重組人生長激素亦不例外。一些有關(guān)聚乙二醇生長激素的文獻顯示，數(shù)種不同形式的聚乙二醇生長激素確實具有比重組人生長激素較長的半衰期，但往往在蛋白質(zhì)的聚乙二醇化過程中造成了生物活性的損失。IgG類的免疫球蛋白是人類血液中最豐富的蛋白質(zhì)。它們的半衰期可高達21天。已有報導(dǎo)將IgG的Fe區(qū)域與其它蛋白質(zhì)(如各種細胞因子和可溶性受體)結(jié)合而形成融合蛋白(參見，例如 Capon 等人,Nat ure, 337 :525-531,1989 ;Chamow 等人，TrendsBiotechnol.，14 :52-60,1996 ;美國專利 No. 5，116，964 和 5，541，087)。典型的融合蛋白是一重二聚體蛋白質(zhì),系通過IgG Fe絞鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基與蛋白連接,而形成類似IgG、但缺少CHl區(qū)域和輕鏈的分子。由于結(jié)構(gòu)上的同源，F(xiàn)e融合蛋白表現(xiàn)出的體外藥物動力學(xué)特性與同種型的人IgG相當(dāng)類似。因此制造含有與人IgG蛋白質(zhì)的Fe區(qū)域相連的hGH融合蛋白，將有助于延長hGH的循環(huán)半衰期和/或增加它的生物活性。此外，由于生長激素分子C端氨基酸在生物活性的高度重要性，因此在構(gòu)建hGH-Fc融合蛋白(hGH-Fc)時必需要預(yù)先考慮到如何克服連接Fe半體時所帶來的后果。若直接將龐大的IgG Fe半體聯(lián)結(jié)在C端，會為C端造成空間位阻效應(yīng),而大大地影響了生長激素結(jié)合位點對受體的可親度。首先，融合蛋白與第一個生長激素受體的結(jié)合將因Fe半體帶來的位阻現(xiàn)象受損，其接下去與細胞表面上的第二受體的后續(xù)結(jié)合可能因為此位阻效應(yīng)而更進一步減弱。因此，根據(jù)上述生長激素C-終端氨基酸的重要性(K172，T175，F(xiàn)176，R178), hGH-Fc融合蛋白對受體的親和力將受到破壞，導(dǎo)致其生物活性降低甚至喪失。因此目前的技術(shù)都是避免將Fe半體直接聯(lián)結(jié)在C-終端，以免其活性遭受破壞。大多數(shù)重組蛋白都將Fe半體聯(lián)結(jié)到生長激素分子的N-終端。但此替換方式亦有其缺陷，由于生長激素分子與其受體的結(jié)合位點分布于兩終端，不論是將Fe接到N端或C端，融合蛋白的生物活性都可能會因Fe所帶來的位阻效應(yīng)而遭破壞。由于hGH-L-vFc融合蛋白的構(gòu)建有其本質(zhì)上的困難，迄今為止尚沒有既具有半衰期顯著延長的令人滿意的GH衍生物。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)長效、高活性、可以以合理的成本生產(chǎn)的hGH衍生物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種具有高度生物活性的hGH-L-vFc融合蛋白及其制備方法和用途。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種重組hGH-L-vFc融合蛋白，所述的融合蛋白從N端到C端依次含有人GH、肽接頭和人IgG Fe變體，并且所述的人IgG Fe變體選自下組⑴含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域；(ii)含有 Ser228Pro 和 Leu235Ala 突變的人 IgG4 絞鏈區(qū)、CH2 和 CH3 區(qū)域；(iii)含有 Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突變的人 IgGl 絞鏈區(qū)、CH2 和 CH3區(qū)域。在另一優(yōu)選例中，所述的肽接頭含有2-20個氨基酸，所述肽接頭存在于人GH和人IgG Fe變體之間；且所述的肽接頭含有兩個或更多選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的
氨基酸。在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :18,20或22所示。在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白的氨基酸序列是去除了 -26到-I位氨基酸殘基的hGH前導(dǎo)肽之后的SEQ ID NO : 18、20或22所示的氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的hGH-L-vFc融合蛋白在摩爾基礎(chǔ)上，具有與rhGH類似或更高的體外生物活性、更長的半衰期。 在本發(fā)明的第二方面，提供了一種編碼本發(fā)明第一方面所述重組hGH-L-vFc融合蛋白的DNA分子。 在本發(fā)明的第三方面，提供了一種CHO衍生細胞株，所述細胞在其生長培養(yǎng)基中在每24小時內(nèi)，產(chǎn)生超過10 μ g/百萬個細胞的如本發(fā)明第一方面所述的重組hGH-L-vFc
融合蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的CHO衍生細胞株在生長培養(yǎng)基中，每24小時內(nèi)，產(chǎn)生超過30 μ g/百萬個細胞的本發(fā)明第一方面所述的重組hGH-L-vFc融合蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的CHO衍生的細胞株含有編碼hGH-L-vFc融合蛋白的DNA序列，并且所述的DNA序列具有SEQ ID NO : 17、19或21所示的核苷酸序列。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種制備本發(fā)明第一方面所述重組融合蛋白的方法，包括步驟(a)在融合蛋白在其生長培養(yǎng)基中每24小時期間內(nèi)，表達超過10 μ g/106 (百萬)個細胞的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明的第三方面所述的細胞株；和(b)純化步驟(a)表達的蛋白質(zhì)，其中重組融合蛋白在摩爾基礎(chǔ)上，具有與rhGH類似的或更高的體外生物活性，更長的半衰期。在另一優(yōu)選例中，所述的重組融合蛋白在人GH和人IgG Fe變體之間有2-20個氨基酸的柔性肽；且所述柔性肽接頭含有兩個或更多選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的
氨基酸。在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO :18,20或22所不。在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白的氨基酸序列是去除了 -26到-I位氨基酸殘基的hGH前導(dǎo)肽之后的SEQ ID NO : 18、20或22所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種提高含有人GH、柔性肽接頭和人IgG Fe變體的重組融合蛋白的表達量的方法，所述的方法包括(a)將編碼融合蛋白的DNA引入CHO細胞，生成CHO衍生的細胞系；(b)培養(yǎng)這種CHO衍生的細胞系，從而表達融合蛋白；和(c)純化步驟(b)表達的融合蛋白，其中重組融合蛋白是hGH-L-vFc融合蛋白，其特征為表現(xiàn)出極高的體外生物活性，即在摩爾基礎(chǔ)上，具有與人GH類似或更高的體外生物活性和更長的半衰期；其中在人GH和IgG Fe變體間存在含有約2-20個氨基酸的柔性肽接頭；和柔性肽接頭含有2個或多個氨基酸選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸；和其中人IgG Fe變體含有選自以下的人IgG的絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域Pro331Ser突變的人IgG2 ；Ser228Pro和Leu235Ala 突變的人 IgG4 ;和 Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突變的人 IgGl。
在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :18,20或22所示。在另一優(yōu)選例中，所述編碼融合蛋白的DNA具有SEQ ID NO :17、19或21所示的核苷酸序列。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


圖I顯示了人IgGl、IgG2、IgG4和它們變體的絞鏈區(qū)和CH2區(qū)域的氨基酸序列的比對。比較三個部分氨基酸區(qū)域228、234-237和330-331。這些變體的氨基酸突變以粗斜體顯示。氨基酸殘基編號是根據(jù)EU編號體系標(biāo)定。
圖2顯示了在pGFP表達載體內(nèi)HindIII-EcoRI片段的hGH-L_vFcY2的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列。氨基酸殘基-26到-I是hGH的前導(dǎo)肽。成熟蛋白含有hGH(氨基酸殘基I到191)、肽接頭(氨基酸殘基192到207)和Fe變體(氨基酸殘基208到430)。在Fe區(qū)域中，粗體的核苷酸和相應(yīng)的氨基酸變體用下劃線標(biāo)出。圖3顯示了在pGFP表達載體內(nèi)HindIII-EcoRI片段的hGH-L_vFcY4的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列。氨基酸殘基-26到-I是hGH的前導(dǎo)肽。成熟蛋白含有hGH (氨基酸殘基I到191)、肽接頭(氨基酸殘基192到207)和Fe變體(氨基酸殘基208到436)。在Fe區(qū)域中，粗體的核苷酸和相應(yīng)的氨基酸變體用下劃線標(biāo)出。圖4顯示了在pGFP表達載體內(nèi)HindIII-EcoRI片段的hGH_L_vFcYl的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列。氨基酸殘基-26到-I是hGH的前導(dǎo)肽。成熟蛋白含有hGH (氨基酸殘基I到191)、肽接頭(氨基酸殘基192到207)和Fe變體(氨基酸殘基208到434)。在Fe區(qū)域中，粗體的核苷酸和相應(yīng)的氨基酸變體用下劃線標(biāo)出。圖5顯示旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞株的生長及其分泌hGH-LvFcY2融合蛋白的濃度趨勢曲線圖。圖6顯示了 hGH-L-vFcY2純化蛋白刺激Nb2細胞增殖的能力。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，首次設(shè)計了一種獨到的絞鏈區(qū)肽接頭來降低空間位阻效應(yīng)，可以制得hGH的C端與Fe連接的融合蛋白，中間有柔軟的肽接頭。令人意外的是，此融合蛋白不僅不會導(dǎo)致GH的功能喪失，反而能夠維持、甚至提高生長激素-Fe融合蛋白的生物活性。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明hGH-L-vFc融合蛋白從N端到C端依次含有人GH、肽接頭和人IgGFe變體。較佳地，其中人Ig Fe變體含有選自以下的變體絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域(A)含有Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突變的人 IgGl ； (B)含有 Pro331Ser 突變的人 IgG2 ;和(C)含有Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4。較佳地，使用約2_20個氨基酸長度的、含有以下2種或多種氨基酸構(gòu)成的柔性肽接頭甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸。IgG Fe變體是非裂解性的，且與天然IgG Fe相比含有氨基酸突變。此類hGH-L-vFc融合蛋白在摩爾基礎(chǔ)上，具有與rhGH類似或更高的體外生物活性。且hGH-L-vFc γ2的體內(nèi)血清清除半衰期比rhGH有顯著增長。本發(fā)明的另一實施例為人Ig Fe變體含有絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域。其CH2區(qū)域在228、234、235和331位(由EU編號體系確定的位置)含有氨基酸突變，從而降低Fe的效應(yīng)子功能。在本發(fā)明的另一實施例中，公開了一種從哺乳動物細胞系如CHO衍生的細胞系制備或生產(chǎn)這種重組融合蛋白的方法。培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細胞系，使得重組融合蛋白在其生長培養(yǎng)基中在24小時期間以超過10 (較佳地為30) μ g/106 (百萬)個細胞的水平下表達。這些hGH-L-vFc融合蛋白顯示出高度的體外生物活性和更長的體內(nèi)血清半衰期而無不良副作用，從而改善了藥物動力學(xué)和藥效，進而降低了實現(xiàn)類似藥效所需的劑量和注射次數(shù)。此外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在hGH和人IgG Fe變體間添加的肽接頭以兩種方式提高hGH-L-Fc的體外生物活性⑴使Fe區(qū)域遠離hGH上的hGHR結(jié)合位點，和⑵使一個hGH遠離另一個hGH結(jié)構(gòu)域,從而使兩個hGH區(qū)域能分別與祀細胞上的hGHR反應(yīng)。且人的IgG Fe變體在CH2區(qū)域在228、234、235、331位點含有氨基酸突變，從而降低Fe的效應(yīng)子功能。Fe 元件Fe元件來自免疫球蛋白的Fe區(qū)域，F(xiàn)e在消滅病原體的免疫防御中具重要作用。IgG的效應(yīng)子功能由Fe介導(dǎo)而通過兩種主要機制(I)與細胞表面Fe受體(Fe Y Rs)的結(jié)合，導(dǎo)致通過抗體-依賴性細胞毒性(ADCC)途徑，由殺傷細胞通過吞噬作用或裂解作用而嚥吞病原體；(2)與第一補體成分Cl的Clq部分的結(jié)合，引發(fā)依賴于補體的細胞毒性(CDC)途徑，從而溶解病原體。在四種人IgG同種型中，IgGl和IgG3能有效地結(jié)合Fcy R。IgG4與Fe Y R的結(jié)合親和力比IgGl或IgG3的低一個數(shù)量級，而IgG2與Fe Y R的結(jié)合低得難以測定。人IgGl和IgG3還能有效地結(jié)合Clq，并激活補體串聯(lián)反應(yīng)。人IgG2對補體的固定作用很弱，而IgG4似乎在激活補體串聯(lián)反應(yīng)的能力方面相當(dāng)缺乏。對應(yīng)用于人的治療而言，當(dāng)hGH-Fc融合蛋白結(jié)合于靶點細胞表面上的hGHR時，融合蛋白的Fe區(qū)域必須不能有不良效應(yīng)子功能，因而不會溶解或除去這些靶點細胞。因此，hGH-Fc的Fe區(qū)域必須是非溶解性的，對結(jié)合于Fe Y Rs和Clq從而觸發(fā)效應(yīng)子功能方面，F(xiàn)e區(qū)域必須是無活性的。顯然，沒有一種天然的IgG同種型適合產(chǎn)生hGH-Fc融合蛋白。為了得到非溶解性的Fe，必須使天然Fe區(qū)域中的一些氨基酸突變，以降低其效應(yīng)子功能。透過人和鼠的IgG同種型的氨基酸序列的比較顯示，F(xiàn)e片段在CH2區(qū)域N末端附近的序列在IgG Fe與Fe YRs的結(jié)合中具重要作用。其在234位到237位基序的重要性已在基因工程建構(gòu)的抗體中證明(參見，例如Duncan等人，Nature, 332 :563-564,1988)。本發(fā)明所提氨基酸殘基編號是根據(jù)Kabat等人所述的EU編號體系標(biāo)定(《SEQUENCES ofPROTEINS of IMMUNOLOGICAL INTEREST》，第 5 版，United States Department of Healthand Human Services, 1991)。在四種人IgG同種型中，IgGl和IgG3與Fe γ Rs的結(jié)合力最高，且兩者具有相同的Leu234-Leu-Gly-Gly237序列(圖I)。IgG4 % Fe y Rs結(jié)合的親和力甚低，觀其序列顯示有個氨基酸受到替換，即在234位點上Leu換成Phe。在不與Fe Y Rs結(jié)合的IgG2中，則發(fā)生兩個位點替換和一個位點被刪除，從而形成Val234-Ala-Gly237序列(圖I)。為了減少Fe與Fe Y R的結(jié)合和ADCC活性，IgG4中的Leu235可用Ala取代(參見，例如 Hutchins 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92 :11980-11984，1995)。IgGl 抗體內(nèi)的Glu233-Leu-Leu235序列曾被用IgG2中的Pro233_Val_Ala235相關(guān)序列來替換。這種改變使IgGl變體在小鼠中失去了透過Fe Y R-介導(dǎo)除去靶點細胞的能力。有關(guān)抗體對Fe Y R與Clq結(jié)合至關(guān)重要的第二部位座落于人IgG的CH2區(qū)域靠近羧基端的附近(參見，例如Duncan等人，Nature, 332 =738-740,1988)。在四種人IgG同種型中，這部分中僅有一個位點顯示取代IgG4中的Ser330和Ser331替換了 IgGl、IgG2和IgG3中的Ala330和Pro331(圖I)。Ser330的存在不影響Fe Y R與Clq的結(jié)合。用Ser替代Pro331則使IgGl失去了與Clq的結(jié)合親和力，而用Pro替代Ser331部分保留了 IgG4的補體固定活性(參見，例如Tao等人，J. Exp. Med.，178 :661-667,1993 ;Xu等人，J. Biol.Chem. ,269 :3469-3474,1994)。融合蛋白及其生產(chǎn)方法本發(fā)明提供了一類新型有效的hGH-L-Fc融合蛋白，融合蛋白中的Fe元件為變體 (vFc),以用于構(gòu)建高效的hGH-L-vFc融合蛋白。人IgG2不結(jié)合Fe y R,但顯示出微弱的補 體活性。具有Pro331Ser突變的Fcy2變體應(yīng)比天然Fcy2的變體活性更低，而且仍舊不結(jié)合于Fe Y R0 IgG4Fc在激活變體串聯(lián)反應(yīng)有缺陷，且它與Fe Y R的結(jié)合親和力比活性最高的同種型(IgGl)低約一個數(shù)量級(十倍)。與天然Fcy4相比，具有Leu235Ala突變的Fcy4變體應(yīng)表現(xiàn)出極微的效應(yīng)子功能。具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突變的Fcy1也表現(xiàn)出比天然Fcy1低得多的效應(yīng)子功能。這些Fe變體都比天然存在的人IgG Fe更適于制備hGH融合蛋白。在非溶解Fe的制備中也可引入其它替換，而不危及循環(huán)半衰期或?qū)е虏涣嫉臉?gòu)象變化。本發(fā)明融合蛋白通常由生物合成的方法制備。根據(jù)本發(fā)明所述的核苷酸序列，本技術(shù)領(lǐng)域人員可方便地用各種已知方法制得本發(fā)明的編碼核酸。這些方法例如但不限于PCR, DNA人工合成等，具體的方法可參見J.薩姆布魯克，《分子克隆實驗指南》。作為本發(fā)明的一種實施方式，可通過分段合成核苷酸序列再進行重疊延伸PCR的方法來構(gòu)建本發(fā)明的編碼核酸序列。本發(fā)明還提供了一種表達載體，包含編碼本發(fā)明的融合蛋白的序列以及與之操作性相連的表達調(diào)控序列。所述的“操作性相連”或“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調(diào)節(jié)或控制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。表達載體可采用市售的例如但不限于pcDNA3、pIRES、pDR, pUC18等可用于真核細胞系統(tǒng)表達的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)宿主細胞來選擇合適的表達載體。根據(jù)已知空載表達載體的酶切圖譜，本領(lǐng)域技術(shù)人員可按照常規(guī)方法通過限制性酶剪切與拼接，將本發(fā)明的融合蛋白的編碼序列插入合適的限制性位點，制得本發(fā)明的重組表達載體。本發(fā)明還提供了表達本發(fā)明融合蛋白的宿主細胞，其中含有本發(fā)明的融合蛋白的編碼序列。所述的宿主細胞優(yōu)選的是真核細胞，例如但不限于CH0，C0S細胞，293細胞，RSF細胞等。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的細胞是CHO細胞，其可良好地表達本發(fā)明的融合蛋白，可獲得結(jié)合活性良好，穩(wěn)定性良好的融合蛋白。本發(fā)明還提供一種用重組DNA制備本發(fā)明融合蛋白的方法，其步驟包括I)提供編碼融合蛋白的核酸序列(如SEQ ID NO 17序列);2)將I)的核酸序列插入到合適的表達載體，獲得重組表達載體；
3)將2)的重組表達載體導(dǎo)入合適的宿主細胞；4)在適合表達的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主細胞；5)收集上清液，并純化融合蛋白產(chǎn)物。將所述編碼序列導(dǎo)入宿主細胞可采用本領(lǐng)域的多種已知技術(shù)，例如但不限于磷酸鈣沉淀，原生質(zhì)體融合，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，電穿孔，微注射，反轉(zhuǎn)錄法，噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)法，堿金屬離子法。有關(guān)宿主細胞的培養(yǎng)和表達可參見Olander RM Dev Biol Stand 1996 ;86 :338?？赏ㄟ^離心去除懸浮液中的細胞和殘渣，收集清液。可通過瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)進行鑒定?？蓪⑸鲜鲋苽浍@得的融合蛋白純化為基本均一的性質(zhì)，例如在SDS-P AGE電泳上呈單一條帶。例如，當(dāng)重組蛋白為分泌表達時，可以采用商品化的超濾膜來分離所述蛋白，例如Millipore、Pellicon等公司產(chǎn)品，首先將表達上清濃縮。濃縮液可采用凝膠層析的方法進一步加以純化，或采用離子交換層析的方法純化。例如陰離子交換層析(DEAE等)或陽離子交換層析。凝膠基質(zhì)可為瓊脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白純化的基質(zhì)。Q-或SP-基團是較為理想的離子交換基團。最后，還可用羥基磷灰石吸附層析，金屬螯合層析，疏水相互作用層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)等方法對上述純化產(chǎn)物進一步精制純化。上述所有純化步驟可利用不同的組合，最終使蛋白純度達到基本均一。可利用含有所述融合蛋白的特異性抗體、受體或配體的親和層析柱對表達的融合蛋白進行純化。根據(jù)所使用的親和柱的特性，可利用常規(guī)的方法，如高鹽緩沖液、改變PH等方法洗脫結(jié)合在親和柱上的融合性多肽。可選擇地，所述的融合蛋白的氨基端或羧基端還可含有一個或多個多肽片段，作為蛋白標(biāo)簽。任何合適的標(biāo)簽都可以用于本發(fā)明。例如，所述的標(biāo)簽可以是FLAG，HA, HAl, c_Myc，6_His或8_His等。這些標(biāo)簽可用于對融合蛋白進行純化。藥物組合物本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有有效量(如O. 000001-90wt% ;較佳的O. l-50wt%;更佳的，5-40wt%)的本發(fā)明的融合蛋白，以及藥學(xué)上可接受的載體。通常，可將有效量的本發(fā)明融合蛋白配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中PH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。術(shù)語“有效量”或“有效劑量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量?！八帉W(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。藥學(xué)上可接受的載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配，本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量。本發(fā)明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。本發(fā)明所述的融合蛋白的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于所述的融合蛋白的藥代動力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴(yán)重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通常，當(dāng)本發(fā)明的融合蛋白每天以約O. 00001mg-50mg/kg動物體重(較佳的O. 0001mg-10mg/kg動物體重)的劑量給予,能得到令人滿意的效果。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。本發(fā)明融合蛋白的優(yōu)點如下I.延長GH的循環(huán)半衰期和/或增加生物活性。2.血清中藥物濃度波動的減少，安全性提高，耐受性的改善。 3.含有非溶解Fe變體的hGH-L-vFc融合蛋白能顯著地有助于治療因內(nèi)源性生長激素分泌不足的成長缺失，以及特納綜合癥引起的體型矮小，慢性腎功能衰竭，Prader-WilIi綜合癥,特發(fā)性體型矮小等病癥。4.降低注射頻率，使患者有更好的生活品質(zhì)。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實施例I構(gòu)建編碼hGH-L-vFcY2融合蛋白編碼的基因I.制備含人-生長激素的基因序列質(zhì)粒hGH-L-vFcY2融合蛋白編碼序列是由數(shù)個DNA片段組合而成的。含有人GH的前導(dǎo)肽和成熟蛋白編碼的基因的制備，系根據(jù)NCBI參考序號NM_000515. 3所載人-生長激素的基因序列用人工合成方法制備。合成方法是先沿著hGH基因的雙鏈DNA序列從5’終端向3’終端行進，制備四個上下鏈交替、長度約為180個堿基的寡核苷酸片段。每個片段的終端分別與下一個互補鏈片段的終端含有約20個堿基的互補重疊序列。其后再將此四個寡核苷酸片段，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)組合成長度約為650堿基的核苷酸片段。為了便于克隆，所合成基因的兩端將含有限制性酶內(nèi)切位點。表I列出了用于克隆hGH-L-vFc融合蛋白的寡核苷酸序列。表I
權(quán)利要求
1.一種重組hGH-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白從N端到C端依次含有人GH、肽接頭和人IgG Fe變體， 并且所述的人IgG Fe變體選自下組 (i)含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域； (ii)含有Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域； (iii)含有Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突變的人 IgGl 絞鏈區(qū)、CH2 和 CH3 區(qū)域。
2.如權(quán)利要求I所述的重組hGH-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的肽接頭含有2-20個氨基酸，所述肽接頭存在于人GH和人IgG Fe變體之間；且所述的肽接頭含有兩個或更多選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸。
3.如權(quán)利要求I所述的重組hGH-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 18,20或22所示。
4.如權(quán)利要求I所述的重組hGH-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列是去除了-26到-I位氨基酸殘基的hGH前導(dǎo)肽之后的SEQ ID NO : 18、20或22所示的氨基酸序列。
5.如權(quán)利要求I所述的重組hGH-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的hGH-L-vFc融合蛋白在摩爾基礎(chǔ)上，具有與rhGH類似或更高的體外生物活性、更長的半衰期。
6.一種編碼權(quán)利要求I所述的重組hGH-L-vFc融合蛋白的DNA分子。
7.—種CHO衍生細胞株，其特征在于，所述細胞在其生長培養(yǎng)基中在每24小時內(nèi)，產(chǎn)生超過10 μ g/百萬個細胞的如權(quán)利要求1-5任一所述的重組hGH-L-vFc融合蛋白。
8.如權(quán)利要求7所述的CHO衍生細胞株，其特征在于，在生長培養(yǎng)基中，每24小時內(nèi)，產(chǎn)生超過30 μ g/百萬個細胞的如權(quán)利要求1-5任一所述的重組hGH-L-vFc融合蛋白。
9.如權(quán)利要求7所述的CHO衍生的細胞株，其特征在于，它含有編碼hGH-L-vFc融合蛋白的DNA序列，并且所述的DNA序列具有SEQ ID NO :17、19或21所示的核苷酸序列。
10.一種制備權(quán)利要求I所述重組融合蛋白的方法，其特征在于，包括步驟 (a)在融合蛋白在其生長培養(yǎng)基中每24小時期間內(nèi)，表達超過10yg/106(百萬)個細胞的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的細胞株；和 (b)純化步驟(a)表達的蛋白質(zhì)，其中重組融合蛋白在摩爾基礎(chǔ)上，具有與rhGH類似的或更高的體外生物活性，更長的半衰期。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，在于人GH和人IgGFe變體之間有2-20個氨基酸的柔性肽；且所述柔性肽接頭含有兩個或更多選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO :18、20 或 22 所示。
13.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列是去除了-26到-I位氨基酸殘基的hGH前導(dǎo)肽之后的SEQ ID NO : 18、20或22所示的氨基酸序列。
14.一種提高含有人GH、柔性肽接頭和人IgG Fe變體的重組融合蛋白的表達量的方法，其特征在于，所述的方法包括(a)將編碼融合蛋白的DNA引入CHO細胞，生成CHO衍生的細胞系； (b)培養(yǎng)這種CHO衍生的細胞系，從而表達融合蛋白；和 (c)純化步驟(b)表達的融合蛋白， 其中重組融合蛋白是hGH-L-vFc融合蛋白，其特征為表現(xiàn)出極高的體外生物活性，SP在摩爾基礎(chǔ)上，具有與人GH類似或更高的體外生物活性和更長的半衰期；其中在人GH和IgG Fe變體間存在含有約2-20個氨基酸的柔性肽接頭；和柔性肽接頭含有2個或多個氨基酸選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸；和其中人IgG Fe變體含有選自以下的人 IgG 的絞鏈區(qū)、CH2 和 CH3 區(qū)域Pro331Ser 突變的人 IgG2 ；Ser228Pro 和 Leu235Ala 突變的人 IgG4 ;和 Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突變的人 IgGl。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO :18、20 或 22 所示。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述的編碼融合蛋白的DNA具有SEQIDNO :17、19或21所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種長效重組人生長激素的Fc融合蛋白。本發(fā)明的人生長激素的Fc融合蛋白(hGH-L-vFc融合蛋白)含有人生長激素、約2-20個氨基酸的柔性肽接頭、和人IgG Fc變體。本發(fā)明的Fc變體無裂解性，且顯示極小的不良Fc-介導(dǎo)的副作用，還公開了一種高表達水平制備或產(chǎn)生這類融合蛋白的方法。本發(fā)明的hGH-L-vFc融合蛋白表現(xiàn)出血清半衰期延長，且生物活性增加，從而改善藥物動力學(xué)和藥效，在治療時間內(nèi)所需的注射次數(shù)較少。
文檔編號C12N5/10GK102875683SQ201110193210
公開日2013年1月16日 申請日期2011年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月11日
發(fā)明者金宜慧, 劉瑞賢, 周若蕓, 嚴(yán)孝強, 王宇鵬, 李強, 孫乃超 申請人:旭華(上海)生物研發(fā)中心有限公司