專利名稱：鲇生長激素與穿腸膜肽tat融合蛋白及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因生物工程技術領域，具體涉及一種saGH-TAT重組融合蛋白，還涉及一種saGH-TAT重組融合蛋白的制備方法，還涉及一種表達saGH-TAT重組融合蛋白的基因工程菌，還涉及一種saGH-TAT重組融合蛋白在促進魚類生長中的應用。
背景技術：
生長激素(Growth Hormone, GH)是一類由中腺垂體細胞分泌的單鏈肽類素,本質是蛋白質。GH廣泛存在于脊椎動物(哺乳綱，鳥綱，爬行綱，魚綱等)中，在多種重要的內分泌調控活動中起著重要的作用，尤其表現在促進魚體快速生長上，由于在魚類養殖業上的廣泛前景，因而從其被發現開始一直成為研究的熱點。大量生長激素可以通過重組生長激素基因工程菌發酵而獲得。魚類生長激素基因在大腸桿菌中的表達，最早是由Sakine在1985年完成的，誘導表達的生長激素蛋白產物占·細胞總蛋白的15%。隨后，虹鱒、鮭、羅非魚等的生長激素也在大腸桿菌中相繼獲得表達。有兩類方法推動著魚類生長激素基因體外表達向應用發展其一是表達效率的提高，根據大腸桿菌偏愛密碼子和已知的草魚生長激素氨基酸序列，人工合成草魚生長激素cDNA,并構建表達載體pET-GH，轉化BL21 (DE3)，在T7啟動子的驅動下，通過誘導，獲得的草魚生長激素表達量占細胞總蛋白量的40%其二是采用可作為餌料的表達系統Kawata等構建另一類表達載體pQSGl,在藻類(Agmenellum quadruplicatum)中表達重組的鮭魚生長激素，表達量占細胞蛋白含量的O. 1%。Tsai構建了重組金槍魚生長激素cDNA的桿狀病毒載體ρΗΜ，在多聚角蛋白啟動子的調控下，在昆蟲細胞內表達，表達量占細胞總蛋白的2%-8%新型表達載體的研制和應用，可以獲得更高表達量的外源蛋白。酵母是單細胞低等真核生物，它不僅具備原核細胞增殖快、易培養、便于基因工程操作等特性，同時又具有真核生物的蛋白質翻譯后加工的功能和重組蛋白正確折疊的細胞內環境，加之酵母粉本身就是非常好的單細胞蛋白餌料添加劑，富含各種必需的氨基酸、維生素。因此，以酵母作為生長激素的表達宿主菌，在生產中更具有價值！啤酒酵母首先被用來作為外源基因的表達宿主菌，但在大量表達外源蛋白時，性狀不夠穩定，質粒易于丟失，不適合高密度培養。甲醇營養性酵母(Pichia pastoris)，又稱畢赤酵母，可利用烷烴類化合物來生產單細胞蛋白，成熟的大規模發酵技術已經建立。生長激素直接投喂給魚苗，可以促進魚體的生長，表明生長激素多肽可以活性成分的形式進入魚體。研究發現，魚類小腸上皮細胞可以通過胞飲作用吸收大分子并轉移進入血液循環。給虹鱒投喂重組鮭魚生長激素，虹鱒的體重和體長明顯高于對照。通過熒光標記生長激素進一步確證，虹鱒的后腸是吸收生長激素的部位。在生長激素通過胃和腸道前部時，其中大部分被降解，余下的小部分到達后腸并進入血液循環。當生長激素以抗酸多聚物包被后投喂魚，魚體血液中的生長激素水平以及魚的生長速度都明顯提高。鯉科魚類與鮭科魚類不同的是沒有胃，灌喂不同魚同樣濃度的辣根過氧化物酶，發現鯉魚血漿中的辣根過氧化物酶是虹鱒血漿的1000倍。所以生長激素在投喂給鯉科魚類時，可以有更多的生長激素蛋白分子到達后腸而被吸收。近年來發現有一些小分子的多肽可以介導外源物質穿過細胞膜，這種小分子多肽被稱之為細胞穿膜肽(cell penetrating peptides, CPP)。許多CPP都是來源于某些直接與宿主細胞相互作用的病毒結構蛋白的蛋白轉導結構域(protein transductiondomains，PTD)。現在研究最多、應用范圍最廣的細胞穿膜肽來源于人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)的轉錄激活因子(Trans-activating transcriptional activator, Tat)。Tat 蛋白中存在3個功能結構域，分別是位于N-端的酸性區，主要起反式激活的功能；位于第22-37位氨基酸之間的DNA結合區，該區域富含半胱氨酸；位于第47-60位氨基酸之間的堿性區，是主要的蛋白轉導結構域，參與Tat蛋白的細胞內化作用。Tat蛋白共有86個氨基酸，是HIV復制所必需的調節因子。Schwarze發現位于Tat蛋白中第47_57位之間的11個氨基酸YGRKKRRQRRR不僅能夠獨立穿過細胞膜，而且其穿 膜效率比全長的Tat蛋白還要高。這段多肽即是TAT穿膜肽。不管是單獨的TAT穿膜肽，或者是攜帶其他大分子物質如蛋白質、寡聚核苷酸或脂質體等，在穿膜時都可以表現出較高的穿膜活性。在攜帶外源物質穿膜時，TAT介導的穿膜似乎與其要攜帶的分子大小無關，100KD的蛋白質、40nm大小的納米顆粒、甚至200nm大小的脂質體都可以經TAT運載入細胞內。而且，以這種方式運輸到細胞內的脂質體甚至可以在進入細胞內Ih后仍然可保持結構的完整性。相反的，沒有與TAT穿膜肽連接的物質在與細胞共同孵育時均不能夠進入細胞內。TAT穿膜肽的序列中由于有6個精氨酸和2個賴氨酸殘基，因此是帶有高度正電荷的多肽。以不帶電荷的丙氨酸替代其中的任何一個堿性氨基酸殘基都會使穿膜活性降低，而替代序列中的其他氨基酸殘基時穿膜活性則不會發生改變。這說明TAT穿膜肽所帶的正電荷是其穿膜功能所必需的，因此推測這些正電荷很可能是能夠與真核細胞的細胞膜發生強的靜電作用，從而介導了穿膜過程。對TAT穿膜肽的親和性分析發現，它能夠與許多細胞膜表面的陰離子通過靜電作用強烈地結合，與之結合的細胞表面分子可以是核仁素、蛋白聚糖等。精氨酸豐富的多肽可以穿過細胞膜，而其他氨基酸如賴氨酸、組氨酸等豐富的多肽卻不具有此功能。然而，由精氨酸組成的支鏈聚合物與直鏈聚合物具有同樣的穿膜效率。此外，研究發現TAT穿膜肽不會因為手性結構的改變而影響其穿膜活性，其手性分子與自然結構具有相同的穿膜活性。這說明這種細胞穿膜肽很可能不依賴于特定的結合位點。然而，多肽的長度是影響穿膜效率的重要因素。穿膜效率與精氨酸的個數有關，含有6個或者更多精氨酸的多肽要比含有少于5個精氨酸多肽的穿膜效率高一些，在多肽小于15個氨基酸時，穿膜效率會隨著多肽大小的增加而增強。大于15個氨基酸的多肽雖然也可具有穿膜活性，但其效率卻會明顯減小。盡管對于TAT穿膜肽的穿膜功能研究的比較多，但是到目前為止，關于TAT穿膜肽進入細胞的分子機制還沒有完全研究清楚。早期研究認為是通過直接轉運機制穿過細胞膜，且是不依賴于能量的，但最近的研究也有與這一觀點不同的結果。盡管其進入細胞的機制還沒有完全研究透徹。盡管TAT穿膜肽的應用已經十分廣泛，但利用TAT攜帶魚的生長素跨腸膜并顯著提高魚的產量國內外還沒有報道
發明內容
本發明的目的是在于提供了一種SaGH-TAT融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ IDNO. 2所示。該融合蛋白能夠增強鹽水的耐受能力，比表達的saGH蛋白在耐滲透壓的能力上更強，可以穿過腸細胞膜而進入血液中，使GH可以不經注射而直接進入血液中，通過血液在魚體內的循環，使其融合蛋白到達不同的組織，增加了 GH的利用效率，同時也提高了藥效。本發明的目的是在于提供了一種大腸桿菌基因工程菌株，大腸桿菌(Escherichiacoli) BL21 (DE3) pET-22b(+)-saGH-TAT, ΓοπιρΤ hsdSB (rB mB0 gal dcm(DE3)，保藏編號CCTCC NO M 2012126，該菌株能表達saGH-TAT的融合蛋白，其能顯著促進魚體生長，效率
高,安全性好。本發明的另一個目的是在于提供了一種融合蛋白saGH-TAT的制備方法，該方法可應用于大規模的養殖業中，表達量大，操作簡單，成本低。 本發明的再一個目的是在于提供了一種大腸桿菌基因工程菌株在促進硬骨魚體(鲇魚、黃顙魚、羅非魚、鯉魚、草魚)生長中的應用，能夠高效利用生長激素添加劑并且快速提高魚體增重。本發明還有一個目的是在于提供了一種分離重組的鲇生長激素與穿腸膜肽融合蛋白在增強羅非魚耐高滲透壓海水的研究中的應用。為了達到上述的目的，本發明采用以下技術措施本發明的創新之處在于，本發明利用大腸桿菌表達TAT跨膜域和saGH的融合蛋白，意在促進鲇科魚類的生長。通過基因工程生產的saGH-TAT融合蛋白可以作為魚類養殖中的促生長劑，能夠顯著提高對魚體的生長速率。本發明另一個創新之處在于，將TAT穿膜肽和saGH融合表達，由于TAT穿膜肽可以攜帶外源蛋白穿過細胞膜，因此將saGH-TAT經口投喂魚后該融合蛋白可以穿過腸細胞膜而進入血液中，使GH (Growth Hormone, GH)可以不經注射而直接進入血液中，通過血液在魚體內的循環，使其融合蛋白到達不同的組織，增加了 GH的利用效率，同時也提高了藥效。TAT穿膜肽目前還沒有直接應用于養殖業，但其獨特的穿膜效率十分具有吸引力。而且本發明公開的基因工程菌株的構建方法可以應用于大規模的養殖業中，表達量大，操作簡單，成本低。一種融合蛋白saGH-TAT的制備方法，其步驟是A、鲇生長激素基因的制備首先切取已處死的鲇(人工養殖南方大口鲇)頭部洗凈備用，用刀從口劈開頭部，使上頜部和下頜部分開，在上頜部的腹面有一長管狀的骨骼為鲇副蝶骨，將刀橫擱在副蝶骨的一端，用錘輕敲刀背兩至三下，刀口深度約為2-3mm，副蝶骨的另一端同法敲擊，然后將刀口輕輕扭動，就可以將副蝶骨扭下，便可獲得完整的腦垂體。根據GeneBank中已經發表的鲇科魚類GH的序列(GenBank:AY157496. I)設計PCR引物，以上述腦垂體提取的RNA作為模板反轉出cDNA, PCR擴增目的基因silurus asotus growthhormone gene (saGH)，PCR產物通過DNA凝膠電泳檢測，回收PCR產物并將其克隆到pMD18_T(購自Takara公司)載體中，轉化大腸桿菌JM109，挑取單菌落用堿裂解法小量提取質粒進行酶切鑒定，并進行測序。得到的陽性克隆子即為包含saGH基因的大腸桿菌，用于基因的擴增和保藏。B.通過重疊延伸PCR的方法將TAT 33bp堿基連入saGH的3’端構成saGH_TAT，將PCR產物組裝入pMD18-T載體，得到重組載體pMD18-T-saGH-TAT，然后轉化大腸桿菌 JM109 (recAl, endAl, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44,relAl, Δ (lac-proAB)/F’ [traD36, proAB+, lac Iq, IacZ Δ M15],購自novagen公司),挑取單菌落用堿裂解法小量提取質粒進行酶切鑒定，并進行測序。得到的陽性克隆子即為包含saGH-TAT的大腸桿菌，用于基因的擴增和保藏。
C.融合基因的制備及表達載體的構建首先雙酶切重組質粒pMD18-T-saGH-TAT和質粒pET_22b ( + )(購自novagen公司，amp1")，膠回收含saGH-TAT基因的片段和開環pET-22a ( + )片段，16°C連接后轉化到感受態 E. coli BL21 CF-, ompT, hsdS (rBB-mB —)，gal, dcm (DE3))中，所得到的陽性克隆子是本發明涉及的saGH-TAT融合基因的大腸桿菌，命名為 BL21 (DE3 ) pET-22b (+) -saGH-TAT。D.基因工程菌的制備將質粒pET_22a ( + ) -saGH-TAT轉化到感受態BL21(DE3) CF-, ompT，hsdS (rBB-mB —)，gal, dcm (DE3))中，PCR 鑒定篩選出陽性轉化子，所得陽性克隆即為本發明涉及的能夠表達saGH-TAT的大腸桿菌基因工程菌株BL21 (DE3)pET-22b (+)-saGH-TAT,申請人已于2012年4月20將該菌送至中國典型培養物保藏中心保藏，地址中國武漢武漢大學，保藏編號=CCTCC NO M 2012126，分類命名大腸桿菌BL21(DE3)pET-22b (+) -saGH-TAT,F^ompT hsdSB (rB_mB0 gal dcm(DE3) ,Escherichia coli B L21(DE3) pET_22b (+) -saGH-TAT, F ompT hsdSB (rB mB) gal dcm (DE3)。一種大腸桿菌基因工程菌株BL21 (DE3)pET_22b(+)-saGH-TAT，能夠在常規的大腸桿菌培養基中生長，并具有氨芐抗性，代謝正常，經過IPTG誘導后能大量分泌saGH-TAT蛋白。E.基因工程融合蛋白的制備將上述基因工程菌轉接到2XYT培養基中，融合蛋白saGH-TAT以包涵體的形式高效表達。獲得了基因工程融合蛋白saGH-TAT的大腸桿菌基因工程菌株后經過破碎純化后能夠簡單的與各種飼料混合，直接口服投喂，促進魚體生長。一種大腸桿菌基因工程菌株在促進硬骨魚體(鲇魚、黃顙魚、羅非魚、鯉魚、草魚)生長中的應用，其應用過程是I.促生長實驗選取形體相似的羅非魚苗(Oreochromis Niloticus),隨機分成11組,每組20尾，放入80cmX60cmX20cm的飼養盆中，水溫恒定25°C.每天換一次水。在實驗處理之前讓其在飼養盆中適應I周時間。11組處理如下I)非處理組； 2) O. 7% (w/v)生理鹽水腹腔注射組；3) 5 μ g/g 體重 saGH-TAT 腹腔注射組；4) I μ g/g體重GH-TAT腹腔注射組；5)0. I μ g/g 體重 GH-TAT 腹腔注射組；6) 5 μ g/g體重saGH腹腔注射組；7) I μ g/g體重GH腹腔注射組；8)0. I μ g/g體重GH腹腔注射組；
9) I μ g/g 體重 saGH 口服組；10) I μ g/g 體重 saGH-TAT 口服組；11)0. 7%生理鹽水口服組。每周測體長、體重,處理六周。另外，設定三組口服實驗分別按照體重的10%比例投喂飼料，重組蛋白包封量為
5μ g/g體重。2.耐滲透壓實驗羅非魚先在淡水中喂養，轉入海水之前3天停止給魚喂食。大小相似的魚隨機分 組(2 - 3g)，保證所有實驗組中魚體生長狀況相似。純化的saGH和saGH-TAT溶于自來水中。I)正常魚體對海水海水滲透壓耐受力將羅非魚隨機分成10組，每組5條，將魚放入不同濃度的海水(O, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75，85，100%)中，統計不同大小的羅非魚開始死亡時間和完全死亡時間。2)鲇生長激素(saGH和saGH-TAT)對海水存活力的影響將羅非魚隨機分成4組，每組20條，分別用濃度為2mg/L的saGH，saGH-TAT, BSA水溶液浸泡羅非魚苗2小時和24小時后，直接將羅非魚轉到60%的海水中。統計2小時和24小時浸泡羅非魚苗后在海水中魚苗的存活率。本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果I.本發明制備saGH-TAT融合蛋白能夠增強鹽水的耐受能力，比表達的saGH蛋白在耐滲透壓的能力上更強，可以穿過腸細胞膜而進入血液中，使GH可以不經注射而直接進入血液中，通過血液在魚體內的循環，使其融合蛋白到達不同的組織，增加了 GH的利用效率，同時也提高了藥效。2. 口服添加生長激素(saGH-TAT)飼料，能夠顯著提升魚體增長速率，相比于現有的單純添加生長激素(saGH)，能夠減少至少80%的蛋白用量，節約生產成本。3.本發明提供的融合蛋白saGH-TAT的制備方法，該方法可應用于大規模的養殖業中，表達量大，操作簡單，成本低。


圖I為鲇腦垂體RNA瓊脂糖凝膠電泳圖提取的RNA為3條帶，自上而下分別為28S，18S和5S。圖2-1為一種RT-PCR產物電泳結果示意圖泳道I :DL2000Marker;泳道2-3: RT-PCR產物；泳道4 :陰性對照。獲得了大小570bp左右的條帶。圖2-2 為一種質粒 pET22b (+) -saGH-TAT 構建圖譜將獲得的saGH基因片段連入pMD18T載體中后用PCR將TAT序列連入saGH 3’端，然后連入表達載體pET22b(+)中。圖3 為一種 pET22b (+) -saGH/saGH-TAT PCR 及酶切鑒定示意圖單酶切或雙酶切以及PCR鑒定都能看到目的條帶。
Ml: DIO, 000 ;泳道 I :pET22b (+)-saGH 質粒泳道;2 :pET22b (+)-saGH 質粒 NdeI 單酶切；泳道3: pET22b (+) -saGH 質粒 Ndel/Xhol 雙酶切；泳道 4: pET22b (+) -saGH 質粒Ndel/PstI雙酶切；泳道5: saGH PCR擴增產物泳道6: pET22b (+) -saGH-TAT質粒；泳道7:pET22b (+)-saGH-TAT 質粒 NdeI 單酶切；泳道 8 :pET22b (+)-saGH-TAT 質粒 Ndel/Xhol 雙酶；泳道 9:pET22b(+)-saGH-TAT 質粒 Ndel/PstI 雙酶切泳道 10:saGH_TAT PCR 擴增產物M2 D2000 圖 4 為一種 BL21 (DE3) /pET22b (+) -saGH-TAT 在大腸桿菌中的表達 SDS-PAGE 圖在22kd處和20KD處分別由目的蛋白saGH-TAT和saGH表達。泳道I:蛋白分子量標準(116. O, 66. 2，45. O, 35. O, 25. O, 18. 4，14. 4)；泳道2:BL21(DE3)/pET22b (+)未誘導；泳道 3: ImM IPTG 誘導 BL21 (DE3)/pET22b (+)4 小時菌體；泳道4: ImM IPTG誘導BL21 (DE3) /pET22b (+) 4小時上清；泳道5: ImM IPTG誘導BL21 (DE3) /pET22b (+) 4 小時沉淀；泳道 6: BL21 (DE3) /pET22b (+) -saGH 未誘導；泳道 7: ImM·IPTG 誘導 BL21 (DE3) /pET22b (+) -saGH 4 小時菌體；泳道 8: ImM IPTG 誘導 BL21 (DE3) /pET22b (+) -saGH 4 小時上清；泳道 9: ImM IPTG 誘導 BL21 (DE3) /pET22b (+) -saGH 4 小時沉淀；泳道10:純化saGH蛋白；泳道11: BL21 (DE3) /pET22b (+) -saGH-TAT未誘導；泳道 12: ImM IPTG 誘導 BL21 (DE3) /pET22b (+) -saGH-TAT 4 小時菌體；泳道 13: ImM IPTG誘導 BL21(DE3)/pET22b(+)-saGH-TAT 4 小時上清；泳道 14 lmM IPTG 誘導 BL21(DE3)/pET22b (+) -saGH-TAT 4 小時沉淀；泳道 15:純化 saGH-TAT 蛋白。圖5為一種兔抗saGH IgG純化SDS-PAGE示意圖獲得了大小為55kd的蛋白條帶。泳道I:蛋白分子量標準泳道2:純化IgG泳道3:兔抗血清圖6為一種蛋白質印跡分析圖獲得了單一免疫印跡條帶。泳道I :saGH泳道2: saGH-TAT泳道3:空菌體圖7為一種鲇鰓膜受體與GH結合曲線示意8為一種鲇鰓膜受體與GH-TAT結合曲線示意9為一種鲇腸膜受體與saGH/saGH-ΤΑΤ結合曲線示意10為一種鲇肝膜受體與saGH/saGH-ΤΑΤ結合曲線示意11為一種GH與活性或非活性受體結合實驗示意12為一種魚體重增長柱形圖示意13為一種4周后魚體重增長柱形示意14為8種常見淡水魚GH親緣關系圖
具體實施例方式本實驗所涉及的分子生物學方法為常規方法，為本領域人員所熟悉。本發明中未詳細闡述的請參見《分子克隆實驗指南》J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾等主編。實施例I :制備鲇生長激素基因，其步驟是I. I鲇腦垂體RNA的提取 按照TIANGEN RNA提取試劑盒操作，稍作改動，具體步驟如下 取樣剪開魚頭骨,用鑷子取出腦垂體,重約IOOmg ；
將腦垂體放入加有Iml的TRNzol的Eppendorf管中，用勻衆棒搗碎；將勻漿樣品在20°C放置5min，使得核酸蛋白復合物完全分離；40C 12000rpm 離心 IOmin,取上清；加入O. 2ml氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩15秒，室溫(20_25°C，以下相同)放置3分鐘；40C 12000rpm離心15min，樣品會分成三層黃色的有機相，中間層和上層無色的水相，RNA主要在水相中，把水相(約600 μ I)轉移到新的離心管中。在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置20min ；
4°C 12000rpm離心IOmin,去上清。離心前RNA沉淀經常是看不見的，離心后在管側和管底形成膠狀沉淀；加入Iml 75% (V/V)乙醇(DEPC處理過的水配制)洗滌、沉淀。每使用Iml TRNzol至少Iml 75%乙醇對沉淀進行洗滌；40C 5000rpm離心3min，倒出液體，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液體短暫離心，然后用槍頭吸出；室溫放置晾干(2_3min)，加入30μ lRNase-free ddH20,反復吹打、混勻，充分溶解 RNA。L2RNA 檢測將提取的RNA與Loading Buffer混勻后在I. 5% (Μ/V)的瓊脂糖凝膠，I X TAE電泳緩沖液，5V/cm的條件下電泳30min，紫外燈下觀察RNA提取情況。RNA提取結果如圖I。saGH克隆結果用鲇垂體提取總RNA作為模板，經反轉后，獲得了預期為570bp的DNA片段，如圖2所示。鲇生長激素(saGH) cDNA合成；根據Toyobo公司RT-PCR試劑盒方法進行RNA熱變性
0]igo{dT)2C)(10 pmol/pl)I μ
提取 RNA11 μ!
總體枳12 μ]65°C, 5min,立即置于冰上。反應液配置
權利要求
1.一種分離重組的基因，其特征在于其核苷酸序列為SEQ ID NO. I所示。
2.一種分離重組的融合蛋白，其特征在于其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
3.—種表達權利要求2所述蛋白的大腸桿菌基因工程菌株，其特征在于大腸桿菌{Escherichia coli)BL21(DE3)pET-22b (+) -saGH-TAT,hsdSB(rBmB)gal dcm (DE3)；CCTCC NO M2012126o
4.權利要求2所述融合蛋白的制備方法，其步驟是 A.鲇生長激素基因的制備獲取鲇頭部腦垂體，根據GeneBank中已經發表的鲇科魚類GH的序列設計PCR兼并引物，以上述腦垂體提取的RNA作為模板反轉出cDNA，PCR擴增目的基因saGH，PCR產物通過DNA凝膠電泳檢測，回收PCR產物并將其克隆到pMD18_T載體中，挑取單菌落用堿裂解法小量提取質粒進行酶切鑒定，并進行測序，得到的陽性克隆子即為包含saGH基因的大腸桿菌，用于基因的擴增和保藏； B.通過重疊延伸PCR的方法將TAT33bp堿基連入saGH的3’端構成saGH-ΤΑΤ，將PCR產物組裝入PMD18-T載體，轉化大腸桿菌JM109，挑取單菌落用堿裂解法小量提取質粒進行酶切鑒定，并進行測序，得到的陽性克隆子即為包含saGH-TAT的大腸桿菌，用于基因的擴增和保藏； C.融合基因的制備及表達載體的構建首先雙酶切重組質粒pMD18-T-saGH-TAT和質粒pET-22b ( + )，膠回收含saGH-TAT基因的片段和開環pET-22a ( + )片段，16°C連接后轉化到感受態E. coli中，所得到的陽性克隆子是包含saGH-TAT融合基因的大腸桿菌； D.基因工程菌的制備將步驟C中制得的質粒pET-22a( + ) -saGH-TAT轉化到感受態BL21 (DE3)中，PCR鑒定篩選出陽性轉化子，所得陽性克隆即為本發明涉及的能夠表達saGH-TAT的大腸桿菌基因工程菌株； E.基因工程融合蛋白的制備將上述基因工程菌轉接到2XYT培養基中，融合蛋白saGH-TAT以包涵體的形式高效表達。
5.權利要求2所述融合蛋白在促進硬骨魚體生長中的應用。
6.權利要求2所述的融合蛋白在增強羅非魚耐高滲透壓海水中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種鲇生長激素與穿腸膜肽TAT融合蛋白及制備方法和應用，特別是對于促進硬骨魚類的生長和耐滲透壓上的應用。融合蛋白的制備方法是從活鲇的腦垂體中提取RNA，然后經過RT-PCR獲得包含編碼GH基因成熟肽的cDNA片段,將GH與TAT連接后連入表達載體pET22b(+),在大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)中進行表達,獲得的純化融合蛋白通過投喂，注射或是浸泡等方式都能不同程度的提高魚體生長速率，增強鹽水的耐受能力。本發明相比于單純的使用GH表達蛋白應用于魚體，效果更佳。
文檔編號C12N15/70GK102899342SQ20121018843
公開日2013年1月30日 申請日期2012年6月8日 優先權日2012年6月8日
發明者孟小林, 徐進平, 王健, 于京佑 申請人:武漢凱肽來生物科技有限公司