專利名稱：高活力磷脂酶d及細胞表面展示磷脂酶d酵母全細胞催化劑的制備的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程領域，涉及一種基因的定點突變和重組，尤其是一種高活力磷脂酶D及細胞表面展示磷脂酶D酵母全細胞催化劑的制備。
背景技術：
磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)存在于所有動物、高等植物以及微生物的細胞膜中，是細胞膜磷脂成分之一。PS在動植物和微生物中含量較低，僅占總磷脂的 2-10%。人體中的PS主要集中于大腦，約占大腦磷脂總量的15%。PS在人體內只能少量合成，主要靠從食物中攝取。PS通過直接作用于膜內蛋白質和膜相關蛋白質來調節其受體、 酶、離子通道、信使分子等的活性。PS除了參與調節許多代謝過程(如激活附著于細胞膜上的酶)外，還參與神經信息的傳遞。PS的出現對于由年齡引起的心智退化和老年性癡呆等疾病有著積極的預防作用，可以提高人的感知力和記憶力。因此PS的合成與調節受到人們的廣泛重視。磷脂酰絲氨酸(PQ主要功效包括1、提高大腦機能，改善老年癡呆癥隨年齡增長，PS和其它重要的腦內化學物質會逐漸減少，從而導致記憶力、認知力減弱，補充PS能增加腦突刺數目、腦細胞膜的流動性及促進腦細胞中葡萄糖代謝，從而使腦細胞更活躍；2、幫助修復大腦損傷，PS是腦部神經的主要成分之一，具有營養和活化腦中各種酶的活性，可延緩神經遞質的減少進程，有助于修復、更新大腦受損細胞和清除有害物質；3、緩解壓力，促進用腦疲勞的恢復、平衡情緒。目前工業化生產PS的主流方法是有機溶劑萃取法，存在許多不足1、該方法消耗大量有機溶劑，對環境有一定的危害性；2、大豆中含有多種磷脂成分，各磷脂成分結構相近，性質相似，且PS在含量上相對較少，因此，所提取的PS純度較低，往往含有其他磷脂，如卵磷脂、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺等；3、最后也是最關鍵的問題就是原料中PS的含量較低，即便是應用含有豐富PS的大豆為原料也存在此問題，大豆中的磷脂類物質占大豆總重的1. 6-2%,這其中PS只占0. 5-1 %，即每千克大豆中只含有80-200mgPS，在加上分離純化的成本，因此造成產物的價格持續走高。因此PS的制備方法，已成為進行PS應用開發的瓶頸問題。隨著人們對健康意識的提高和我國人口老齡化的發展趨勢，PS必將受到廣泛關注，國外對于PS藥物的開發應用已有發展，而我國則剛剛起步。如果能改進生產工藝，利用酶法催化合成PS，將以低價格、高純度、多功效、無毒副作用等諸多優勢用于治療和大腦有關的疾病，在醫藥領域擁有廣闊的前景。由于傳統有機溶液萃取方法存在不足，生產效率極低，人們開始研究PS的合成新方法。磷脂酶DbhospholipaseD，簡稱PLD) (EC3. 1. 4. 4)，屬催化磷酸二脂酯鍵水解和堿基交換反應的一類酶的總稱，分布在從細菌到高等動植物的許多生物類群中，其主要生理功能是參與細胞脂質代謝，信號轉導及生物膜形成等。近年來，利用磷脂酶D的堿基交換反應特性進行磷脂改性以及制備單一磷脂和稀有磷脂取得重大進展。因此，磷脂酶D的研究工作越來越受到人們的關注。磷脂酶D的研究已開展了近五十年，取得了顯著成效。但距工業生產的需要，特別是與其他酶生產和應用相比，存在很大的差距，尤其是我國在這方面的研究工作幾乎是空白。究其原因，主要有以下幾點1.酶源狹窄且在生物體內含量極微，提純相當困難；2.酶的穩定性差且只能在異相系統中作用；3.該酶在生物體內的功能及作用機理尚未完全搞清，其應用范圍不廣。近年來，磷脂酶D在磷脂改性及制備稀有磷脂等方面展現出巨大的潛力和優勢又引發了人們新的研究興趣，特別是高產磷脂酶D菌種的選育，酶的作用機理及工業應用研究已成為當前的研究重點和方向。游離磷脂酶D穩定性差，無法回收利用，酶的固定化技術雖然可以解決以上問題， 但是傳統的固定化方法也會產生一些不利因素，例如，固定化過程可能造成酶的活性收率損失；另外，由于固定化操作需用載體，因而增加了載體成本費和固定化操作費用，而酵母細胞表面展示技術為酶的固定化提供了一種新的基于基因重組技術的生物學方法。酵母細胞表面展示技術是近年來發展較快的一種真核蛋白表達系統，其基本原理是將外源靶蛋白基因(外源蛋白)與特定的載體基因序列融合后導入酵母細胞，利用酵母細胞內蛋白轉運到膜表面的機制，使靶蛋白固定化表達在酵母細胞表面。目前，最常見的酵母表面展示表達系統包括凝集素展示表達和絮凝素展示表達，通過酵母表面展示表達技術，將目標蛋白或酶固定化在酵母細胞表面，能夠提高酶的穩定性和重復利用性，而無需對蛋白進行復雜的分離純化。目前多種酶類包括脂酶、生物素連接酶、有機磷水解酶、羧酸酯酶、差向異構酶、環糊精葡聚糖轉化酶、淀粉酶、纖維素酶等被成功地展示表達在酵母細胞表面且具有生物活性。

發明內容
本發明的目的在于提供一種酶活力較高的高活力磷脂酶D及細胞表面展示磷脂酶D酵母全細胞催化劑的制備方法。本發明實現目的技術路線如下一種高活力磷脂酶D，高活力磷脂酶D的氨基酸序列是通過分別使如序列7的核苷酸序列編碼的野生型磷脂酶D氨基酸序列中GlU69、kr285的氨基酸位點替換，得到如序列 8的核苷酸序列，序列8經在畢赤酵母細胞表面高效表達后獲得高活力磷脂酶D。而且，所述野生型磷脂酶D來源是色褐鏈霉菌AS 4. 331。一種細胞表面展示磷脂酶D畢赤酵母工程菌，其構建過程包括以下步驟(1)定點突變野生型磷脂酶D的成熟肽基因，得到高活力磷脂酶D基因；( 將高活力磷脂酶D基因序列與載體相連，得到攜帶高活力磷脂酶D基因的重組載體；(3)將重組載體轉化入宿主菌株畢赤酵母中，得到細胞表面展示磷脂酶D的畢赤酵母工程菌。而且，所述的重組載體為畢赤酵母展示載體pPIC9K_Flo。
而且，所述的宿主細胞為畢赤酵母GS115。一種細胞表面展示高活力磷脂酶D的畢赤酵母全細胞催化劑，其特征在于使用的酵母工程菌為細胞表面展示磷脂酶D酵母工程菌。而且，制備過程包括以下步驟(1)將培養于YPD瓊脂固體平板上的酵母工程菌接種至YPD液體培養基中，30°C、 250r/min培養Mh，以(m/m)的接種量轉接到新鮮BMGY培養基中，30°C、250r/min培養 24h,然后在4°C、8000r/min離心IOmin得到菌體，轉入BMMY培養基中，30°C、250r/min培養 5d，每隔24h加入終濃度為0. 5% V/V甲醇誘導產酶。(2)然后收集發酵液，離心，取菌體沉淀，用雙蒸水洗2次，最后用少量雙蒸水重懸，加保護劑，通過真空冷凍干燥得到全細胞催化劑干粉。本發明的優點和有益效果為1、本發明使用重疊PCR技術，對野生型磷脂酶D進行定點突變(Gly69Glu、 Ser285Ala)，構建酵母表面展示載體pPIC9K-Flo-pldm，轉化畢赤酵母，使磷脂酶D展示在酵母表面，高活力磷脂酶D在37°C下，比野生型磷脂酶D活力提高了 11 %，。2、本發明采用酵母展示系統，將磷脂酶D展示于酵母表面，酵母細胞既作為酶的生產者，又可以充當固定化酶中的載體，免去了酶的純化和固定等操作，簡化了生產環節， 降低了生產成本，使酵母展示技術成為酶法催化卵磷脂生成磷脂酰絲氨酸的一個極具潛力的發展方向。3、本發明的磷脂酶D催化反應是在兩相系統中進行的，對于游離酶來講，有機溶劑常常降低其在非水相催化中的活力，展示酶有力地改善了上述缺點。4、本發明提高了磷脂酶D的活力，并將其展示在畢赤酵母細胞表面，提高其穩定性，具有固定化酶的優點，經檢測高活力磷脂酶D酶活較野生型提高11 %，重組菌株GSl 15/ pPIC9K-Flo-pldm高密度發酵制備的全細胞催化劑酶活為120U/(g ·干細胞)。


圖1為本發明的磷脂酶D成熟肽基因PCR擴增產物電泳圖(其中1為DNA Marker, 2為以色褐鏈霉菌基因組DNA為模板經PCR擴增到的磷脂酶D成熟肽基因)；圖2為本發明pPIC9K-Flo-pldm質粒的構建過程；
具體實施例方式下面結合實施例對本發明的技術內容做進一步說明；下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發明的保護范圍。一、野生型磷脂酶D成熟肽基因的獲得1、野生型磷脂酶D成熟肽基因來自色褐鏈霉菌(AS 4. 331)，購于中科院微生物研究所，提取其基因組DNA。其中色褐鏈霉菌基因組DNA的提取步驟如下(1)將培養至對數期的菌液取lmL，12000r/min離心Imin收集菌體。(2)將菌體懸浮于90 μ L ddH20中，加50mg/mL溶菌酶10 μ L，充分混勻后37°C水浴保溫20min。
(3)加入400 μ L裂解液混勻至產生大量泡沫，補加5mol/L NaCl 200 μ L，輕輕顛倒混勻，1200r/min 離心 IOmin0(4)上清轉移至另一 Ep管中，加1/2體積苯酚和1/2體積氯仿，溫和混勻。12000r/ min 離心 3min。(5)取上清，加入1/2體積的苯酚、氯仿反復抽提，離心，吸上清，重復此步驟直到兩相界面看不到白色物質為止。(6)加入等體積的氯仿進行抽提，離心，吸上清。(7)用兩倍體積的無水乙醇-70°C沉淀DNA大約30min，12000r/min離心8min， 200 μ L70%乙醇洗滌兩次，12000r/min離心5min，室溫晾干。(8) DNA 溶于 2O μ LddH2O 中 _20 "C 短期保存。2、根據已報道磷脂酶D成熟肽基因，分析其保守序列，設計本發明的磷脂酶D成熟肽基因的擴增引物如下上游Pl CCGACGCGTGCCGACCAGGCGCCCGCCTTCCT (下劃線部分為 MluI 酶切位點)下游Ρ2 :CCGGAATTCctacttatcgtcgtcatccttgtaatcCACGGGGTCGTAGGTGCGC (下劃線部分為EcoRI酶切位點，小寫為flag標簽)擴增模板為色褐鏈霉菌基因組DNA，其擴增的反應條件為95°C 5min;94°C lmin，60°C lmin40s，72°C lmin，30 個循環；72°C延長 IOmin ；擴增體系50μ L :ddH20 7. 5 μ L, 2 X buffer 25 μ L, dNTPs 5mmol/L，上游引物 10 μ mol/L 5 μ L，下游弓丨物 10 μ mol/L 5 μ L, DNA 模板 2 μ L, LA TaqDNA 聚合酶 0. 5 μ L ；PCR擴增產物經0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，得到1500bp左右的條帶(圖1)，用小量 DNA回收試劑盒回收PCR產物，得到本發明的野生型磷脂酶D成熟肽基因pld，見序列7。二、高活力磷脂酶D基因獲得。(1)野生型磷脂酶D基因連接入T載體。將PCR擴增得到的目的基因進行純化，將其連入T載體，利用電轉化法將該重組質粒轉入大腸桿菌JM109中，EcoRI、MluI雙酶切和PCR驗證結果表明野生型磷脂酶D基因已成功克隆到T載體上。將其測序可知擴增到磷脂酶D基因序列，見序列7。(2)定點突變基于重疊PCR技術進行定點突變，構建高活力磷脂酶D基因。Gly69 — Glu、 Ser285 — Ala設計引物如下上游CCGACGCGTGCCGACCAGGCGCCCGCCTTCCT (下劃線部分為 MluI 酶切位點)下游CCGGAATTCctacttatcRtcRtcatccttRtaatcCACGGGGTCGTAGGTGCGC(下劃線部分為EcoRI酶切位點，小寫為flag標簽)重疊弓丨物 P3 :5，-cacgcgccgagagcgaccacacc-3，重疊弓丨物 P4 :5，-ggtgtggtcgctctcggcgcgtg-3，重疊弓丨物 P5 :5，-caggccgccacggccagcggt-3，重疊弓丨物 P6 :5，-accgctggccgtggcggcctg-3，在上游引物和下游引物5’端分別引入MluI和EcoRI酶切位點。重疊引物P3與重疊引物P4互補，重疊引物P5與重疊引物P6互補。重疊引物P3與P4中包含了對69位氨基酸殘基的突變。而重疊引物P5與P6中則包含了對285位氨基酸殘基的突變。Gly69 — Glu用引物PI、P4擴增上游片段pldl，P3、P2擴增下游片段pld2。PCR反應體系包括2 Xbuffer 25 μ L, dNTP 2 μ L，上游引物P1、P3/下游引物P2、 P4各5yL，重組質粒pUC-T-pld IOOng, LA Taq DNA聚合酶0. 5 μ L，無菌去離子水補充至 50 μ L0PCR擴增條件為94 V預變性5min，共1個循環；94 °C變性lmin，60°C退火 lmin40s，72°C延伸lmin，共30個循環；72°C延伸lOmin，共1個循環。PCR產物切膠回收，適當稀釋。以pldl、pld2為引物，進行PCR。PCR反應體系為 2Xbuffer25y L, dNTP 2 μ L, pldl、pld2 各 1 μ L，LA Taq DNA 聚合酶 0· 5 μ L，無菌去離子水補充至48 μ L。PCR擴增條件為94°C預變性5min，1個循環；94°C變性lmin，60°C退火 lmin40s，72°C延伸lmin，5個循環；加入引物P1、P2各1 μ L，進行PCR，PCR擴增條件為-MV 預變性5min, 1個循環；94°C變性lmin，60°C退火lmin40s，72°C延伸lmin, 30個循環；72°C 延伸lOmin，共1個循環。對PCR反應液進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的DNA片段。得到Gly69 — Glu 的磷脂酶D突變體。Ser285 — Ala用磷脂酶D突變基因Gly69 — Glu為模板，引物P1、P6擴增上游片段pld3，P5、P2 擴增下游片段Pld4。PCR反應體系包括2 Xbuffer 25 μ L, dNTP 2 μ L，上游引物P1、P3/下游引物P2、 P4各5 μ L，磷脂酶D突變基因Gly69 — Glu 2 μ L, LA Taq DNA聚合酶0. 5 μ L，無菌去離子水補充至50 μ L0PCR擴增條件為94 V預變性5min，共1個循環；94 °C變性lmin，60 °C退火 lmin40s，72°C延伸lmin，共30個循環；72°C延伸lOmin，共1個循環。PCR產物切膠回收，適當稀釋。以pld3、pld4為引物，進行PCR。PCR反應體系為 2Xbuffer25y L, dNTP 2 μ L, pld3、pld4 各 1 μ L, LA Taq DNA 聚合酶 0. 5 μ L，無菌去離子水補充至48 μ L。PCR擴增條件為94°C預變性5min，l個循環；94°C變性lmin，60°C退火 lmin40s，72°C延伸lmin，5個循環；加入引物P1、P2各1 μ L，進行PCR，PCR擴增條件為-MV 預變性5min, 1個循環；94°C變性lmin，60°C退火lmin40s，72°C延伸lmin, 30個循環；72°C 延伸lOmin，共1個循環。對PCR反應液進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的DNA片段。得到 Gly69 — Glu、Ser285 — Ala的高活力磷脂酶D基因ρIdm,見序列8。三、磷脂酶D基因工程菌的構建1、重組質粒pPIC9K-Flo-pldm的構建與鑒定將重疊PCR純化產物與載體pPIC9K_Flo經MluI和EcoRI雙酶切后，分別用小量 DNA回收試劑盒回收酶切產物，應用DNA連接試劑盒的Solution I在16°C的條件下連接 12h，將高活力磷脂酶D基因定向連接至載體pPIC9K-Flo，將連接產物應用化學轉化法轉化到E. coliDH5a感受態中，在含有Amp的LA培養基中篩選培養，挑取陽性轉化子，培養后提質粒，用MluI和EcoRI雙酶切鑒定，測序，命名為pPIC9K-Flo-pldm。
其中大腸桿菌化轉感受態的制備方法(1)從大腸桿菌平板上挑取一個單菌落，接種于2mL LB培養基試管中，37 °C 180r/min搖床培養過夜；(2)取500yL菌液轉接到一個含有50mL LB培養基的250mL錐型瓶中，37 °C 180r/min搖床培養2 3h。(3)將菌液轉移到50mL離心管中，冰上放置IOmin ；(4)4°C,4000r/min離心lOmin，回收菌體細胞，倒出培養液，將管倒置lmin，以便
液體培養基流盡；(5)用冰冷的0. ImoVLCaCl2溶液IOmL懸浮沉淀，立即放在冰上保溫30min ；(6) 4°C、4000r/min 離心 lOmin，回收菌體細胞；(7)用冰冷的0. ImoVLCaCl2和15%的甘油混合液2mL重懸細胞；(8)分裝細胞，每份50 μ L，即得到感受態細胞。其中重組質粒pPIC9K-Flo-pldm化學轉化E. coli DH5 α感受態的具體步驟為(1)加入IOyL質粒DNA連接產物于100 μ L感受態中，充分混勻；(2)冰上放置 30min，42°C水浴 90s ；(3)冰上放置1 2min ；(4)將感受態細胞加入800 μ LLB培養基中，搖床37°C，180r/min復蘇培養Ih ；(5)復蘇培養后，取菌液8000r/min離心2min，吸掉1/3上清液后，將菌體重懸，涂布于Amp抗性平板，37°C倒置培養12 16 ；2、畢赤酵母GS115基因工程菌的構建將測序正確的重組質粒經MlI線性化后，LiCl法轉化畢赤酵母GS115，MD平板篩選重組子，挑取陽性轉化子，進行誘導表達。其中畢赤酵母GS115感受態的制備方法為(1)在YPD平板上劃線培養，挑取單菌落，接種于50mLYPD液體培養基中，30°C， 250r/min 振蕩培養至 OD600 = 0 . 8 1. 2。(2)收集菌體細胞，用30mL的無菌水沖洗3次，4°C，5000r/min離心lOmin。(3)除凈無菌水后用ImL 0. lmol/L的LiCl輕輕重懸菌體細胞。(4)在超凈工作中將菌體細胞懸濁液轉移至1. 5mL無菌的離心管中。(5)室溫12000r/min離心lmin，沉淀菌體細胞并用無菌槍頭除凈LiCl。(6)加入400 μ L 0. lmol/L的LiCl重懸菌體細胞。(7)將50 μ L的細胞懸濁液分裝到1. 5mL的無菌離心管中。其中重組質粒pPIC9K-Flo-pldm化學轉化GS115感受態的具體步驟為(1)煮沸單鏈DNA5min，快速置于冰上冷卻。(2)取新制備的感受態細胞12000r/min離心IOmin除凈LiCl。(3)將每個轉化的樣品按順序加入以下試劑240μ 40%的PEG，36yL IM LiCl，10μ LDNA。(4)劇烈渦旋細胞沉淀至其完全混勻(大約需:3min左右)。(5)在30°C的水浴中靜止放置30min。(6)在42°C的水浴中熱擊20 25min。
8
(7)30°C，6000r/min 離心 5min，除凈上清溶液。(8)用0. 5mL的無菌水重懸菌體細胞沉淀。(9)在MD平板上均勻涂布100 300 μ L的重懸細胞溶液，在30°C倒置培養48 96h。其中誘導表達的具體方法為將重組畢赤酵母pPIC9K-Flo-pldmGS115接種于20mL含有0. 5%甘油的BMGY培養基中，28°C，250r/min振蕩培養Mh，然后每隔24h向培養基中加入終濃度0. 5% (V/V)的甲醇，繼續在，250r/min條件下振蕩培養120h。四、全細胞催化劑的制備及其水解活力的測定1、全細胞催化劑的制備(1)將培養于YPD瓊脂固體平板上的畢赤酵母重組菌株接種至YPD液體培養基中， 30°C、250r/min培養Mh，以的接種量轉接到新鮮BMGY培養基中，30°C、250r/min培養 24h,然后在4°C、8000r/min離心IOmin得到菌體，轉入BMMY培養基中，30°C、250r/min培養 5d，每隔24h加入終濃度為0. 5% (V/V)甲醇誘導產酶。(2)然后收集發酵液，離心，取菌體沉淀，用雙蒸水洗2次，最后用少量雙蒸水重懸，加保護劑，通過真空冷凍干燥得到全細胞催化劑干粉。2、全細胞催化劑水解活力的測定采用酶聯比色法進行活性檢測磷脂酶D催化水解L-α -卵磷脂生成膽堿，膽堿在膽堿氧化酶的作用下生成過氧化氫，過氧化氫在過氧化酶的作用下與4-氨基氨替比林和苯酚生成醌亞胺顯色物質，在A = 500nm下具有吸光值。反應體系將220mg的L- α -卵磷脂溶于含有3mL 50mM的SDS溶液、6mL IM NaOAc緩沖液(pH = 8. 0)、39mL的去離子水、 0. 272mL17. 9%的乙醇溶液(終濃為)的混合體系作為底物溶解液。將39mg 4-氨基氨替比林、80mg苯酚及8mg過氧化物酶溶于5. 5mL的IOOmM Tris HCl (pH = 8)緩沖液中作為膽堿顯色劑。取2. 4mL底物溶液、0. 3mL的500mM CaCl2溶液、0. 2mL的去離子水混合并置于 37°C水浴。然后加入0. ImL的酶液，混合均勻，于37。C反應lOmin，沸水浴終止反應，待冷卻至室溫加入0. 05mL 2M Tris-HCl (pH = 9)緩沖液，混合并離心后，上清液用0. 45 μ m微孔濾膜過濾，取濾液2mL與0. ImL膽堿顯色劑、0. ImL膽堿氧化酶溶液室溫反應2.證。在反應混合物中加入2. OmL去離子水，離心得到澄清透亮的粉紅色溶液，最后于A5tltlnm檢測吸光值。 酶活定義pH = 8.0、T = 37°C時，磷脂酶D Imin內催化水解L-α -卵磷脂釋放l.Oymol 的膽堿所需要的酶量。測得表面展示高活力磷脂酶D的全細胞催化劑酶活為120U/(g·干細胞)，較野生型磷脂酶D提高了 11%。SEQUENCE LISTING<110>天津科技大學<120>高活力磷脂酶D及細胞表面展示磷脂酶D酵母全細胞催化劑的制備<130>2011-07-14<160>8<170>PatentIn version 3.3<210>1
<211>32<212>DNA<213>P1上游引物序列<400>1ccgac gcgtg ccgac caggc gcccg ccttc ct32<210>2<211>52<212>DNA<213>P2下游引物序列<400>2ccgga attcc tactt atcgt cgtca tccttgtaat ccacg gggtc gtagg tgcgc 55<210>3<211>23<212>DNA<213> 引物序列 P3<400>3cacgc gccga gagcg accac acc 23<210>4<211>23<212>DNA<213> 引物序列 P4<400>4ggtgt ggtcg ctctc ggcgc gtg 23<210>5<211>21<212>DNA<213> 引物序列 P5<400>5caggc cgcca cggcc agcgg t21<210>6<211>21<212>DNA<213> 引物序列 P6<400>6accgc tggcc gtggc ggcct g21<210>7<211>1533<212>DNA<213>野生型磷脂酶D成熟肽基因0169]<400>70170]gccgaccaggCgCCCgCCttcctgcacggc0171]gtcctgctgtggacccgggtgaccccggtg0172]ccggacaccgaggtcggctgggtcgtcgcc0173]aagggctcgaccaccgcacgcgccgggagc0174]CtggCCCCggccaccgactactggttccgc0175]gcgcgcacccgcaccgcgccggcggcggac0176]gtgtcctgcgccaactgggaggcgggctac0177]aacgacctggacgcctggctgcacctcggc0178]tacgcggcccggggcaccgtCgtgCggCCg0179]gccgactaccgcacccggcacgccaagtac0180]ctgaaggcgccggtcatcgcgatctgggac0181]ggcggcgcggtgaaccacaccgagggcgcc0182]gccaagcaggcctacttcgagtggatgccg0183]CggCggCtgCgcttcggcaagctcgccgac0184]tcccagcaggcctccacggccagcggttcg0185]cgcgcgcagctcgactggctcaaggccggc0186]gtcggcaactccgtgatgatctcgccgttc0187]aagccgctcgccaagctgctgggcctgccg0188]tgggacggctacaccgacgaccggcgcgaa0189]ggcaacaccgtcttcctgaccggtgacatc0190]gacgcgggcacctatccgctgtcggcgtcc0191]acctccgacaacctcgacgacatcgtgaag0192]tcgccggtcatcaaggccgccaaccggcac0193]tacggcgtgctggacatcaccgccgaccgc0194]cgcaccgacgcgaacgcgacCtCggCgtgg0195]cagcgggtagagcgcacctacgaccccgtg0196]<210>80197]〈211>15330198]<212>DNA0199]〈213〉高活力磷脂酶D基因0200]〈400>80201]gccgaccaggCgCCCgCCttcctgcacggc0202]gtcctgctgtggacccgggtgaccccggtg0203]ccggacaccgaggtcggctgggtcgtcgcc0204]aagggctcgaccaccgcacgcgccgagagc0205]CtggCCCCggccaccgactactggttccgc0206]gcgcgcacccgcaccgcgccggcggcggac0207]gtgtcctgcgccaactgggaggcgggctac
gtcgcctccggtgacccgctgcccgacggc60cccgaggcgatacccggctccggagtgggc120cgcgacaaggcgttcaccgacgtcgtcgcc180gaccacaccgtcaaggccgacatccgcggc240ttcacggccggcggcacggactccccggtg300gcggcggtgtcctccctgcgcttcggcgtg360ttcgccgcctaccgccacctCgCggCCCgC420gactacatctacgagtacaagtccggcgag480cacgcgccggccaacgagatcctcaccctc540aagaccgaccccgacctgcaggccctgcac600gaccacgagttcgccgacaacgcctggtcc660gagggcacctggtcggcccgtcaggccgcc720gtgcgccccgccatcgccggcaccacctac780ctctccctgctggacctgcgctccttccgc840gtggacgacccggaccgtacgctcaccggc900ctgaaggcctccgacaccaggtggcggctg960gccgtcggctcactctccgccgacctgctc1020caggagggcatcgccgtcaacacgacccag1080ctcctcgcccacctgcgctcgaacgccatc1140cacatggcgtgggccaacgaCgtgCCggtg1200gcggccaccgagttcgtggtcacgtcggtc1260gtgcccgagggcaccgtctcggccgtcgcc1320gtccactgggtggacaccgaccggcacggc1380gcgcagatggactactacgtgctgtccgac1440gtgcggtcgtaccgcacgcgcagcggcacg1500tag1533
gtcgcctccggtgacccgctgcccgacggc60cccgaggcgatacccggctccggagtgggc120cgcgacaaggcgttcaccgacgtcgtcgcc180gaccacaccgtcaaggccgacatccgcggc240ttcacggccggcggcacggactccccggtg300gcggcggtgtcctccctgcgcttcggcgtg360ttcgccgcctaccgccacctCgCggCCCgC420
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1.一種高活力磷脂酶D，其特征在于高活力磷脂酶D的氨基酸序列是通過分別使如序列7的核苷酸序列編碼的野生型磷脂酶D氨基酸序列中GlU69、kr285的氨基酸位點替換， 得到如序列8的核苷酸序列，序列8經在畢赤酵母細胞表面高效表達后獲得高活力磷脂酶 D0
2.根據權利要求1所述的高活力磷脂酶D，其特征在于所述野生型磷脂酶D來源是色褐鏈霉菌AS 4. 331。
3.一種細胞表面展示磷脂酶D畢赤酵母工程菌，其特征在于其構建過程包括以下步驟(1)定點突變野生型磷脂酶D的成熟肽基因，得到高活力磷脂酶D基因；(2)將高活力磷脂酶D基因序列與載體相連，得到攜帶高活力磷脂酶D基因的重組載體；(3)將重組載體轉化入宿主菌株畢赤酵母中，得到細胞表面展示磷脂酶D的畢赤酵母工程菌。
4.根據權利要求3所述的細胞表面展示磷脂酶D畢赤酵母工程菌，其特征在于所述的重組載體為畢赤酵母展示載體pPIC9K-Flo。
5.根據權利要求3所述的細胞表面展示磷脂酶D畢赤酵母工程菌，其特征在于所述的宿主細胞為畢赤酵母GS115。
6.一種細胞表面展示高活力磷脂酶D的畢赤酵母全細胞催化劑，其特征在于使用的酵母工程菌為細胞表面展示磷脂酶D酵母工程菌。
7.根據權利要求6所述的細胞表面展示高活力磷脂酶D的畢赤酵母全細胞催化劑，其特征在于制備過程包括以下步驟(1)將培養于YPD瓊脂固體平板上的酵母工程菌接種至YPD液體培養基中，30°C、250r/ min培養Mh，以的接種量轉接到新鮮BMGY培養基中，30°C、250r/min培養Mh，然后在 4°C、8000r/min離心IOmin得到菌體，轉入BMMY培養基中，30°C、250r/min培養5d，每隔24h 加入終濃度為0. 5% V/V甲醇誘導產酶。(2)然后收集發酵液，離心，取菌體沉淀，用雙蒸水洗2次，最后用少量雙蒸水重懸，加保護劑，通過真空冷凍干燥得到全細胞催化劑干粉。
全文摘要
本發明涉及一種高活力磷脂酶D及細胞表面展示磷脂酶D酵母全細胞催化劑的制備，屬于用重組DNA技術定點突變野生型磷脂酶D，以改善其活性，并將突變后基因與酵母展示載體pPIC9K-Flo連接，將其在畢赤酵母細胞表面高效展示的方法，涉及具有高活力磷脂酶D及表面展示磷脂酶D酵母全細胞催化劑的制備方法。本發明提高了野生型磷脂酶D的活力，并將其展示在酵母細胞表面，提高其穩定性，具有固定化酶的優點。其技術方案是從微生物特別是色褐鏈霉菌中分離野生型磷脂酶D基因，對其Glu69、Ser285的氨基酸殘基進行突變，經在畢赤酵母細胞表面高效表達，檢測高活力磷脂酶D酶活較野生型磷脂酶D提高11％，重組菌株GS115/pPIC9K-Flo-pldm高密度發酵制備的全細胞催化劑酶活為120U/(g·干細胞)。
文檔編號C12N9/16GK102286440SQ20111020648
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月22日 優先權日2011年7月22日
發明者劉逸寒, 王建玲, 王春霞, 薄嘉鑫, 路福平 申請人:天津科技大學