專利名稱：條石鯛性別特異分子標記及其遺傳性別鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)領(lǐng)域中的魚類分子標記和遺傳性別鑒定技術(shù)，尤其涉及一種條石鯛性別特異分子標記及其遺傳性別鑒定方法。
背景技術(shù)：
我國有著豐富的魚類資源，其中許多魚類在生長速率上存在性別差異，如，羅非魚、鯉魚、牙鲆、半滑舌鰨等魚類。因此，開展這些魚類性別相關(guān)基因及性別特異分子標記的研究具有很高的理論指導意義。條石鯛隸屬于鱸形目(Perciformes)、石鯛科 (Oplegnathidae)、石鯛屬(Oplegnathus)，自然分布于太平洋和印度洋沿岸，我國產(chǎn)于黃海、東海和臺灣海峽，是一種暖溫性海洋中下層魚類。它生長速度快、肉質(zhì)鮮美、抗病力強、 色澤艷麗，具有較高的食用價值和觀賞價值。尤其是近年來，條石鯛的人工繁育獲得成功， 其養(yǎng)殖也迅速在我國開展起來。在人工繁育及選擇育種過程中，為了獲得優(yōu)質(zhì)的苗種必須做好親魚選擇的雌雄篩選。條石鯛第一次性成熟需要3 4年，在幼苗時期無法通過外觀形態(tài)辨別其性別特征。因此，建立一種性別的快速鑒定方法用于幼苗的性別鑒定，不僅對于研究條石鯛的性別決定機制具有很高的理論價值，而且對于其定向選擇育種具有重要的指
眉、οAFLP技術(shù)是可以快速篩選性狀相關(guān)分子標記的有效方法，應(yīng)用AFLP技術(shù)在某些動物的基因組中尋找性別標記已有成功報道。英國Mirling大學的肚擬等Q004)用AFLP 技術(shù)掃描尼羅羅非魚基因組，找到三個Y染色體連鎖(0niY425、0niY382、0niY227)和一個 X染色體連鎖(0niX420)的AFLP標記，其中0niX420和0niY425證明為等位基因，然而這些標記卻不能鑒別沒有親緣關(guān)系的個體的性別，達不到鑒定羅非魚遺傳性別的水平。在虹鱒中，F(xiàn)elip等(2005)利用AFLP技術(shù)篩選到15個性別相關(guān)標記，其中，Omy-163為Y染色體連鎖的標記，將其轉(zhuǎn)化為SCAR標記，建立了虹鱒的遺傳性別快速鑒定方法。國內(nèi)學者Chen 等Q007)利用AFLP技術(shù)在半滑舌鰨中篩選到7個雌性特異的標記，將其中的5個轉(zhuǎn)化為 SCAR標記，建立快速鑒定其遺傳性別的PCR方法。由于不同魚類之間存在著很大差異，一種魚類的性別特異分子標記不能在另一種魚類上應(yīng)用，因此必須建立不同魚類各自的性別特異分子標記。有關(guān)條石鯛性別特異分子標記及遺傳性別檢測技術(shù)，目前國內(nèi)外均未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中不易鑒定條石鯛幼魚的缺陷，本發(fā)明提供了一種條石鯛性別特異分子標記及其遺傳性別鑒定方法，本發(fā)明篩選出了條石鯛性別特異分子標記，并在此特異分子標記基礎(chǔ)上建立了遺傳性別鑒定方法，為條石鯛的定向育種提供理論和技術(shù)上的指導。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)本發(fā)明提供了 4個條石鯛性別特異AFLP分子標記，所述分子標記的引物序列如下
(1)5， -GACTGCGTACCAATTCACA-3，；5 ’ -GATGAGTCCTGAGTAACAT-3’，用所述引物序列擴增出特異AFLP標記經(jīng)克隆測序如SEQ ID NO=I所示。(2)5' -GACTGCGTACCAATTCAGA-3'；5 ’ -GATGAGTCCTGAGTAACTT-3’，用所述引物序列擴增出特異AFLP標記經(jīng)克隆測序如SEQ ID NO 2所示。(3)5' -GACTGCGTACCAATTCATC-3'；5 ’ -GATGAGTCCTGAGTAACGT-3’，用所述引物序列擴增出特異AFLP標記經(jīng)克隆測序如SEQ ID NO 3所示。(4)5， -GACTGCGTACCAATTCATG-3，；5 ’ -GATGAGTCCTGAGTAACTT-3’。用所述引物序列擴增出特異AFLP標記經(jīng)克隆測序如SEQ ID NO 4所示。本發(fā)明還提供了 SCAR分子標記，根據(jù)SEQ ID NO :1序列設(shè)計引物進行PCR擴增獲得，其引物序列為Op 1240-1 :5，AGACCAAGATCAGGAGCGAAT3，；Op 1240-2 :5，GGAGCATCCCATCCATTCT3，。用所述引物在雄魚基因組中擴增出MObp的DNA條帶，在雌魚基因組中沒有擴增條帶。本發(fā)明還提供了一種用所述條石鯛性別特異分子標記的遺傳性別鑒定方法，它包括以下步驟(1)采集待測的條石鯛的基因組DNA ；(2)用所述SCAR標記的引物對條石鯛基因組DNA進行PCR擴增，擴增得到240bp 的條帶所對應(yīng)的為雄性個體，沒有擴增條帶所對應(yīng)的為雌性個體。對技術(shù)方案的進一步改進所述步驟(1)中采集條石鯛的鰭條提取基因組DNA。對技術(shù)方案的進一步改進所述步驟(1)中所述的基因組DNA的濃度為50 200ng/y L，基因組DNA的純度要求0擬60/0D280值為1. 76 1. 80。對技術(shù)方案的進一步改進所述步驟O)中的PCR反應(yīng)的體系為DNA模板50 200ng,上下游引物濃度 0. 4 μ M，dNTP 濃度為 0. ImM, 1 X PCRbuffer,MgCl2 濃度為 1. 5mM, Taq 酶1. 25U，補充雙蒸水至終體積25 μ L0對技術(shù)方案的進一步改進所述步驟( 中的PCR擴增程序為94°C預(yù)變性5min， 94°C變性30S，56°C退火30s，72°C延伸60s，共；35個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是(1)本發(fā)明采用AFLP方法首次篩選到條石鯛性別特異的分子標記，并將其轉(zhuǎn)化為 SCAR標記，建立條石鯛遺傳性別的鑒定方法，本發(fā)明所述分子標記可以無損傷地鑒別條石鯛的遺傳性別。(2)本發(fā)明所提供的遺傳性別鑒定方法具有準確、靈敏、可靠等優(yōu)點，不僅對魚類性別機制研究具有重要的科學價值，而且為魚類性別控制和選擇育種具有重要的意義和應(yīng)用價值。結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的具體實施方式
后，本發(fā)明的其他特點和優(yōu)點將變得更加清林疋。


圖1是引物組合E35M50產(chǎn)生的雄性特異條帶0pl286，其中1 15為雌性個體， 16 30為雄性個體。圖2是引物組合E39M62產(chǎn)生的雄性特異條帶0pl237，其中1 18為雌性個體， 19 38為雄性個體。圖3是引物組合E44M58產(chǎn)生的雄性特異條帶0pl423，其中1 20為雌性個體， 21 40為雄性個體。圖4是引物組合E45M62產(chǎn)生的雄性特異條帶0pl2^，其中1 13為雌性個體， 14 沈為雄性個體。圖5是引物0pl240_l和0pl240_2在雌性個體和雄性個體基因組中的PCR擴增結(jié)果，其中1-9為雌性個體，10-18為雄性個體，M為DL2000marker。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細的說明。實施例1下面本發(fā)明對條石鯛性別特異AFLP分子標記的篩選及遺傳性別鑒定方法的建立進行詳細說明。篩選條石鯛的性別特異分子標記并建立遺傳性別快速鑒定方法的技術(shù)方案具體包括條石鯛性別特異分子標記的篩選，性別特異分子標記的序列分析，條石鯛遺傳性別鑒定方法的建立。以下對本發(fā)明的技術(shù)方案作更進一步的闡述。—、條石鯛性別特異分子標記的篩選包括1、提取條石鯛鰭條的基因組DNA，2、基因組DNA的AFLP分析，3、雄性特異分子標記的篩選。1、提取條石鯛鰭條的基因組DNA選擇條石鯛成魚，解剖根據(jù)性腺形態(tài)辨別雌雄，雄魚的精巢呈細帶狀、淡紅色，而雌魚的卵巢呈扁帶狀，肉紅色，很容易進行辨別。剪取20 30mg的條石鯛鰭條，并將其剪碎，然后加入350 μ L的組織裂解液，在裂解液中加入10%的十二烷基硫酸鈉(SDQ 40 μ L、 蛋白酶K(20mg/mL)8y L和核酸酶QOmg/mL)4 μ L，放在56°C的水浴鍋中消化，一般需要消化2 池；取出離心管低速離心去除管壁水珠，然后加入300 μ L的6mol/L的NaCl溶液，震蕩混勻，室溫12000r/min離心20 30min，移上清夜至新的離心管中；在上清液中加入等體積的異丙醇(約700μυ，輕輕混勻，置于-20°C中2 3h，室溫12000r/min離心15min， 棄去上清液；加入70%的乙醇于離心管中，混勻漂洗沉淀一次，然后室溫12000r/min離心 lOmin，棄去上清液；室溫下使乙醇揮發(fā)，自然干燥；用適當體積(30 50 μ L)的雙蒸水或者TE緩沖液(ρΗ8. 0)溶解DNA，將DNA保存在_20°C備用。基因組DNA的濃度應(yīng)不低于 50ng/y L，基因組DNA的純度要求O擬60/0D280值為1. 76 1. 80。2、基因組DNA的AFLP分析
基因組DNA的AFLP分析主要包括如下步驟(1)對基因組DNA模板進行酶切；(2) 將特異接頭連接到酶切片段上；C3)進行PCR預(yù)擴增；(4)進行PCR選擇性擴增；( 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。(1)對基因組DNA模板進行酶切用1. 25U/ μ L EcoRI/Msel 酶混合物 37 °C 過夜消化 IOOng 400ng 模板 DNA6 8h，再用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否充分，然后將充分酶切的DNA溶液于65°C孵育 15min滅火限制性內(nèi)切酶。(2)將特異接頭連接到酶切片段上向上面的酶切反應(yīng)混合液中加入12. 0 μ L接頭混合物和1. 5U T4DNA連接酶，20°C 孵育12 20h保證接頭充分連接，然后放置_20°C中保存。接頭混合物的序列如下Eadaptorl :CTC GTA GAC TGC GTA CC ；Eadaptor2 :AAT TGG TAC GCA GTC TAC ；Madaptorl :GAC GAT GAG TCC TGA G ；Madaptor2 :TAC TCA GGA CTC AT。(3)進行PCR預(yù)擴增將上述連接產(chǎn)物稀釋10倍，作為PCR預(yù)擴增的模板；預(yù)擴增引物的3’末端帶有一個選擇性堿基(A或者C)。PCR反應(yīng)條件為94°C變性40s ；56°C退火40s ；72°C延伸Imin。 30個循環(huán)后，72°C延伸10min，4°C保存待用。預(yù)擴增引物的序列如下EcoRIOI 5' -GAC TGC GTA CCA ATT C-3'；MseI02 5' -GAT GAG TCC TGA GTA A-3'。(4)進行PCR選擇性擴增將預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋30 50倍，作為選擇性擴增的模板。用含酶切位點MseI的引物和含酶切位點EcoRI的引物進行擴增，這兩種引物3’末端帶有三個選擇性堿基。PCR反應(yīng)分為三步第一步進行1個循環(huán)94°C變性40s ；65°C退火40s ；72°C延伸Imin ；第二步進行12個循環(huán)94°C變性40s ；65-56°C退火40s ；72°C延伸Imin ；第三步進行25個循環(huán)94°C 變性40s ；56°C退火40s ；72°C延伸lmin。擴增產(chǎn)物加入適量的上樣液，94°C變性5min，立即置于冰上。總共用了 144對引物組合進行選擇性擴增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)94°C變性后用6% 聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離。(5)電泳分析將變性好的擴增產(chǎn)物用6%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳；電泳條件電壓1200V， 功率50W，電流50mA，溫度45°C，時間1.證。總共用了 144對引物組合對20個條石鯛雄性個體和20個條石鯛雌性個體的基因組DNA進行了 AFLP分析，然后對電泳后產(chǎn)生的DNA條帶圖譜進行觀察，照相和分析，篩選出特異片段的引物組合4個，這4個引物組合共產(chǎn)生了 4條雄性特異的AFLP標記。3、雄性特異分子標記的篩選總共用144對引物組合對20個條石鯛雌性個體和20個條石鯛雄性個體的基因組 DNA進行了 AFLP-PCR擴增，這些引物組合的序列如下
權(quán)利要求
1.條石鯛性別特異AFLP分子標記，其特征在于所述分子標記的引物序列如下 5' - GACTGCGTACCAATTCACA -3'；5’- GATGAGTCCTGAGTAACAT-3’，用所述引物序列擴增出的特異AFLP標記經(jīng)克隆測序為如SEQ ID NO: 1所示的DNA片段。
2.條石鯛性別特異AFLP分子標記，其特征在于所述分子標記的引物序列如下 5’ -GACTGCGTACCAATTCAGA -3’ ；5’-GATGAGTCCTGAGTAACTT -3’，用所述引物序列擴增出的特異AFLP標記經(jīng)克隆測序為如SEQ ID NO: 2所示的DNA片段。
3.條石鯛性別特異AFLP分子標記，其特征在于所述分子標記的引物序列如下 5' -GACTGCGTACCAATTCATC -3'；5’ -GATGAGTCCTGAGTAACGT -3’，用所述引物序列擴增出的特異AFLP標記經(jīng)克隆測序為如SEQ ID NO: 3所示的DNA片段。
4.條石鯛性別特異AFLP分子標記，其特征在于所述分子標記的引物序列如下 5' -GACTGCGTACCAATTCATG -3'；5’-GATGAGTCCTGAGTAACTT -3’，用所述引物序列擴增出的特異AFLP標記經(jīng)克隆測序為如SEQ ID N0:4所示的DNA片段。
5.條石鯛性別特異SCAR分子標記，其特征在于所述分子標記根據(jù)SEQID NO: 1序列設(shè)計引物進行PCR擴增獲得，其引物序列為0pl240-l: 5’ AGACCAAGATCAGGAGCGAAT3’ ； Op1240-2: 5 ’ GGAGCATCCCATCCATTCT3’，用所述引物在雄魚基因組中擴增出240bp的DNA條帶，在雌魚基因組中沒有擴增條帶。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求5所述的條石鯛性別特異分子標記的遺傳性別鑒定方法，其特征在于它包括以下步驟(1)采集待測的條石鯛的基因組DNA；(2)用所述SCAR標記的引物對條石鯛基因組DNA進行PCR擴增，擴增得到240bp的條帶所對應(yīng)的為雄性個體，沒有擴增條帶所對應(yīng)的為雌性個體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種條石鯛性別特異分子標記的遺傳性別鑒定方法，其特征在于所述步驟(1)中采集條石鯛的鰭條提取基因組DNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種條石鯛性別特異分子標記的遺傳性別鑒定方法，其特征在于所述步驟(1)中所述的基因組DNA的濃度為50 200ng/^L，基因組DNA的純度要求 0D260/0D280 值為 1. 76 1. 80。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種條石鯛性別特異分子標記的遺傳性別鑒定方法，其特征在于所述步驟O)中的PCR反應(yīng)的體系為DNA模板50 200ng，上下游引物濃度0. 4μΜ， dNTP濃度為0. ImM, IXPCRbuffer,MgCl2濃度為1.5mM, Taq酶1. 25U，補充雙蒸水至終體積 25μ 。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種條石鯛性別特異分子標記的遺傳性別鑒定方法，其特征在于所述步驟(2)中的PCR擴增程序為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，56°C退火30s， 72°C延伸60s，共35個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin0
全文摘要
本發(fā)明提供了一種條石鯛性別特異分子標記及遺傳性別鑒定方法，它包括雄性特異AFLP標記的篩選和克隆，性別特異的DNA序列分析，遺傳性別PCR鑒定方法的建立。本發(fā)明從144對引物組合中篩選到4個引物組合能夠產(chǎn)生4個雄性特異AFLP標記，將這些AFLP標記克隆測序，篩選到了一個SCAR分子標記，建立了條石鯛遺傳性別鑒定的PCR方法。本發(fā)明采用AFLP方法首次篩選到條石鯛性別特異的分子標記，并將其轉(zhuǎn)化為SCAR標記，建立條石鯛遺傳性別的鑒定方法；所述遺傳性別鑒定方法具有準確、靈敏、可靠等優(yōu)點，不僅對魚類性別機制研究具有重要的科學價值，而且為魚類性別控制和選擇育種具有重要的意義和應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/11GK102286479SQ20111022837
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月10日
發(fā)明者付萬東, 史會來, 徐冬冬, 李三磊, 樓寶, 毛國民, 耿智 申請人:浙江省海洋水產(chǎn)研究所