專利名稱：一種天蠶的分子鑒定方法及其遺傳標(biāo)記物、引物和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，特別涉及一種天蠶的分子鑒定方法及其遺傳標(biāo)記物、 引物和試劑盒。
背景技術(shù)：
絲綢是中國古老文化的象征，中國古老的絲綢業(yè)為中華民族文化織繡了光輝的篇章，對促進(jìn)世界人類文明的發(fā)展作出了不可磨滅的貢獻(xiàn)。中國絲綢以其卓越的品質(zhì)、精美的花色和豐富的文化內(nèi)涵聞名于世。幾千年前，當(dāng)絲綢沿著古絲綢之路傳向歐洲，它所帶去的，不僅僅是一件件華美的服飾、飾品，更是東方古老燦爛的文明，絲綢從那時起，幾乎就成為了東方文明的傳播者和象征。目前已知的最早絲織物，是出土于距今約4700年良諸文化的遺址。中國是家蠶絲的發(fā)源地，養(yǎng)蠶，繅絲是我國古代在纖維利用上最重要的成就。早在新石器時代，我國已發(fā)明絲綢織造以及朱砂染色技術(shù)，此后隨著織機(jī)的不斷改進(jìn)，印染技術(shù)的不斷提高，絲織品種日益豐富，并形成了一個完整的染織工藝體系，使我國古代的絲綢染織技術(shù)領(lǐng)先于世界各國。 根據(jù)中國“十一五”規(guī)劃，到2010年，蠶繭產(chǎn)量應(yīng)達(dá)85-90萬噸，蠶農(nóng)年收入達(dá)到200億元； 絲產(chǎn)量達(dá)17-19萬噸，烘繭和絲綢印染等領(lǐng)域的總體耗水耗能比2005年降低10% -20%, 絲綢工業(yè)年產(chǎn)值2500億元；真絲綢年出口創(chuàng)匯50-55億美元，初步實現(xiàn)“絲綢大國”向“絲綢強(qiáng)國”轉(zhuǎn)變的目標(biāo)。從本質(zhì)上講，絲是絹絲昆蟲繭的主要成分。目前世界范圍內(nèi)使用的絕大部分都是桑蠶，即我們通常說的家蠶。此外，柞蠶絲也有少量生產(chǎn)，但由于其品質(zhì)不足，常常被與麻或者棉混紡。絹絲昆蟲種類很多，在脈翅目(Neuroptera)、毛翅目(Trichoptera)、雙翅目 (Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)和鱗翅目(Lepidoptera)中都有吐絲的，統(tǒng)稱為絹絲昆蟲。在所有絹絲昆蟲中，鱗翅目中的蠶蛾科(Bombycidae)和天蠶蛾科(Saturniinae)(也翻譯為大蠶蛾科)的應(yīng)用價值較高，此外還有櫟枯葉蛾科(Lasiocampidae)的一種分布于西西里島和希臘的櫟枯葉蛾具有有應(yīng)用價值。目前所說的野蠶主要是指天蠶蛾科成員。我國比較容易找到到的有柞蠶屬、樗蠶屬、柳蠶屬、樟蠶屬、栗蠶屬、透目天蠶屬、黃目天蠶屬七個屬。此外其他屬我國也有記載日本銹斑天蠶屬、鹿紋天蠶屬、惜古比天蠶屬、日月天蠶屬、丁目天蠶屬和合目天蠶屬。其中有經(jīng)濟(jì)價值且可以人工養(yǎng)殖的至少有以下14種，其中經(jīng)濟(jì)價值最高的為小字大蠶蛾、琥珀蠶、天蠶。目前，在我國有野生或養(yǎng)殖記錄的為天蠶。天蠶又稱為日本柞蠶。屬鱗翅目，大蠶蛾科，又名山蠶，學(xué)名Antheraea yamamai Guerin-Meneville。主要分布于中國、朝鮮、韓國、日本等地。天蠶繭色為綠色，能繅絲，絲質(zhì)優(yōu)美、輕柔，不需要染色而能保持天然綠色，并具有獨特的光澤。織成絲綢色澤艷麗、美觀，是高級的絲織品。繭呈長橢圓形，長徑45-53cm，短徑23-27cm。繭色可深綠、淺綠、深金黃色，但絕大部分為綠色，一側(cè)色較深，一側(cè)較淺。在人工飼養(yǎng)條件下，繭為黃綠色。繭能繅絲，1000粒繭可繅生絲250-300g，一粒繭絲長600-700m。纖度比桑蠶絲粗一倍；伸度約 40-50%，比桑蠶絲高1. 8倍；強(qiáng)力約為桑蠶絲的2. 5倍。織成絲綢色澤艷麗、美觀，可與其它纖維混織，是極高級的絲織物。在國外，一些貴族還依然保持古老的傳統(tǒng)觀念，凡是外國商人來中國購貨時都說，他們非常喜歡天蠶絲制品，認(rèn)為可保平安、吉祥如意，能帶來好運。 用天蠶絲在服裝和飾品上點綴一點點，價格即驚人的昂貴，而且是當(dāng)吉祥符用。他們把點綴天蠶絲的服裝作為世代相傳的寶貝珍藏，多把天蠶絲制成神殿里用的縵和簾，用來供養(yǎng)至高無上的神佛。所以我國天蠶絲剛剛被發(fā)現(xiàn)，外商就紛紛爭相大量搶購，出口價最高時曾賣到人民幣3萬元/公斤。天蠶的出現(xiàn)也給我國帶來了經(jīng)濟(jì)的繁榮和昌盛。上個世紀(jì)末，日本商人帶來的一份報紙報道的新聞消息記載，當(dāng)時中國長沙馬王堆出土了一座千年古墓，其中所有的紡織品都風(fēng)化成碎片了，只有木乃伊身上的一件衣服還完好，并且有一定的拉力， 經(jīng)化驗后，證明是中國一千多年前的天蠶絲制作而成的。因此，國際市場上持續(xù)了長時間的天蠶絲熱潮，外國商人瘋狂地?fù)屬徧煨Q絲原料。由于野生天蠶絲稀有十分昂貴，我國自己一直沒有天蠶絲制成品，那時只出口原料。現(xiàn)在我們天蠶絲珍品已經(jīng)試制出來了，這是我們紡織絲綢服裝業(yè)的驕傲。除天蠶絲外，天蠶幼蟲、蠶蛹和成蛾都是極其重要的藥材和保健品。 因此，天蠶本身是既具有經(jīng)濟(jì)價值的和開發(fā)前景的昆蟲資源。野生天蠶的收集中，面臨的最大問題是如何對收集的品種進(jìn)行鑒定。而本發(fā)明開發(fā)出天蠶專用的鑒別標(biāo)記序列，用于野生天蠶制種前的鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對缺乏有效的天蠶鑒定方法的不足，提供一種天蠶的分子鑒定方法及其遺傳標(biāo)記物、引物和試劑盒。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明的技術(shù)方案一是，一種鑒定天蠶的遺傳標(biāo)記物，它的核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO. 1，SEQ ID NO. 2，或者SEQ ID NO. 3所示序列中的連續(xù)的20-483個堿基序列。 優(yōu)選448 483bp個堿基序列；更優(yōu)選序列表中SEQ ID NO. 1，SEQ ID NO. 2，或者SEQ ID NO. 3所示序列的核苷酸，或者序列表中SEQ ID N0. 4 9任一項所示序列的核苷酸。該鑒定天蠶的遺傳標(biāo)記物或者是和序列表中SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2，或者SEQ ID NO. 3所示序列中的連續(xù)的20 483個堿基序列的具有90%以上同源性的序列。在本領(lǐng)域，具有 90%同源性的基因一般就被認(rèn)為是同一個基因。本發(fā)明的技術(shù)方案二是，一種鑒定天蠶的引物，所述的引物長度為15-35個核苷酸，且引物的序列與SEQ ID N0. 1，或者SEQ ID N0. 2，或者SEQ IDN0. 3所示的序列相同或者互補(bǔ)。所述的引物優(yōu)選為序列如SEQ ID N0. 4所示，SEQ ID N0. 5，SEQ ID NO. 6，SEQ ID NO. 7，SEQ ID NO. 8，或者 SEQ IDN0. 9 所示的核苷酸。本發(fā)明的技術(shù)方案三是，一種鑒定天蠶的試劑盒，含有特異性擴(kuò)增天蠶遺產(chǎn)標(biāo)記物的引物對，所述的引物長度為15-35個核苷酸，且所述的引物對中，一個引物的序列與 SEQ ID N0. 1，或者SEQ ID N0. 2，或者SEQ ID N0. 3所示的序列相同，而另一個引物的序列與SEQ ID N0. 1，或者SEQ ID N0. 2，或者SEQ ID N0. 3所示的序列互補(bǔ)，且擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為40 483bp。較佳的，所述的引物對中，一個引物的序列如SEQ ID N0. 4所示，另一個如 SEQID N0. 5所示；或者，一個引物的序列如SEQ ID N0. 6所示，另一個如SEQID N0. 7所示； 或者，一個引物的序列如SEQ ID N0. 8所示，另一個如SEQID N0. 9所示。所述的試劑盒還包括1)DNA裂解液，2) PCR反應(yīng)緩沖液，3) dNTP，4) Taq DNA聚合酶。更佳的，還包括陽性對照，所述的陽性對照是天蠶基因組DNA，優(yōu)選如序列表中SEQ ID NO. 1，SEQ ID NO. 2，或SEQ ID NO. 3所示序列的核苷酸。本發(fā)明的技術(shù)方案四是，一種天蠶的分子鑒定方法，包括以下步驟(1)抽提樣品的DNA;(2)將抽提的DNA作為模板，用特異性擴(kuò)增天蠶遺產(chǎn)標(biāo)記物的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中所述的引物長度為15-35個核苷酸，且所述的引物對中，一個引物的序列與SEQ ID NO. 1，或者SEQ ID NO. 2，或者SEQ ID N0. 3所示的序列相同，而另一個引物的序列與SEQ ID N0. 1，或者SEQ ID N0. 2，或者SEQ ID N0. 3所示的序列互補(bǔ)，且擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為70 300bp ；(3)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，存在擴(kuò)增產(chǎn)物就表示樣品中存在來自天蠶的個體、器官、組織、細(xì)胞、基因組DNA或者存在如序列表中SEQ ID NO. 1,SEQ ID NO. 2，或SEQ ID NO. 3 所示序列中的連續(xù)的20-483個堿基序列的核苷酸。步驟⑵中所述的PCR擴(kuò)增，較佳的，反應(yīng)體系為模板DNA 0. 016 μ g/ μ 1，dNTPs 各 0.02mM，lXEx Buffer (含鎂離子)，正向引物 0. 4 μ M，反向引物 0. 4 μ M，Ex taq 0. 04U/ μ 1 ；反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5分鐘，然后以94°C變性45s，55°C退火50s，72°C延伸60s，進(jìn)行35個反應(yīng)循環(huán)，最后72°C延伸7分鐘。本發(fā)明的技術(shù)方案五是，一種如上所述的鑒定天蠶的遺傳標(biāo)記物的用途，用于鑒定天蠶。以能檢測到樣品中含有該遺傳標(biāo)記物或其片段，表示樣品是天蠶。檢測到堿基長度為20 448bp的該遺傳標(biāo)記物的片段，也表示樣品是天蠶。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下在野生天蠶制種前，需要對收集的天蠶樣品進(jìn)行鑒定，使用本發(fā)明則可以方便、快速、準(zhǔn)確的鑒定天蠶。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖1是PCR產(chǎn)物序列7、8、9(從第二道開始從左到右依次開始)瓊脂糖電泳圖譜。 M，分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，引物1和2的擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物序列是SEQ ID N0. 1。2，引物3和4擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物序列是SEQ ID N0. 2。3，引物5和6擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物序列是SEQ ID N0. 3。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，從天蠶中發(fā)現(xiàn)三段核苷酸序列，它們是天蠶的部分基因，經(jīng)過序列同源性檢索，發(fā)現(xiàn)它們和其他物種包括絹絲昆蟲的同源性很低，表明它們是天蠶特有的序列，是天蠶特征序列。從這些核苷酸序列中選擇一段序列作為引物或探針，具有很好的物種特征性，可用于天蠶的鑒定。因此，進(jìn)一步的本發(fā)明人通過仔細(xì)分析和反復(fù)實驗，在這三段核苷酸序列中尋找到合適的引物對，可以經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得條帶清晰的擴(kuò)增產(chǎn)物，繼而用于鑒定天蠶品種，從而完成了本發(fā)明。一、由信息檢索可知序列的天蠶特異性本發(fā)明人在研究7種絹絲昆蟲-天蠶(Antheraea yamamai ；giant silkworm ；Japanese oak silkmoth)、 中國豐乍胃(Antheraea pernyi ；tussah ；Chinese oak silkmoth)、玻 白香(Antheraea assama ；muga silkworm)、蓖麻香(Samia Cynthia ；
eri-silkworm)、清新透目天香(Rhodinia newara)、柳香(Actias selene Hubner)-的 5
齡幼蟲吐絲器官絲腺轉(zhuǎn)錄組的時候，將獲得的該7物種的高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄組相互之間使用采用 blastp程序，并將家蠶基因集納入分析，設(shè)置相似性cutoff為10-8進(jìn)行相互比對，結(jié)果使用solar軟件連接起來，將同源基因分類為單拷貝基因(blastp只有一個hit)和多拷貝基因(blastp有多個hit)。在這過程中篩選獲得了在天蠶中特異，而在其物種中沒有的基因片段，即作為鑒別天蠶的特征序列。這三段序列即序列表中SEQ ID NO. 1，SEQID NO. 2，和 SEQ ID NO. 3所示。在本領(lǐng)域，具有90%同源性的基因一般就被認(rèn)為是同一個基因。二、野生天蠶資源分子鑒定的PCR試劑盒本發(fā)明提供一種快速檢測天蠶的PCR試劑盒，包括1)DNA裂解液，2) 10倍PCR緩沖液，3)(1^1^溶液，4打39 DNA聚合酶，和5)引物對。其中，1) 4)可以是本領(lǐng)域常規(guī)的PCR試劑盒中的部件。5)引物對，則是本發(fā)明特別設(shè)計的。所述的引物長度為15-35個核苷酸，且一個引物的序列與SEQ ID NO. 1 (或者 SEQ ID N0. 2，或者SEQ ID N0. 3)所示的序列相同，而另一個引物的序列與SEQ ID NO. 1(或者SEQ ID N0. 2，或者SEQID N0. 3)所示的序列互補(bǔ)，且擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為40 448bp。較佳的一個例子是，所述的引物對中，一個引物的序列如SEQ ID N0. 4所示，另一個如SEQ ID N0. 5所示；或者，一個引物的序列如SEQ ID N0. 6所示，另一個如SEQ ID N0. 7所示；或者， 一個引物的序列如SEQ ID N0. 8所示，另一個如SEQ ID N0. 9所示。在本發(fā)明的一優(yōu)選方案中，正向引物和反向引物各3pmol，0. 2mMdNTPs, 1. 5U的 Taq 酶(Takara exTaq)。其中正向引物為 SEQ ID N0. 4, SEQID NO. 6，或者 SEQ ID Ν0· 8 所示的核苷酸序列；反向引物為SEQ ID N0. 5, SEQ ID NO. 7，或者SEQ ID NO. 9所示的核苷酸序列。較佳的，所述的快速檢測天蠶的PCR試劑盒還包括陽性對照。陽性對照較佳的是如SEQ ID N0. 1，SEQ ID NO. 2，或者SEQ ID NO. 3所示的序列的核苷酸片段。三、野生天蠶資源分子鑒定的方法本發(fā)明還提供一種野生天蠶資源分子鑒定的方法，包括以下步驟1)提取天蠶基因組DNA ；2)以提取的基因組DNA為模板，以本發(fā)明的引物對為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測。其中，提取天蠶基因組DNA的方法采用本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)，可以從糞便、體表、血液中提取DNA。DNA提取可采用多種方法。較佳的用本發(fā)明試劑盒提供的裂解液裂解天蠶絲腺，從中提取DNA。步驟2)所述的PCR擴(kuò)增條件可以是常規(guī)的PCR擴(kuò)增條件，較佳的，PCR反應(yīng)體系為模板 DNA 0. 016yg/y 1，dNTPs 各 0. 02mM，lXEx Buffer (含鎂離子)，正向引物 0. 4μΜ，反向引物0. 4μΜ，Εχ taq 0. 04υ/μ 1。PCR反應(yīng)程序較佳的為94°C預(yù)變性5分鐘， 然后以94°C變性45s，55°C退火50s，72°C延伸60s，進(jìn)行35個反應(yīng)循環(huán)，最后72°C延伸7分鐘。下面用實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下述實施例中未注明的具體技術(shù)或條件，均為常規(guī)技術(shù)或條件，或按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件 (例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學(xué)出版社) 或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1野生天蠶資源的分子鑒定對已經(jīng)有的天蠶提取基因組DNA，可以從糞便、體表、血液中提取DNA，DNA提取可采用多種現(xiàn)有技術(shù)中的方法，此處不做特殊說明。采用表1中引物，引物組合對為引物1 和引物2、引物3和引物4、引物5和引物6。按照表2所述的體系進(jìn)行PCR反應(yīng)。實驗中是使用了 TaKaRa Ex Taq HSPCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序為94°C預(yù)變性5分鐘，然后以94°C變性45s，55°C退火50s，72°C延伸60s，進(jìn)行35個反應(yīng)循環(huán)，最后72°C延伸7分鐘。表1.鑒定天蠶的引物
權(quán)利要求
1.一種鑒定天蠶的遺傳標(biāo)記物，其特征在于，它的核苷酸序列是1)序列表中SEQID NO. 1,SEQ ID NO. 2，或者SEQ ID NO. 3所示序列中的連續(xù)的20 483個堿基序列；或者2)和序列表中SEQID NO. 1, SEQ ID NO. 2，或者SEQ ID NO. 3所示序列中的連續(xù)的 20 483個堿基序列的具有90%以上同源性的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的遺傳標(biāo)記物，其特征在于，所述的遺傳標(biāo)記物是1)序列表中SEQID NO. 1，SEQ ID NO. 2，或者SEQ ID NO. 3所示序列的核苷酸；或者2)和序列表中SEQID NO. 1,SEQ ID NO. 2，或者SEQ ID NO. 3所示序列具有90%以上同源性的核苷酸。
3.一種鑒定天蠶的引物，其特征在于，所述的引物長度為15-35個核苷酸，且引物的序列與SEQ ID N0. 1，或者SEQ ID N0. 2，或者SEQ ID N0. 3所示的序列相同或者互補(bǔ)。
4.如權(quán)利要求3所述的引物，其特征在于，所述的引物為序列如SEQIDW).4所示，SEQ ID N0. 5，SEQ ID NO. 6，SEQ ID NO. 7，SEQ ID NO. 8，或者 SEQ ID NO. 9 所示的核苷酸。
5.一種鑒定天蠶的試劑盒，其特征在于，其含有特異性擴(kuò)增天蠶遺產(chǎn)標(biāo)記物的引物對， 所述的引物長度為15-35個核苷酸，且所述的引物對中，一個引物的序列與SEQ ID N0. 1，或者SEQ ID N0. 2，或者SEQ ID N0. 3所示的序列相同，而另一個引物的序列與SEQ ID NO. 1, 或者SEQ ID N0. 2，或者SEQ ID N0. 3所示的序列互補(bǔ)，且擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為70 300bp。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的引物對中，一個引物的序列如SEQ ID N0. 4所示，另一個如SEQ ID N0. 5所示；或者，一個引物的序列如SEQ ID N0.6所示，另一個如SEQ ID N0. 7所示；或者，一個引物的序列如SEQ ID N0. 8所示，另一個如SEQ ID N0. 9所示。
7.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括1)DNA裂解液，2) PCR反應(yīng)緩沖液，3) dNTP，4) Taq DNA聚合酶。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括陽性對照，所述的陽性對照是如序列表中SEQ ID N0. 1，SEQ ID NO. 2，或SEQID NO. 3所示序列的核苷酸。
9.一種天蠶的分子鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟(1)抽提樣品的DNA;(2)將抽提的DNA作為模板，用特異性擴(kuò)增天蠶遺產(chǎn)標(biāo)記物的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 其中所述的引物長度為15-35個核苷酸，且所述的引物對中，一個引物的序列與SEQ ID N0. 1，或者SEQ ID N0. 2，或者SEQ ID N0. 3所示的序列相同，而另一個引物的序列與SEQ ID N0. 1，或者SEQ ID N0. 2，或者SEQ ID N0. 3所示的序列互補(bǔ)，且擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為70 300bp ；(3)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，存在擴(kuò)增產(chǎn)物就表示樣品中存在來自天蠶的個體、器官、組織、細(xì)胞、基因組DNA或者存在如序列表中SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2，或SEQ ID NO. 3所示序列中的連續(xù)的20-483個堿基序列的核苷酸。
10.一種如權(quán)利要求1所述的鑒定天蠶的遺傳標(biāo)記物的用途，用于鑒定天蠶，以能檢測到樣品中含有該遺傳標(biāo)記物或其片段，表示樣品是天蠶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種天蠶的分子鑒定方法及其遺傳標(biāo)記物、引物和試劑盒。具體的，本發(fā)明提供了3條天蠶特異性的核苷酸序列，是序列表中SEQID NO.1，SEQ ID NO.2，或者SEQ ID NO.3所示序列中的連續(xù)的20-483個堿基序列。本發(fā)明還提供了以該序列為基礎(chǔ)設(shè)計的寡核苷酸引物，用這些引物快速特異性檢測天蠶的方法，以及所用的試劑盒。在野生天蠶制種前，需要對收集的天蠶樣品進(jìn)行鑒定，使用本發(fā)明則可以方便、快速、準(zhǔn)確的鑒定天蠶。
文檔編號C12Q1/68GK102286626SQ201110253329
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月30日
發(fā)明者盧翌銘, 胡頌軍, 董揚 申請人:湘潭市祂施爾生物科技有限公司