專利名稱：：一種棉花酪蛋白激酶基因及其應用的制作方法一種棉花酪蛋白激酶基因及其應用
技術領域：
本發明屬于植物基因工程領域。具體涉及一種新的棉花酪蛋白激酶基因，采用反向遺傳學的方法，通過對棉花高溫脅迫下花藥表達譜的分析，分離克隆的GhCKI基因為控制棉花花藥發育的基因。本發明還涉及含有該基因或其同源基因的載體和涉及利用該基因或其功能類似物調控植物的花藥發育在農業生產中的應用。
背景技術：
：溫度是影響植物分布和生長的重要環境因素，然而隨著工業化的快速發展，溫室氣體的大量排放，全球氣候變暖的加劇，高溫天氣頻率的增加，從而使得植物生長面臨著高溫脅迫的嚴峻挑戰。一般來說，當環境溫度短時升高10°c15°C時，會對農作物產生高溫脅迫，脅迫所造成的傷害與脅迫強度、持續時間、農作物種類及基因型有關(Wahid等，HeattoleranceinplantsAnoverview,EnvironmentalandExperimentalBotany.2007.61:199_223)，而農作物的生殖生長比營養生長對高溫脅迫更為敏感，并且雄蕊對高溫的敏感性又明顯高于雌蕊(Mascarenhas等，Pollenandtheheatshockresponse,SexualPlantReproduction.1996,9:370_374)。由于許多重要農作物如水稻(Oryzasativa),玉米(Zeamays),番爺(Lycopersiconesculentum)，辣椒(Capsicumannuum)，棉花(Gossypium)等開花結果期都集中在夏季高溫季節，所以這些農作物的生殖生長受到高溫脅迫時，經濟損失更為嚴重，因此高溫引起的雄性不育受到廣泛的重視。隨著細胞學、生理學和分子生物學的發展，對于雄性不育的各種細胞水平的變化，生理學指標的變化以及通過分子生物學手段對相關的基因的表達都有了很大的研究進展。從細胞學上研究表明絨氈層是花藥中對高溫最敏感的組織，極易受高溫傷害(Suzuki等，Ultrastructuralstudyondegenerationoftapetuminantherofsnapbean(PhaseolusvulgarisL.)underheatstress,SexualPlantReproduction.2001，13=293-299)。在生理學上，高溫脅迫主要是通過影響糖代謝和內源激素含量從而影響花藥的發育，番茄在開花前遇到高溫時，熱敏品種未成熟花粉中淀粉含量的增加受到抑制甚至減少，而成熟花粉粒中可溶性糖含量相應降低，最終引起番茄花粉生活力的降低，但耐熱品種淀粉的積累量和可溶性糖含量均未受到明顯影響(Pressman等，Theeffectofheatstressontomatopollencharacteristicsisassociatedwithchangesincarbohydrateconcentrationinthedevelopinganthers,AnnalsofBotany.2002，90:631_636)。內源激素:口引噪乙酸(indoleaceticacid,IAA)和赤霉素(gibberellicacids,GAs)能促進花粉發育，脫落酸(abscisicacid,ΑΒΑ)則抑制花粉發育(Tang等，PossiblecorrelationbetweenhightemperatureinducedfloretsterilityandendogenouslevelsofIAA,GAsandABAinrice(OryzasativaL.),PlantGrowthRegulation.2008,54:37_43)。在分子生物學方面，主要是集中于熱激蛋白的研究，熱激蛋白(heatshockproteins,HSPs)是生物體遇到高溫時迅速合成的一類蛋白質，在生物體對抗高溫脅迫中起重要作用。但當花粉不能有效的響應高溫從而合成不夠量的HSPs時，其不能有效的對抗高溫脅迫，從而使花粉在高溫下喪失生活力(Young等，Developmentalandthermalregulationofthemaizeheatshockprotein，HSPlOl，PlantPhysiology.2001，127:777-791)。棉花是一種重要的經濟作物，同時也是生物技術應用范圍比較廣的農作物。通過對棉花基因改造而得到的抗蟲棉給傳統的農業生產帶來了更多對生物技術的期望。棉花的生物成分和基因組都很復雜，對棉花的基因克隆和功能驗證也是比較困難的。目前已有的幾個功能基因的研究多數和纖維發育相關，而對于高溫脅迫下影響花藥發育相關基因的克隆還未見報道。申請人本發明提出之前，在植物中對于I型的酪蛋白激酶的報道主要集中在從不同的植物中分離得到了I型的酪蛋白激酶，但對于其在植物中的作用底物及生理功能等方面的研究很少，在擬南芥中Snf4是糖代謝調控復合體SnRKs的Y亞基，Snf4參入擬南芥對于葡萄糖的感知和逆境信號的傳遞，酵母snf4突變體能被擬南芥的Snf4，CKI和MYB30等基因恢復，所以CKI可能存在著與Snf4相類似的功能，參入葡萄糖信號(Kleinow等，FunctionalidentificationofanArabidopsissnf4orthologbyscreeningforheterologousmulticopysuppressorsofsnf4deficiencyinyeast,PlantJ.2002,23:115-122)。在水稻中分離到一個長度為1939bp的OsCKIl，其編碼463個氨基酸的可溶性蛋白，此基因為組成型表達，并具有受植物激素油菜素內酯(BR)及脫落酸(ABA)誘導的表達模式，通過參與細胞延伸、細胞分裂及相關信號轉導途徑的調控過程而對水稻根部發育產生影響，并參與植物對外源激素的應答過程(Liu等，OsCKIl,aricecaseinkinaseI,playssignificantrolesinauxinrelatedrootdevelopmentandfunctionsofplanthormones,PlantJ.2003,36:189-202)。擬南芥的AtCKL6通過憐酸化微管多聚物從而影響皮層微管的排列及各向異性細胞生長和細胞形態的形成(Gili等，Arabidopsiscaseinkinase1-like6(CKL6)containsmicrotubule-bindingdomainandaffectsorganizationofcorticalmicrotubules,PlantPhysiology.2008,148:1897-1907)。最近報道從水稻突變體庫里分離到一個早花突變體ell(earlyfloweringl),也是一個CKI基因，可以通過磷酸化SLRl從而負調控GA信號(Dai等,RiceearlyfloweringI,aCKI,phosphorylatesDELLAproteinSLRltonegativelyregulategibberellinsignaling,EMBOjournal.2010,29:1916-1927)。從上我們可以看出CKI參入了多種生物學過程，并且不同的CKI家族成員其生物學功能也不同。在本發明提出之前申請人從棉花高溫脅迫下花藥發育的表達譜中得到一條CKI基因序列，通過轉基因驗證表明CKI基因與植物花藥的發育有關，對CKI參入植物花藥發育代謝路徑的研究以及高溫脅迫下轉基因棉花的育性相關分子標記開發都有很重要的意義。
發明內容本發明的目的是在于提供了一種棉花酪蛋白激酶基因GhCKI，該基因從棉花高溫脅迫條件下花藥表達譜中鑒定并分離克隆，具有如SEQ.ID.No.I或SEQ.ID.No.2所示的核苷酸序列，或至少50%同源性的序列，以及上述DNA片段編碼的蛋白或經過改造修飾的具有相同功能的蛋白。本發明的另一個目的是在于提供了一種棉花酪蛋白激酶基因GhCKI在控制棉花花藥發育中的應用，通過GhCKI基因，SEQ.ID.NO.I或SEQ.ID.No.2或與其功能等同的同源基因在棉花植株中超量表達或抑制表達，一種分離的蛋白質，其具有SEQIDNO.3所示氨基酸序列至少50%同源性的序列，來達到控制棉花花藥發育的目的，從而應用于各種植物不育系的培育，同時可作為高溫脅迫下植物花藥育性穩定性的標記基因。本發明還提供了一種用GhCKI基因進行高效植物遺傳轉化的方法。具體地說，本發明提供了一種含有SEQIDNO.I所示序列的基因或該基因的部分類似功能片段的載體，該載體可以表達由上述核酸序列編碼的多肽或同源類似物。本發明還提供了一種含有以上表達載體的宿主細胞，宿主細胞包括大腸桿菌、農桿菌和植物細胞。本發明的GhCKI基因的表達載體轉化的宿主是包括棉花在內多種植物，培育各種植物的雄性不育系；可使用包括本發明的GhCKI基因片段為靶標的RNAi載體轉化宿主棉花，可用于培育耐高溫的棉花品種。實現本發明的技術如下本申請人前期工作是對陸地棉‘84021’和‘H05’高溫(白天37_39°C，晚間29-310C)脅迫下花藥進行表達譜分析(見圖Ia)，通過基因表達聚類分析，分離出一類在兩種棉花品種中表達變化趨勢相反的基因。從這一類基因中分離出一條與其他植物CKI具有較高同源的序列，并對這條序列進行表達分析(見圖Ib)。與其他物種CKI基因的進化分析和生物信息學分析表明，該序列與擬南芥的AtCKIL2(AT1G72710)同源性最高，并將其命名為GhCKI(見圖2)。從陸地棉品系‘84021’和‘H05’中提取高溫(白天37_39°C，晚間29-31°C)處理及正常溫度(白天35-37°C，晚間25_28°C)下開花當天開裂之前的花藥的總RNA(提取方法根據Zhu等，AnimprovedsimpleprotocolforisolationofhighqualityRNAfromGossypiumspp.suitableforcDNAlibraryconstruction,ActaAgronomicaSinica.2005,31.1657-1659.)，利用反轉錄酶SuperscriptIII(購自Invitrogen公司，美國)將其反轉錄合成cDNA,反應條件為65°C5min,50°C60min,70°CIOmin。米用RACE(rapid-ampIifixationofcDNAends)(Frohman等，Rapidproductionoffull-lengthcDNAsfromraretranscriptsamplificationusingasinglegene-specificoligonucleotideprimer.PNAS1988,85,8998-9002.)擴增出cDNA5，和3’端，利用sequencher軟件(公用的分析軟件)進行序列拼接后得到GhCKI的cDNA序列(SEQIDNo.I)，一種分離的基因的cDNA，其序列為SEQIDNo.I所示的核苷酸序列。再通過ORFFinder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)對獲得的cDNA進行分析,確定包含一個完整的0RF，后用引物GhCKI-F(5’ATGGAACCTTGTGTTGGTAATAAG’)和GhCKI_R(5’TTAATAGTGAATTCTCTCGTCGCC3，)擴增出GhCKI基因的0RF(1392bp)。PCR反應條件為94°C預變性3min;94°C30sec,55°C30sec,72°Clmin20sec，32個循環；72°C延伸lOmin。將擴增獲得的PCR產物連入pGEM-T載體(購自Promega公司，美國)，篩選陽性克隆并測序，獲得所需的基因0RF，一種分離的基因的0RF，其序列為SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。通過BlastX(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)確定ORF所對應的463個氨基酸的蛋白質序列是與CKI蛋白同源的。一種分離的蛋白質，其序列為與SEQIDNo.3所示的氨基酸序列。根據GhCKI的ORF設計引物，并在引物兩端分別加上XbaI和SacI的酶切位點及保護堿基，分別將該引物命名為GhCKIoe-F和GhCKIoe-R，再以GhCKI基因的cDNA為模板進行PCR擴增，得到的PCR產物通過酶切連接的方法連入到以相同酶消化的pCAMBIA2300S(pCAMBIA2300S載體的前體是由澳大利亞CAMBIA實驗室CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriculture惠贈的pCAMBIA2300。將pCAMBIA2300載體上的CaMV35S啟動子通過酶切連接反向整合到pCAMBIA2300的多克隆位點上，即得到本發明的所用載體PCAMBIA2300S)的載體上，從而獲得超表達載體p35s_GhCKI。所述的過量表達載體p35s-GhCKI含有SEQIDNO.I和SEQIDNO.2所示的其中之一核苷酸片段的表達載體，以及植物表達載體PCAMBIA2300S。根據GhCKI基因與其它植物的CKI的比對結果在特異區設計RNAi引物，在引物的兩端分別加上用于重組的attB位點序列及保護堿基，分別將該引物命名為引物GhCKIri-F和引物GhCKIri-R，再以實施例I中得到GhCKI基因cDNA為模板進行PCR擴增，得到的產物通過BP重組反應導入RNAi載體pHellsgate4(重組酶購自Invitrogen公司，美國；RNAi載體見Wesley等，Constructdesignforefficient，effectiveandhigh-throughputgenesilencinginplants.PlantJ.2001.27，581-590.)，構建的RNAi載體pHe11sgate4_GhCKIi。米用農桿菌GV3101(Roger等，AguidetoAgrobacteriumbinaryTivectors.Trendsinplantscience.2000.5，1360-1385.)介導的遺傳轉化棉花的方法和程序參照Jin等建立的高效轉化體系(Identificationofanovelelitegenotypeforinvitrocultureandgenetictransformationofcotton.BiologiaPlantarum，2006，50:519-524；Anefficientgraftingsystemfortransgenicplantrecoveryincotton(GossypiumhirsutumL.).PlantCell,TissueandOrganCulture，85:181-185，2006；FactorsaffectingstabletransformationandplantregenerationduringtransformingembryogeniccallusofUplandcotton(GossypiumhirsutumL)viaAgrobacteriumtumefaciens，PlantCell，TissueandOrganCulture,81:229-237,2005)，將構建好的p35s-GhCKI或pHellsgate4_GhCKIi載體導入棉花材料‘YZ1’和野生型擬南芥，農桿菌介導的花器浸醮法轉化擬南芥的轉化方法和程序參照(Zhang等，Agrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthalianausingthefloraldipmethod.NatureProtocols,2006.I:641-646)。獲得轉基因植株后,分單株提取葉片的RNA,利用反轉錄酶SuperscriptIII(購自Invitrogen公司，美國)將其反轉錄合成cDNA，以GhCKI_F(5’ATGGAACCTTGTGTTGGTAATAAG，)和GhCKI-R(5’TTAATAGTGAATTCTCTCGTCGCC3，)引物進行RT-PCR，PCR反應條件為94預變性3min；94°C30sec,55°C30sec,72°Clmin20sec，32個循環；72°C延伸lOmin。對轉基因苗進行表達量分析后，結合表達量對GhCKI的表型進行分析，首先對轉基因植株的進行光學拍照觀察，其次通過TTC染色，通過光學顯微鏡觀察花粉活力，再者對開花后5個小時的轉基因擬南芥的柱頭進行苯胺藍染色，染色后在光學顯微鏡下觀察拍照。通過觀察后發現具有GhCKI高表達量的轉基因植株花藥在開花時不能正常開裂，花藥敗育，花粉活性降低，轉基因植株的柱頭上沒有花粉粒。采用Southernblotting對轉基因擬南芥6個家系進行拷貝數分析(DNA提取和Southern實驗參照J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，分子克隆實驗指南(第三版)，科學出版社，2002版)，實驗結果表明6個家系有著不同的插入位點。通過以上分析，說明轉基因植株花藥不開裂表型導致的雄性不育是與GhCKI表達量相關聯的，而不是因為插入突變引起的。因此GhCKI基因是一個依賴于表達量的、與花藥發育相關的基因，因此，通過提高GhCKI基因的表達水平可以影響植物花藥的發育，使開花當天花藥不能正常開裂，花藥敗育。如果將GhCKI基因轉入到不同的植物或者不同的棉花品種中，可以用于植物不育性的創制，對培育植物雄性不育系具有重要意義。本發明的優點從棉花花藥表達譜中鑒定的控制花藥發育的基因GhCKI的分離克隆、功能驗證和應用。GhCKI基因編碼的蛋白與擬南芥ATCKL2基因編碼的蛋白有72%的同源性，GhCKI基因具有控制花藥發育的功能，通過遺傳轉化可應用于各種植物不育系的培育，同時可作為高溫脅迫下植物花藥育性穩定性的標記基因。I.通過表達譜分析后，縮小了候選基因的范圍，將目標在花藥發育上，減少了工作量。2.雖然在低等生物和擬南芥及水稻中克隆到了I型酪蛋白激酶(caseinkinaseI，CKI)，但只是對其做酶學特性分析，未有具體的生物學功能的報道。目前在棉花中還沒有對GhCKI研究的報道，本發明克隆的GhCKI基因對植物花藥的發育有顯著的影響，這對闡明I型酪蛋白激酶的生物學功能有重要意義。3.過量表達GhCKI的棉花和擬南芥其花藥不能正常開裂，說明GhCKI基因對花藥育性的影響很明顯，通過基因工程技術提高或減弱GhCKI基因的表達量能夠控制植物花藥的發育。4.花藥的發育直接影響育性，通過基因工程技術提高或減弱GhCKI基因的表達量能夠達到控制植物育性的目的，GhCKI基因的克隆將有助于各種植株不育系的培育。5.選育雄性不育系一直為棉花育種家所重視，控制棉花花藥育性基因的發現和利用將有助于解決生產上去雄工作量大的難題。6.全球氣候變暖的加劇，使得選育耐高溫的品種顯得尤其重要，GhCKI基因的克隆將有助于培育更耐高溫的品種。7.花藥發育遺傳研究對指導育種實踐、品種改良及品種推廣均具有重要意義，因此發掘和鑒定棉花花藥發育基因，并深入探討棉花花藥發育基因的分子作用機理，具有重要的理論意義和應用價值。圖I為一種高溫脅迫條件下花藥的表達譜分析及GhCKI基因的分離示意圖。高溫脅迫處理兩種不同的陸地棉材料，分別為‘84021’和‘H05’，‘84021’為高溫不敏感品種，高溫條件下花藥能正常開裂并散粉，‘H05’為高溫敏感品種，高溫條件下花藥能不能正常開裂。al)高溫條件下早上八點的花，‘8H’指高溫條件下的‘84021’的花，‘HH’指高溫條件下的‘H05’的花，以下同此。a2)高溫條件下午五點的花。a3)為al)的特寫，a4)為a2)的特寫。bl)RT-PCR檢測GhCKI在表達譜分析材料中的表達，b2)Northernblot檢測GhCKI在表達譜分析材料中的表達。圖2為一種采用ClustalW軟件(公開免費軟件)對GhCKI蛋白質序列分析示意圖。結果表明GhCKI與單子葉水稻的OsCKIl及雙子葉擬南芥AtCKI在5’保守區域的序列同源性很高，但是3’區域同源性很低。后又使用http://greenphyl.cirad.fr/vl/cgi-bin/gost.cgi在線分析軟件,對GhCKI基因與水稻,擬南芥進行進化樹分析,結果表明GhCKI與擬南芥的AtCKIL2最為接近。圖3為一種用Real-timePCR和Northernblot檢測GhCKI基因在陸地棉不同組織中的表達水平示意圖?；蛟诨ㄋ幹杏懈吡勘磉_，柱頭和花瓣中有少量表達。該基因在柱頭，花瓣中的表達可能是開花當天花藥開裂，部分花粉散落到柱頭、花瓣上。在其它的組織中幾乎沒有檢測到GhCKI基因的表達。圖3中棉花組織依次是1.花瓣；2.ODPA纖維；3.5DPA纖維；4.胚珠；5.花藥；6.葉片；7.柱頭。用Real-timePCR檢測各組織GhCKI基因相對表達量時以5DPA纖維為參照(即設定為I)，GhUB7為內參基因。圖4為一種超量表達載體p35s_GhCKI的構建示意圖。將GhCKI全長ORF經酶切連載接反應插入pCAMBIA2300S后的情況。圖5為一種RNAi載體pHellsgate4_GhCKI的構建不意圖。將GhCKI部分基因片段(883_1392bp)經重組反應插入pHellsgate4載體。圖6為一種GhCKI轉基因棉花表型分析不意圖。超表達株系與野生型相比，花器官更小，開花當天的花藥不能正常開裂。圖中a)花器官大小比較；b)對應植株的花藥及柱頭比較；c)對應植株開花當天花粉活性檢測，GhOE14,Gh0E22分別為超量表達GhCKI的2個株系，WT為未轉基因的YZl植株。GhCKI的RNAi植株與野生型沒有差別。圖7為一種GhOE14、Gh0E22、WT中GhCKI的基因表達分析示意圖。圖中為一種Gh0E14、Gh0E22分別為超量表達GhCKI的2個株系，WT為未轉基因的YZl植株。圖8為一種GhCKI轉基因擬南芥表型分析示意圖。超表達GhCKI的擬南芥植株與野生型相比，開花持續的時間更長，植株的次級分枝更多，角果變短，種子產量降低，花藥不開裂。圖中a)開花持續的時間長；b)次級分枝多；c)角果長度變短；d)可見花瓣數目多；e)到g)花藥不開裂；h)開花后5h花粉管萌發染色。圖9為一種擬南芥At0E15、At0E16、At0E24、At0E25、AtOE44及野生型(WT)中GhCKI的基因表達分析示意圖。圖中At0E15、At0E16、At0E24、At0E25、At0E44為超量表達GhCKI的株系，WT為未轉基因的擬南介植株。AtActin7為內參基因不意圖。圖10為一種擬南芥At0E15、At0E16、At0E24、At0E25、At0E44、WT中GhCKI的拷貝數分析示意圖。圖11為一種克隆的GhCKI基因的開放讀碼框序列。具體實施例方式實施例I:GhCKI基因分離克隆I、表達譜分析本申請人前期工作是對陸地棉‘84021’和‘H05’高溫脅迫下花藥進行表達譜分析(見圖Ia)，通過基因表達聚類分析，分離出一類在兩種棉花品種中表達變化趨勢相反的基因，后從這一類基因中分離出一條與其他植物CKI高度同源的序列，并對這條序列進行表達分析(見圖lb)。與其他物種CKI基因的進化分析，生物信息學分析表明，該序列與擬南芥的AtCKIL2(ATlG72710)同源性最高，并將其命名為GhCKI(見圖2)。從陸地棉品系‘84021’和‘H05’中提取高溫處理及正常溫度下開花當天開裂之前的花藥的總RNA(提取方法根據Zhu等，AnimprovedsimpleprotocolforisolationofhighqualityRNAfromGossypiumspp.suitableforcDNAlibraryconstruction,ActaAgronomicaSinica.2005,31.1657-1659.)，利用反轉錄酶SuperscriptIII(購自Invitrogen公司，美國)將其反轉錄合成cDNA，反應條件為65°C5min,50°C60min,70°CIOmin02、基因序列犾得米用RACE(rapid-ampIifixationofcDNAends)(Frohman等，Rapidproductionoffull-lengthcDNAsfromraretranscriptsamplificationusingasinglegene-specificoligonucleotideprimer.PNAS1988,85,8998-9002.)擴增出cDNA5，和3’端，序列拼接后得到GhCKI的cDNA序列(SEQIDNO.I)，一種分離的基因的cDNA，其序列為SEQIDNo.I所不的核苷酸序列。再通過ORFFinder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)對獲得的cDNA進行分析，確定包含一個完整的0RF，后用引物GhCKI-F(5’ATGGAACCTTGTGTTGGTAATAAG’)和GhCKI-R(5，TTAATAGTGAATTCTCTCGTCGCC3’)擴增出GhCKI基因的0RF(1392bp)。PCR反應條件為94°C預變性3min;94°C30sec，55°C30sec，72°CImin20sec，32個循環；72°C延伸lOmin。將擴增獲得的PCR產物連入pGEM_T載體(購自Promega公司，美國)，篩選陽性克隆并測序，獲得所需的基因0RF(SEQIDNO.2)，一種分離的基因的0RF,其序列為SEQIDNo.2所不的核苷酸序列。通過BlastX(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)確定ORF所對應的463個氨基酸的蛋白質序列(SEQIDNO.3)是與CKI蛋白同源的。一種分離的蛋白質，其序列為與SEQIDNo.3所示的氨基酸序列。實施例2GhCKI在棉花不同組織的表達分析以陸地棉YZl為材料，提取以下7個不同組織的RNA，用Rea-timePCR和Northernblot檢測GhCKI基因的表達水平。選取的7個組織分別是1.花瓣；2.ODPA纖維；3.5DPA纖維；4.胚珠；5.花藥；6.葉片；7.柱頭。棉花總RNA提取方法根據上述Zhu等(AnimprovedsimpleprotocolforisolationofhighqualityRNAfromGossypiumspp.suitableforcDNAlibraryconstruction.ActaAgronomicaSinica.2005,31.1657-1659.)發表的文獻，RNA提取完成后后用DNaseI(購自Promega公司)處理，RNA完整性通過I.2%(w/v)瓊脂糖膠(EtBr)電泳檢測(5V/cm)。核酸濃度的測定在BeckmanDU800spectrophotometer上進行。RNA260/280比值在I.9到2.I之間，260/230比值大于2.O的RNA用于下一步的分析。cDNA的合成是以3μg總RNA為模版，與IμI500μg/mloligo-dT(15)引物(購自Promega公司，美國)，IμIIOmMdNTP,DEPC-water混合，總體積為12μI;然后65°C變性5min冰上驟冷；再加入8μI含有4μIRTbuffer,2μIO.IMdithiothreitol,40unitsofRNasinRibonucleaseInhibitor(Promega),和200unitsofSuperscriptIIIRT(購自Invitrogen公司，美國)的混合液；50°C溫浴Ih合成第一鏈；反應結束后75°C處理15min使SuperscriptIIIRT失活。每份cDNA稀釋到300μI后-20V保存待用。以上述反轉錄合成的cDNA為模板，用引物GhCKIRt-F(5'TTGATTCTGCCGACCCTAAGC3')和GhCKIRt-R(5'ATTCCTTTGAGGGCCGCTTC3')對GhCKI基因進行特異的PCR擴增(擴增產物長83bp)。同時用弓I物UB7-F(5'GAAGGCATTCCACCTGACCAAC3')和UB7-R(5'CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG3')對棉花GhUbi7(GenBank登陸號DQ116441)基因做特異擴增(擴增產物長198bp)，以作為內對照進行相對定量分析。定量PCR儀為ABI7500，定量PCR試劑購自Bio-Rad公司。PCR反應體系(20μI)包括IμI稀釋后的cDNA(等于IOng起始總RNA)，10μI2XPCRMasterMix，200nM的引物。反應條件為95°C30sec；95°C5sec,60°C35sec，40個循環。反應過程中進行熒光檢測實時定量分析。結果表明本發明克隆的基因GhCKI在所選取的組織中的表達量在花藥中是最高的(見圖3)。實施例3超量表達載體及RNAi抑制表達載體的構建和轉化為了驗證GhCKI基因的功能，申請人構建了超量表達和RNAi抑制表達載體轉化棉花，并且利用超量表達載體還轉化了擬南芥。根據實施例I中得到GhCKIORF設計超表達引物，在引物兩端分別加上XbaI和SacI的酶切位點及保護堿基，分別將該引物命名為引物GhCKIoe-F和GhCKIoe-R，再以GhCKI基因的cDNA為模板進行PCR擴增，得到的PCR產物使用限制性內切酶XbaI和SacI(NEB公司)完全消化，將酶切產物使用O.8%瓊脂糖凝膠電泳(80V，40分鐘)，挖取約I.4kb的DNA片斷回收。取回收產物lOOng，與經過限制性內切酶XbaI和SacI(NEB公司)消化過的雙元載體pCABIA2300S(pCAMBIA2300S載體的前體是由澳大利亞CAMBIA實驗室CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriculture惠贈的pCAMBIA2300。將pCAMBIA2300載體上的CaMV35S啟動子通過酶切連接反向整合到PCAMBIA2300的多克隆位點上，即得到本發明的所用載體pCAMBIA2300S)50ng使用T4DNA連接酶(NEB公司)于16°C進行連接反應，反應進行16小時后，取連接產物2μI電轉化大腸桿菌(E.Coli)感受態細胞ToplO(購自美國Invitrogen公司)，轉化產物進行蘭白斑篩選。挑取白色轉化子，使用GhCKI基因特異的引物a和b組合進行PCR陽性克隆的篩選，PCR反應條件先94°C5分鐘變性，然后94°C30秒，55°C30秒，72°CI分鐘，總共進行25個循環，最后72°C7分鐘延伸。獲得了用于轉化的超量表達質粒p35s-GhCKI見(圖4)。根據GhCKI基因與其它植物的CKI的比對結果在特異區設計RNAi引物，在引物的兩端分別加上用于重組的attB位點序列及保護堿基，分別將該引物命名為引物GhCKIri-F和引物GhCKIri-R，再以實施例I中得到GhCKI基因cDNA為模板進行PCR擴增，得到的產物通過BP重組反應導入RNAi載體pHellsgate4(重組酶購自Invitrogen公司，美國；RNAi載體見Wesley等，Constructdesignforefficient,effectiveandhigh—throughputgenesilencinginplants.PlantJ.2001.27，581-590.)，構建的RNAi載體pHellsgate4_GhCKIi見(圖5)。引物序列如下GhCKIoe-F5/ACCGAGCTCTTGAAGTTGATTGATGGAACCTTGTGTTGG3'GhCKIoe-R5/AGCTCTAGACCAAGCGTTTAATAGTGAATTCTCTCGTCGC3'GhCKIri-F5'GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGGTATCAGCAATCACAGTTGACCAATC3'；GhCKIri-R5!GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGATAGTGAATTCTCTCGTCGCCT3!將構建的載體轉化農桿菌菌株GV3101(Roger等，AguidetoAgrobacteriumbinaryTivectors.Trendsinplantscience.2000.5，1360-1385.)，以下GV3101來源同，再通過農桿菌介導的轉化方法轉化棉花和擬南芥。轉化棉花所釆用的轉化受體材料為YZ-1，此材料是本實驗室經過大量的篩選發現的一個具有很高胚胎發生能力的材料，農桿菌介導的轉化棉花的轉化方法和程序參照Jin等建立的高效轉化體系(Identificationofanovelelitegenotypeforinvitrocultureandgenetictransformationofcotton.BiologiaPlantarum，2006，50:519_524；Anefficientgraftingsystemfortransgenicplantrecoveryincotton(GossypiumhirsutumL.).PlantCell,TissueandOrganCulture，85:181-185，2006；FactorsaffectingstabletransformationandplantregenerationduringtransformingembryogeniccallusofUplandcotton(GossypiumhirsutumL)viaAgrobacteriumtumefaciens，PlantCell，TissueandOrganCulture，81:229_237，2005)，具體方法和流程如下I、無菌苗的培養將將棉花品系YZ-I(參見Jin等的文獻(Identificationofanovelelitegenotypeforinvitrocultureandgenetictransformationofcotton.BiologiaPlantarum,2006，50:519_524)棉桿殼去掉，用0·1/100的升萊滅菌IOmin,無菌水沖洗三遍，接種于無菌苗培養基上(配方如下1/2MS大量元素+葡萄糖15g/L+植物膠phytagel(購自sigma公司，美國)2.5g/L),在28°C暗培養3-6天。2.農桿菌的活化和保存2.I準備農桿菌GV3101，制備含卡那霉素50mg/L的MGL液體培養基(配方胰化蛋白胨5g/L，氯化鈉5g/L，MgSO4.7H20O.lg/L，KH2PO4O.25g/L，甘露醇5g/L，甘氨酸I.0g/L，調pH至7.0)，無菌三角瓶，LB(固、液)培養基(含卡那霉素50mg/L)，滅菌甘油，無菌槍頭，無菌I.5mL離心管。2.2操作2.2.I活化，懸浮從超低溫冰箱內取出保存的含有目標基因的GV3101菌株的甘油管在冰上融化，LB平皿上劃線，26.5°C暗培養36-48h，待皿內長出清晰的單菌落，挑取單菌落在另外的LB平皿劃線，26.5°C暗培養36-48h，待皿內長出足夠的菌落結束培養，把培養基表面菌落刮入三角瓶內的MGL培養基中，27°C、200rpm搖2h，OD值在0.5-1.5之間即可用于侵染。2.2.2菌株的保存從培養皿內挑取單菌落接于LB液體培養基中150rpm，26°C搖48h，按菌液和甘油體積比為I:I加入I.5mL離心管混勻，-70°c保存。3.浸染，共培養3.I準備暗培養5天左右幼嫩健壯的YZ-I幼苗，經活化的農桿菌，無菌培養皿和無菌濾紙坐寸O3.2操作無菌條件下將YZ-I幼苗下胚軸用鋒利的刀片切成O.5-lcm長的切段，轉入到經活化的農桿菌菌液中，攪勻，靜置5-10min，倒掉菌液，濾紙吸干殘余菌液，吹5min使表面稍為干燥，分散布于墊有濾紙的共培養培養基中(配方MS無機鹽+B5有機物+2，4-DO.Img/L+KTO.lmg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L,pH7.O)，20°C暗培養38_42h。4.愈傷組織的誘導將侵染共培養后的下胚軸切段接種于誘導培養基上(配方如下MS無機鹽+B5有機物+2,4-DO.lmg/L+KTO.lmg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L,pH5.8)。5、非胚性愈傷組織的增殖非胚性愈傷組織的增殖培養基如下所示MS無機鹽(硝酸鉀加倍，硝酸銨減半)+B5有機物+2,4-DO.05mg/L+KT0.lmg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g//L,pH5.8。6、愈傷組織的分化愈傷組織經繼代(一個月繼代一次)幾次后，有的愈傷組織轉成米粒狀顆粒，將其轉入分化培養基上(配方MS基本培養基+B5有機物+激動素(KT)O.15mg/L+吲哚丁酸(IBA)O.5mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L,調pH至5.8),進一步分化成胚狀體。7、胚性愈傷組織的繼代胚性愈傷組織的繼代培養基如下所示MS無機鹽(其中硝酸鉀加倍，硝酸銨減半)+B5有機物+ΚΤ0.15mg/L+IBA0.5mg/L+Gln(谷胺酰胺)I.Omg/L+天冬酰胺(Asn)O.5mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L,ρΗ5·8ο8、成苗生根培養將分化出的小苗繼代到1/2MS培養基中成苗生長培養基上(配方1/2MS無機鹽+B5有機物+葡萄糖15g/L+phytagel2.5g/L,pH5.8)。9、煉苗移栽將生根良好的小苗揭開三角瓶封口膜，煉苗2-3天，然后移栽到小土缽中，遮蔭緩苗一周左右移栽大田。轉化擬南芥采用的受體材料為Col野生型，農桿菌介導的花器浸醮法轉化擬南芥的轉化方法和程序參照(Zhang等，Agrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthalianausingthefloraldipmethod.NatureProtocols,2006.I641-646)。附MS培養基母液配制I.配制大量元素時各種藥品分別稱量，分別充分溶解再逐一加到容量瓶中(最后加入CaCl2否則容易產生沉淀)，定容到一升。2.配制微量元素時幾種極微量藥品先可以配成一級母液(濃縮10000倍)，再稀釋成二級母液(濃縮100倍)，母液配制完畢后放置于室溫(20-25°C，以下相同)下IOh以上，看是否有沉淀產生，然后才能使用。3.配制鐵鹽時，兩種鹽用熱水分別溶解，然后混合，放置于室溫下IOh以上看是否有沉淀產生，然后才能使用。4.各種生長激素一般可以用lmol/L的NaOH或HCl溶解后，再定容。5.配制B5有機物時要用無菌水來配制，一次不要配太大體積，及時用完以防污染6.各種母液配制好后應存放在4°C冰箱中，發現有沉淀后，不得使用。0106]大量元素(20倍)母液(g/L)0107]KN0338；0108]NH3N0333；0109]MgS04·7H20(無水MgS04)7.4(3.8)；0110]KH2P043.4；0111]CaC12·2H20(無水CaC12)8·8(6·6)。0112]微量元素(100倍)母液(g/L)0113]CoC12·6H200.0025;0114]CuS04·5H200.0025;0115]H3B03O.62；0116]KI0.083;0117]MnS04·4H202.23；0118]NaM04·2H200.025;0119]ZnS04·7H200.86。0120]鐵鹽(100倍)母液(g/I)0121]FeSO4·7H202.78；0122]Na2EDTA3.73。0123]B5有機物0124]VBl(硫胺素)10mg/L;0125]VB5(鹽酸吡哆醇)lmg/L；0126]VB6(煙酸)lmg/L;0127]肌醇100mg/L;0128]甘氨酸2mg/L。0129]實施例4:p35s_GhCKI轉基因株系相關分析l、p35s_GhCKI轉基因株系表達分析GhCKI基因超量表達轉基因棉花得到12個家系，轉基因擬南芥得到16個家系。對轉基因株系提取RNA，進行表達分析，方法同于實施例2，結果見(圖7和9)。2、p35s_GhCKI轉基因株系表型分析對表達量分析后，對不同表達水平的轉基因株系開花當天的花藥進行光學拍照觀察，結果發現超量表達的轉基因棉花和擬南芥開花當天花藥不能正常開裂(見圖6和8)。后對不同表達量的轉基因擬南芥純合系的花藥進行光學顯微觀察，結果表明高量表達的家系有花藥不開裂的表型，導致植株育性嚴重下降，而雜合時和中等表達量的家系的花藥發育正常，育性正常。3、p35s_GhCKI轉基因株系拷貝數分析對轉基因擬南芥6個家系進行Southernblotting分析(DNA提取和Southern實驗參照J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，分子克隆實驗指南(第三版)，科學出版社，2002版)，實驗結果表明6個家系有著不同的插入位點(見圖10)。權利要求1.一種分離的基因的CDNA，其序列為SEQIDNo.I所示的核苷酸序列。2.一種分離的基因的ORF，其序列為SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。3.一種分離的蛋白質，其序列為與SEQIDNo.3所示的氨基酸序列。4.一種過量表達載體p35s-GhCKI,其特征在于含有任選權利要求I或2所述的其中之一核苷酸片段的表達載體。5.根據權利要求4所述的一種棉花酪蛋白激酶基因，其特征在于所述的表達載體為植物表達載體PCAMBIA2300S。6.權利要求I或2所述的一種棉花酪蛋白激酶基因在控制棉花花藥發育中的應用。全文摘要本發明公開了一種棉花酪蛋白激酶基因及應用，涉及一種從棉花花藥表達譜中鑒定的控制花藥發育的基因GhCKI的分離克隆、功能驗證和應用。GhCKI基因編碼的蛋白與擬南芥ATCKL2基因編碼的蛋白有72%的同源性，GhCKI基因在花藥中優勢表達，具有控制花藥發育的功能，通過遺傳轉化可應用于各種植物不育系的培育，同時可作為高溫脅迫下植物花藥育性穩定性的標記基因。文檔編號C12N9/12GK102925466SQ20111023172公開日2013年2月13日申請日期2011年8月12日優先權日2011年8月12日發明者張獻龍,朱龍付,閔玲,涂禮莉申請人:華中農業大學