專利名稱：HLA-A^*1101限制的WT1肽及含有其的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及HLA_A*1101限制的WTl肽，具體而言為含有由WTl蛋白質9個鄰接氨基酸組成的氨基酸序列的肽，其中該肽具有結合HLA-A*1101分子的能力，并且具有誘導CTL 的能力。本發明也涉及具有結合HLA-A*1101分子的能力并且具有誘導CTL的能力的肽二聚體，其中兩個肽單體通過二硫鍵彼此結合，所述肽單體各自含有由WTl蛋白質9個鄰接氨基酸組成并且含有至少一個半胱氨酸殘基的氨基酸序列。此外，本發明涉及編碼該肽的多核苷酸、含有其的用于治療和/或預防癌癥的藥物組合物等。
背景技術：
WTl基因(Wilms氏腫瘤1基因)被鑒定為負責兒童腎癌Wilms腫瘤的基因(非專利文件1和2)。WTl是具有鋅指結構的轉錄因子。最初，認為WTl基因是腫瘤抑制基因。 然而，后來的研究(非專利文件3、4、5和6)顯示WTl基因相反在造血腫瘤和實體癌中起到癌基因的功能。WTl基因在許多類型的惡性腫瘤中高水平表達。于是，已檢查無突變的WTl基因產物(其是自身蛋白質)是否在活體中具有免疫原性。結果揭示，在腫瘤細胞中高水平表達的衍生自WTl基因的蛋白質通過細胞內加工進行片段化，產生的肽與MHC I類分子形成復合物，且該復合物被呈遞在細胞表面，而識別這種復合物的CTL可以通過肽接種誘導(非專利文件7、8和9)。在以WTl肽或WTl cDNA免疫的小鼠中也顯示，表達WTl基因的移植的腫瘤細胞以高概率被排斥(非專利文件7和10)，然而生理上表達WTl基因的正常組織沒有被所誘導的CTL損傷(非專利文件7)。使用人細胞的體外實驗顯示，當使用DbU6肽或WH187 肽(SEQ ID No 1的氨基酸187-195，SLGEQQYSV)刺激具有HLA-A*0201的人外周血單核細胞時，WTl特異性CTL得到誘導，而誘導的CTL對內源性高水平表達WTl基因的腫瘤細胞具有特異的細胞毒活性，且這種CTL的細胞毒活性是HLA-A2限制的(非專利文件11)，其中所述Db 1 肽或WH187肽具有結合人MHC I類分子之一 HLA_A*0201分子的高能力。使用與 HLA-A*2402(最常見于日本人HLA-A等位基因)匹配的WTl肽(WT1235 ；SEQ ID No 1的氨基酸235-M3，CMTWNQMNL)的人細胞體外實驗顯示，WTl特異性CTL (TAK-I)得到誘導(非專利文件12)，而誘導的CTL不抑制正常造血干細胞的集落形成活性，所述正常造血干細胞部分生理上表達WTl基因(非專利文件12和1 。這些報告強烈提示，WTl特異性CTL不僅在小鼠而且在人類中是可誘導的，這種CTL對以高水平表達WTl基因的腫瘤細胞具有細胞毒活性，但是對生理上表達WTl基因的正常細胞不具有細胞毒活性(非專利文件7、10、 11,12 和 13)。WTl基因產物作為核蛋白存在，并在細胞質中由蛋白酶體加工以片段化為肽。片段化的肽由TAP(抗原肽轉運體)分子轉運到內質網腔中，與MHC I類分子形成復合物，并且呈遞在細胞表面上。作為CTL前體細胞經TCR識別WTl肽-MHC I類分子復合物的結果， WTl特異性CTL得到誘導，從而對通過MHC I類分子呈遞WT 1基因產物的腫瘤細胞施加細胞毒作用(非專利文件7、8和9)。于是，至少要求用于靶向WTl基因產物的癌癥免疫治療中的WT 1肽是在活體中與MHC I類分子結合的形式。然而，MHC I類分子是多樣的，與各自MHC I類分子結合的WT 1肽的氨基酸序列彼此不同。因此，要求提供與MHC I類各亞型匹配的肽。然而，迄今為止僅僅已知HLA-Al402分子、HLA-A*0201分子、HLA_Al601分子和 HLA-A*3303分子限制的肽是HLA分子限制的WT 1肽(分別見專利文件1、非專利文件11、 專利文件2和專利文件3)。因此，需要發現HLA-A*1101限制的WTl肽。專利文件1 :W0 2003/106682專利文件2 :W0 2005/095598專利文件3 日本專利申請號2006-45287非專利文件1 =Daniel A. Haber 等人，Cell. 1990Jun 29 ；61 (7) :1257-69.非專利文件2 =Call KM 等人，Cell. 1990Feb 9 ；60 (3) :509-20.非專利文件3 =Menke AL 等人，Int Rev Cytol. 1998 ；181 :151-212.綜述。非專利文件4 =Yamagami T 等人，Blood. 1996 Apr 1 ；87 (7) :2878-84.非專利文件5 Jnoue K 等人，Blood. 1998 Apr 15 ；91 (8) :2969-76.非專利文件6 =Tsuboi A 等人，Leuk Res. 1999 May ；23 (5) :499-505.非專利文件7:0ka Y 等人，J Immunol. 2000 Feb 15 ； 164 (4) :1873-80.非專利文件8 =MeliefCJ 等人，Immunol Rev. 1995 Jun ； 145 :167-77.非專利文件9 =Ritz J, J Clin Oncol. 1994 Feb ；12(2) :237-8.非專利文件10 =Tsuboi A 等人，J Clin Immunol. 2000May ；20 (3) :195-202.非專利文件11 :0ka Y 等人，Immunogenetics. 2000Feb ；51 (2) :99-107.非專利文件12 =Ohminami H 等人，Blood. 2000 Jan 1 ；95(1) :286-93.非專利文件13 :Gao L 等人，Blood. 2000 Apr 1 ；95 (7) :2198-203.

發明內容
本發明擬解決的問題本發明擬解決的問題是提供HLA-A*1101分子限制的且包含WTl蛋白質氨基酸序列的肽、編碼其的多核苷酸、以及包含其的用于治療和/或預防癌癥的藥物組合物等。解決問題的方法作為考慮到上述情況的大量研究的結果，本發明人已發現，在各自含有由WTl蛋白質9個鄰接氨基酸組成的氨基酸序列的肽中，各自具有結合HLA-A*1101分子的能力的肽能夠以高比率誘導WTl特異性CTL。因此，本發明得以完成。本發明提供(1)含有由WT 1蛋白質9個鄰接氨基酸組成的氨基酸序列的肽，其中該肽具有結合HLA-A*1101分子的能力，并且具有誘導CTL的能力；(2)根據⑴的肽，其中氨基酸序列第9位氨基酸是Lys或Arg;(3)根據⑴的肽，其中氨基酸序列選自
Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys(SEQ ID No 2),Pro lie Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg(SEQ ID No :3)，Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys(SEQ ID No :4)，Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg(SEQ ID No :5)，Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys (SEQ ID No :6)，Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys(SEQ ID No :7)，Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg(SEQ ID No :8)，Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys(SEQ ID No :9)，和Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys(SEQ ID No :10)；(4)根據(3)的肽，其中氨基酸序列是Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys(SEQ ID No 2)；(5)具有結合HLA-A*1101分子的能力并具有誘導CTL能力的肽二聚體，其中兩個肽單體通過二硫鍵彼此結合，所述肽單體各包含由WTl蛋白質9個鄰接氨基酸組成并包含至少一個半胱氨酸殘基的氨基酸序列；(6)根據(5)的肽二聚體，其中肽單體的氨基酸序列選自Pro lie Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg(SEQ ID No :3)，Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys(SEQ ID No :7)，Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg(SEQ ID No :8)，和Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys(SEQ ID No :9)；(7)治療或預防癌癥的藥物組合物，包含(1)的肽和/或(5)的肽二聚體；(8)治療或預防癌癥的方法，包括向HLA-A*1101陽性受試者施用有效量的(1)的肽和/或(5)的肽二聚體；(9)編碼(1)的肽的多核苷酸；(10)含有(9)的多核苷酸的表達載體；
(11)治療或預防癌癥的藥物組合物，包含(9)的多核苷酸或(10)的載體；(12)治療或預防癌癥的方法，包括向HLA-A*1101陽性受試者施用有效量的(9)的多核苷酸或(10)的載體；(13) WTl特異性CTL,所述WTl特異性CTL由(1)的肽和/或(5)的肽二聚體誘導；(14)誘導WTl特異性CTL的方法，包括在(1)的肽和/或(5)的肽二聚體的存在下培養外周血單核細胞，以從外周血單核細胞誘導WTl特異性CTL ；(15)誘導WTl特異性CTL的試劑盒，包括⑴的肽和/或(5)的肽二聚體作為基本組分；(16)呈遞WTl肽的抗原呈遞細胞，所述抗原呈遞細胞由⑴的肽和/或(5)的肽二聚體誘導；(17)誘導呈遞WTl肽的抗原呈遞細胞的方法，包括在⑴的肽和/或(5)的肽二聚體的存在下培養未成熟抗原呈遞細胞，以從未成熟抗原呈遞細胞誘導呈遞WTl肽的抗原呈遞細胞；(18)誘導呈遞WTl肽的抗原呈遞細胞的試劑盒，包括⑴的肽和/或(5)的肽二聚體作為基本組分；以及(19)診斷癌癥的方法，包括使用(13)的CTL或(16)的抗原呈遞細胞。發明效果本發明提供HLA-A*1101限制的并含有由WTl蛋白質9個鄰接氨基酸組成的氨基酸序列的肽、編碼其的多核苷酸、以及包含其的治療和/或預防癌癥的藥物組合物等。因此，可能在具有HLA-A*1101的受試者中體內或體外誘導WTl特異性CTL。因為日本人中 HLA-A*1101陽性率是高的(約17.9%)，所以可以在大范圍受試者中誘導WTl特異性CTL。


圖1表示以WTl251誘導的CTL的細胞毒活性。圖2表示以WTl279誘導的CTL的細胞毒活性。圖3表示以WTl312誘導的CTL的細胞毒活性。圖4表示以WTl313誘導的CTL的細胞毒活性。圖5表示以WTl338誘導的CTL的細胞毒活性。圖6表示以WTl378誘導的CTL的細胞毒活性。圖7表示以WTl386誘導的CTL的細胞毒活性。圖8表示以WTl415誘導的CTL的細胞毒活性。圖9表示以WTl436誘導的CTL的細胞毒活性。圖10表示以WTl378肽誘導的CTL的細胞毒活性(a、b禾Π c分別表示使用 HLA-A*1101-陽性健康供體1、2和3的PBMC觀察到的細胞毒活性)。圖11表示以WTl378肽二聚體誘導的CTL的細胞毒活性(a和b分別表示使用 HLA-A*1101-陽性健康供體1和2的PBMC觀察到的細胞毒活性)。圖12表示以修飾的WTl378肽(G — I)誘導的CTL的細胞毒活性(a、b和c分別表示使用HLA-A*1101-陽性健康供體1、2和3的PBMC觀察到的細胞毒活性)。圖13表示以修飾的WTl378肽(G — V)誘導的CTL的細胞毒活性(a、b和c分別表示使用HLA-A*1101-陽性健康供體1、2和3的PBMC觀察到的細胞毒活性)。圖14表示以WTl379肽誘導的CTL的細胞毒活性(a、b禾Π c分別表示使用 HLA-A*1101-陽性健康供體1、2和3的PBMC觀察到的細胞毒活性)。
具體實施例方式一方面，本發明涉及含有由WTl蛋白質9個鄰接氨基酸組成的氨基酸序列的肽， 其中該肽具有結合HLA-A*1101分子的能力，并且具有誘導CTL的能力(在此也稱為“WT1 肽”)。人WTl蛋白質的氨基酸序列示于SEQ ID No :1。本發明的肽含有由SEQ ID No 1所示氨基酸序列中9個鄰接氨基酸組成的氨基酸序列。當本發明的肽含有包含半胱氨酸的氨基酸序列時，可以通過用另一種物質例如另一個氨基酸(例如絲氨酸、丙氨酸和α-氨基丁酸)置換氨基酸序列中的半胱氨酸、或者通過以本領域已知的保護基團(例如羧甲基或吡啶基乙基)修飾半胱氨酸的SH基，來增加穩定性，所述包含半胱氨酸的氨基酸序列例如下述SEQ ID Νο:3、7、8或9的氨基酸序列。本發明的肽是癌抗原肽，作為通過抗原呈遞細胞呈遞由本發明的肽在細胞內經加工而嚴生的肽的結果，所述癌抗原肽可以誘導CTL。
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如上所述，本發明目的是獲得HLA-A*1101限制的肽。因此，本發明的肽具有結合 HLA-A*1101分子的能力。可以通過本領域已知方法確定該結合能力。這種方法的實例包括基于計算機的方法(例如Rankp印、BIMAS或SYFPEITHI)和使用已知具有結合HLA_A*1101 分子的能力的肽的競爭結合測試。例如，可以將確定的結合能力與已知HLA-A*1101限制的肽的能力相比較，以判斷本發明的肽是否具有結合能力。根據本發明的具有結合能力的肽的實例包括如由實施例1中所述方法確定的與HLA-A*1101分子親和力分數為4或更高、優選5或更高、更優選6或更高的肽。本發明的肽另外具有誘導CTL的能力。例如在造血腫瘤如白血病、骨髓異常增生綜合征、多發性骨髓瘤或惡性淋巴瘤和實體癌如胃癌、結腸癌、肺癌、乳癌、生殖細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌或卵巢癌中，WTl基因以其天然形式在高水平表達。因此，本發明的肽可以在罹患這種疾病的受試者中以高比率誘導CTL。誘導CTL的能力指體內或體外誘導CTL的能力。可以使用常用方法確定這種能力，例如其中使用Cr釋放測定確定CTL的細胞毒活性的方法。本發明的肽可以在氨基酸序列第9位具有Lys或Arg。認為該肽結合HLA-fllOl 分子的能力通過具有這種氨基酸而更高。本發明的肽中包含的由9個氨基酸組成的氨基酸序列優選是Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys (SEQ ID No 2)、Pro lie Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg (SEQ ID No :3)、Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys(SEQ ID No 4),Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg (SEQ ID No 5) ,Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys (SEQ ID No :6)、Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys(SEQ ID No :7)、 Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg (SEQ ID No :8)、Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys (SEQ ID No :9)或 Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys (SEQ ID No : 10)。最優選的，它是Thr Gly Val LysPro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID No :7)。另外，它可以在SEQ ID Nos :2-10中任一項的9個氨基酸中具有以其他氨基酸置換一至幾個、優選一至五個氨基酸。9個氨基酸或其他置換的氨基酸中任一個可以經過適當修飾。在任何情況下，本發明的肽保持結合HLA-A*1101分子的能力。如上所述，本發明的肽可以是任一個肽，只要其含有衍生自WTl蛋白質并由9個鄰接氨基酸組成的氨基酸序列。因此，本發明的肽可以是例如僅由SEQ ID No :2-10任一項所示氨基酸序列組成的肽，或者是包含EQ ID No :2-10任一項所示氨基酸序列的WTl蛋白質或其部分。本發明的肽中包含的氨基酸數目沒有具體限制，且該數目可以是例如9-500、 9-300、9-200、9-100、9-50、9-30和9_12個氨基酸。可以將各種物質附著在本發明的肽中由 9個鄰接氨基酸組成的氨基酸序列的N末端和/或C末端。例如，可以附著氨基酸、肽或其類似物。如果將這種物質附著在本發明的肽上，可以由活體中的酶或者通過例如細胞內加工等過程對該物質進行加工，且最終，可以產生由9個鄰接氨基酸組成的氨基酸序列，并將其作為與HLA-A*1101分子的復合物呈遞在細胞表面，從而導致誘導CTL的作用。該物質可以是調節本發明的肽的溶解度或增加其穩定性(對蛋白酶的抗性等)的物質。另外，它可以是將本發明的肽特異性遞送到例如給定組織或器官的物質，或者它可以具有增加抗原呈遞細胞的吸收效率等作用。該物質可以是增加誘導CTL的能力的物質，例如輔助肽等。可以通過本領域通用方法或其修改合成本發明的肽。在例如P印tide Synthesis, Interscience, New York,1966 ；The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York,1976 ；Peptide-Gosei, Maruzen Co., Ltd. ,1975 ；Peptide-Gosei No Kiso To Jikken, Maruzen Co., Ltd. ,1985 ；以及 IyakuhinNo Kaihatsu(Zoku), Vol. 14, Peptide-Gosei, Hirokawa-Book store, 1991中對這種方法進行了描述。也可以使用遺傳工程技術制備本發明的肽，所述遺傳工程技術基于編碼本發明的肽的核苷酸序列信息。這種遺傳工程技術為本領域技術人員所公知。另一方面，本發明涉及具有結合HLA-A*1101分子的能力和誘導CTL的能力的肽二聚體，其中兩個肽單體通過二硫鍵彼此結合，所述肽單體各包含由WTl蛋白質9個鄰接氨基酸組成并含有至少一個半胱氨酸殘基的氨基酸序列(此后稱為“WT1肽二聚體”)。與肽單體相比，本發明的肽二聚體的穩定性通過形成二聚體而增加。本發明的肽二聚體是腫瘤抗原肽二聚體，作為通過抗原呈遞細胞呈遞本發明的肽在細胞中經加工而產生的肽的結果， 所述腫瘤抗原肽二聚體可以誘導CTL。兩個肽單體通過存在于單體中的半胱氨酸殘基之間的二硫鍵而結合，形成本發明的肽二聚體。因此，本發明的WTl肽二聚體中包含的各個肽單體是如上所述的WTl肽，并且含有至少一個半胱氨酸殘基。本發明的WTl肽二聚體可以是同二聚體或異二聚體。在本發明的WTl肽二聚體中，肽單體包含的氨基酸序列優選是ftx) lie Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg(SEQ ID No :3)、Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys(SEQ ID No 7)、Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg(SEQ ID No :8)或 Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys (SEQ ID No :9)。最優選的，它是Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID No 7)。可以使用本領域已知方法制備本發明的WTl肽二聚體。例如，如果肽單體含有一對半胱氨酸，那么可以通過例如去除所有保護基團(包括半胱氨酸側鏈上的)，然后將產生的單體溶液在堿性條件下空氣氧化，或者在堿性或酸性條件下加入氧化劑以形成二硫鍵， 來制備本發明的WTl肽二聚體。氧化劑的實例包括碘、二甲基亞砜(DMSO)和鐵氰化鉀。當各肽單體包含兩個或更多半胱氨酸殘基時，也可以通過上述方法制備本發明的 WT 1肽二聚體。對于這種情況，由于不同類型的二硫鍵而獲得異構體。可選擇地，可以通過選擇半胱氨酸側鏈保護基團的組合而制備本發明的WTl肽二聚體。保護基團組合的實例包括MeBzl (甲芐基)基團和Acm(乙酰氨基甲基)基團、Trt (三苯甲基)基團和Acm基團、 Npys (3-硝基-2-吡啶基硫代)基團和Acm基團、以及S_Bu_t (S-叔丁基)基團和Acm基團的組合。例如，對于MeBzl基團與Acm基團的組合的情況，可以通過去除除了 MeBzl基團之外的保護基團和除了半胱氨酸側鏈上的保護基團之外的保護基團，將產生的單體溶液進行空氣氧化，以形成受保護的半胱氨酸殘基之間的二硫鍵，然后去保護并使用碘氧化，以形成先前以Acm保護的半胱氨酸殘基之間的二硫鍵，來制備WTl肽二聚體。另一方面，本發明涉及治療或預防癌癥的藥物組合物，所述藥物組合物包含 HLA-A*1101限制的WTl肽和/或WTl肽二聚體。WTl基因在各種癌癥和腫瘤中高水平表達， 所述癌癥和腫瘤包括造血腫瘤例如白血病、骨髓異常增生綜合征、多發性骨髓瘤或惡性淋巴瘤和實體癌如胃癌、結腸癌、肺癌、乳癌、生殖細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌或卵巢癌。因此，本發明的藥物組合物可用于癌癥的治療或預防。當將本發明的藥物組合物施用于HLA-A*1101陽性受試者時，WTl特異性CTL由該藥物組合物中包含的HLA-A*1101限制的WT 1肽或WTl肽二聚體誘導，而受試者中的癌細胞被這種CTL損傷。
本發明的藥物組合物除了作為活性成分的HLA_A*1101限制的WTl肽和/或WTl肽二聚體之外，可以包含例如載體、賦形劑等。本發明的藥物組合物中包含的HLA-A*1101限制的WTl肽或WTl肽二聚體誘導WTl特異性CTL。因此，本發明的藥物組合物可以包含合適的佐劑，或可以與合適的佐劑一起施用以增強誘導效率。優選佐劑的實例包括但不限于完全或不完全弗氏佐劑和氫氧化鋁。可以依賴于狀況例如疾病類型、受試者的狀況或靶位點，適當選擇本發明的藥物組合物的施用方法。這種方法的實例包括但不限于皮內施用、皮下施用、肌內施用、靜脈內施用、經鼻施用和經口施用。可以依賴于狀況例如疾病類型、受試者的狀況或靶位點，適當選擇本發明的藥物組合物中包含的肽或肽二聚體的量，以及本發明的藥物組合物的劑量形式、施用次數等。該肽的單次劑量通常為0. OOOlmg-lOOOmg，優選0. OOlmg-lOOOmg。另一方面，本發明涉及治療或預防癌癥的方法，包括將有效量的WTl肽和/或WTl 肽二聚體施用于HLA-A*1101陽性受試者。治療或預防的癌癥可以是任一種，且其實例包括造血腫瘤例如白血病、骨髓異常增生綜合征、多發性骨髓瘤或惡性淋巴瘤和實體癌如胃癌、 結腸癌、肺癌、乳癌、生殖細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌或卵巢癌。另一方面，本發明涉及確定HLA_A*1101陽性受試者中WTl特異性CTL的存在或量的方法，包括(a)將WTl肽和HLA-A*1101分子的復合物與來自受試者的樣品反應；并(b)確定該樣品中所含的識別復合物的CTL的存在或量。來自受試者的樣品可以是任一種，只要其可能含有淋巴細胞。樣品實例包括體液例如血液或淋巴和組織。可以使用本領域技術人員已知方法例如生物素-鏈霉抗生物素蛋白方法，將WTl肽和HLA-A*1101 分子的復合物制備為例如四聚體或五聚體。可以通過本領域技術人員已知方法測量識別這種復合物的CTL的存在或量。在本發明的這一方面，可以將復合物標記。可以將已知標記例如熒光標記或放射性標記用作標記。標記使得CTL存在或量的確定容易且快速。因此，本發明也提供在HLA-A*1101陽性受試者中確定WTl特異性CTL存在或量的組合物，其含有HLA-A*1101限制的WTl肽。另外，本發明提供在HLA-A*1101陽性受試者中確定WTl特異性CTL存在或量的試劑盒，其含有HLA-A*1101限制的WTl肽。另一方面，本發明涉及使用WTl肽和HLA_A*1101分子復合物產生WTl特異性CTL 的方法，包括(a)將該復合物與樣品反應；并(b)獲得該樣品中所含的識別復合物的CTL。WTl肽和HLA-A*1101分子的復合物如上所述。樣品可以是任一種，只要其可能含有淋巴細胞。樣品實例包括來自受試者的樣品，例如血液和細胞培養物。可以使用本領域技術人員已知方法例如FACS或MACS獲得識別該復合物的CTL。本發明允許培養獲得的WTl特異性CTL，并將其用于治療或預防各種癌癥。因此，本發明也涉及WT 1特異性CTL，可以通過使用WTl肽和HLA-A*1101分子的復合物產生WTl特異性CTL的方法獲得所述WTl特異性CTL。另一方面，本發明涉及編碼HLA-AHoi限制的WTl肽的多核苷酸。本發明的多核苷酸可以是DNA或RNA。可以基于HLA-A*1101限制的WTl肽的氨基酸序列確定本發明的多核苷酸的堿基序列。可以通過合成DNA或RNA的已知方法(例如化學合成方法)、PCR方法等制備所述多核苷酸。另一方面，本發明涉及含有所述多核苷酸的表達載體。可以依賴于所要引入本發明的表達載體的宿主類型、使用目的等，適當選擇表達載體的類型、除多核苷酸序列之外所含序列等。通過將本發明的表達載體施用于HLA-A*1101陽性受試者，以在活體中產生 HLA-A*1101限制的WTl肽及誘導WTl特異性CTL，并在受試者中損傷造血腫瘤細胞或實體癌細胞，可能治療或預防造血腫瘤或實體癌。另一方面，本發明涉及治療或預防癌癥的藥物組合物，包括多核苷酸或表達載體。 在此方面，本發明的藥物組合物的組成、施用方法等如上所述。另一方面，本發明涉及治療或預防癌癥的方法，包括將有效量的多核苷酸或表達載體施用于HLA-A*1101陽性受試者。治療或預防的癌癥的實例包括造血腫瘤例如白血病、 骨髓異常增生綜合征、多發性骨髓瘤或惡性淋巴瘤和實體癌如胃癌、結腸癌、肺癌、乳癌、生殖細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌或卵巢癌。另一方面，本發明涉及含有所述表達載體的細胞。可以通過例如以表達載體轉化宿主細胞例如大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞或動物細胞而制備本發明的細胞。可以從各種方法中適當選擇將表達載體引入宿主細胞的方法。通過培養轉化的細胞、且回收并純化產生的 WTl肽，可以制備本發明的肽。另一方面，本發明涉及WTl特異性CTL，所述WTl特異性CTL由HLA_A*1101限制的 WTl肽和/或WTl肽二聚體誘導。本發明的CTL識別WTl肽和HLA-A*1101分子的復合物。 因此，本發明的CTL可用于特異性損傷HLA-A*1101陽性和高水平表達WTl的腫瘤細胞。另一方面，本發明涉及治療或預防癌癥的方法，包括將WTl特異性CTL施用于 HLA-A*1101陽性受試者。可以依賴于狀況例如疾病類型、受試者的狀況或靶位點，適當選擇 WT 1特異性CTL的施用方法。這種方法的實例包括但不限于靜脈內施用、皮內施用、皮下施用、肌內施用、經鼻施用和經口施用。另一方面，本發明涉及誘導WTl特異性CTL的方法，包括在HLA_A*1101限制的WTl 肽和/或WTl肽二聚體的存在下培養外周血單核細胞，以從外周血單核細胞誘導WTl特異性CTL。外周血單核細胞來自的受試者可以是任一個，只要其是HLA-A*1101陽性的。通過在HLA-A*1101限制的WTl肽和/或WTl肽二聚體的存在下培養外周血單核細胞，從在外周血單核細胞中包含的CTL前體細胞誘導WT 1特異性CTL。通過向受試者施用根據本發明獲得的WTl特異性CTL，可能在HLA-A*1101陽性受試者中治療或預防造血腫瘤或實體癌。另一方面，本發明涉及誘導WTl特異性CTL的試劑盒，包含HLA_A*1101限制的WTl 肽和/或WTl肽二聚體作為基本組分。優選的，該試劑盒用于誘導WTl特異性CTL的方法。 本發明的試劑盒除了 HLA-A*1101限制的WTl肽和/或WTl肽二聚體之外，可以包含例如獲得外周血單核細胞的工具、佐劑、反應容器等。一般而言，試劑盒附有說明書手冊。通過使用本發明的試劑盒，可以有效誘導WTl特異性CTL。另一方面，本發明涉及通過HLA-A*1101分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細胞(例如樹突細胞)，所述細胞由HLA-A*1101限制的WTl肽和/或WTl肽二聚體誘導。通過使用本發明的抗原呈遞細胞，可以有效誘導WTl特異性CTL。
另一方面，本發明涉及治療或預防癌癥的方法，包括將通過HLA-AHoi分子呈遞 WTl肽的抗原呈遞細胞施用于HLA-A*1101陽性受試者。可以依賴于狀況例如疾病類型、受試者的狀況或靶位點，適當選擇抗原呈遞細胞的施用方法。這種方法的實例包括但不限于靜脈內施用、皮內施用、皮下施用、肌內施用、經鼻施用和經口施用。另一方面，本發明涉及誘導通過HLA-A*1101分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細胞的方法，包括在HLA-A*1101限制的WTl肽和/或WTl肽二聚體的存在下培養未成熟抗原呈遞細胞，以從未成熟抗原呈遞細胞誘導通過HLA-A*1101分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細胞。未成熟抗原呈遞細胞指例如可以成熟為抗原呈遞細胞的未成熟樹突細胞的細胞。未成熟抗原呈遞細胞所來自的受試者可為任一種，只要其是HLA-A*1101陽性的。因為未成熟抗原呈遞細胞包含于例如外周血單核細胞中，所以可以在WT 1肽和/或WT 1肽二聚體的存在下培養這種細胞。另一方面，本發明涉及誘導通過HLA-A*1101分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細胞的試劑盒，包含HLA-A*1101限制的WTl肽和/或WTl肽二聚體作為基本組分。優選的，該試劑盒用于誘導抗原呈遞細胞的方法。本發明的試劑盒包含的另一個組分等如上所述。本發明的試劑盒可用于有效誘導通過HLA-A*1101分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細胞。另一方面，本發明涉及抗HLA-A*1101限制的WTl肽或編碼該肽的多核苷酸的抗體。本發明的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。另一方面，本發明涉及診斷癌癥的方法，包括使用WTl特異性CTL、通過 HLA-A*1101分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細胞、或抗HLA_A*1101限制的WTl肽或編碼該肽的多核苷酸的抗體。優選的，將WTl特異性CTL用于本發明的診斷方法。例如，通過將CTL、抗原呈遞細胞或抗體與來自HLA-A*1101陽性受試者的樣品溫育，或者將其施用于HLA-A*1101 陽性受試者，并確定例如其位置、位點或量，可能診斷癌癥。可以將CTL、抗原呈遞細胞或抗體進行標記。通過附著標記，可以有效實施本發明的診斷方法。實施例下列實施例對本發明進行更詳細說明，但不將其解釋為對其范圍的限制。實施例1:WTl肽的選擇使用 RANKPEP (http://bio. dfci. harvard. edu/Tools/rankpep. html)選擇衍生自來自WTl蛋白質(SEQ ID No :1)的肽、具有高的結合HLA-A*1101分子的能力的WT1251、 WT1279、WT1312> WT1313> WT1338、WTl378, WTl386, WTl415 和 WT1436。這些肽的氨基酸序列、SEQ ID No 1氨基酸編號及與HLA-A*1101分子的親和力分數示于表1。表1肽氣基酸編號氨基酸序列親和力分數WTI251251-259AAGSSSSVK15.18(SEQ IDNo:2)WTl279279-287PILCGAQYR11.47(SEQ IDNo:3)WTl312312-320RSASETSEK14.96(SEQ IDNo:4)WTl313313-321SASETSEKR6.87(SEQ IDNo:5)WTl338338-346SHLQMHSRK13.72(SEQ IDNo 6)WTl378378-386TGVKPFQCK11.33(SEC^ IDNo:7)WTl386386-394KTCQRKFSR13.82(SEQ IDNo:8)WTl415415-423SCRWPSCQK10.29(SEQ IDNo:9)WTl436436-444NMHQRNMTK14.19(SEQ IDNo:10)B-LCL細胞的制備通過FicolI-Hypaque梯度密度離心方法從收集自HLA-A*1101陽性健康供體的外周血分離外周血單核細胞(PBMC)。然后將PBMC在含有10% FCS的RPMI 1640培養基中以約IX IO7的密度接種于M孔細胞培養板中，并加入B95-8細胞(產生EB病毒的細胞)培養上清液。將其以5%0)2在371培養約1個月。獲得以EB病毒轉化的B-LCL細胞，其是 B細胞腫瘤細胞。經證實，產生的B-LCL細胞不表達WTl基因。通過將B-LCL細胞與20 μ g/ ml WT1251、WT1279、WT1312、WT1313、WT1338、WT1378、WT1386、WT1415 或 WTl436 溫育 2 小時來脈沖 B-LCL 細胞，并以80Gy放射線進行照射。在后面實驗中將產生的B-LCL細胞(此后稱為以WTl肽脈沖的B-LCL細胞)用作抗原呈遞細胞。WTl特異性CTL的誘導在含有20μ g/ml WT1251、WT1279、WT1312、WT1313、WT1338、WT1378、WT1386、WTl415 或 WTl436 的完全培養基RPMI、45% AMI-V培養基和10%人AB血清)中將3X IO6個自身PBMC 于M孔細胞培養板中以5% CO2在37°C培養1周以獲得相應細胞。將2X IO6個產生的相應細胞與1 X IO6個以相同WTl肽脈沖的B-LCL細胞在完全培養基中共培養1周(第一次刺激)。將PBMC與以WTl肽脈沖的B-LCL細胞另外共培養三次(第二至第四次刺激)，所述培養在如下加入的20IU/ml (終濃度)IL2條件下進行第二次刺激刺激起始后三天起， 每隔一天兩次；第三和第四次刺激從刺激起始后那天起，每隔一天三次。使用負選擇柱重力上料(Negative Selection Columns Gravity Feed)試劑盒(StemSp)濃縮所得細胞，從而⑶8陽性T細胞比率變為約80%，并使其與以WTl肽脈沖的B-LCL細胞共培養(第五次刺激)。將最后刺激后5天獲得的CD8陽性T細胞(CTL)用于細胞毒活性的測量。CTL的細胞毒活性使用51Cr釋放測定測量CTL的細胞毒活性。CTL細胞(此后稱為效應細胞)以 1 1至30 1的比率(E/T比)與已整合了 51Cr的靶細胞在200 μ 1培養基中混合，并在96孔細胞培養板中以5% CO2于37°C培養4小時。將用與誘導CTL的相同的WTl肽脈沖的 B-LCL細胞(BLCL-Ps)和沒有以WTl肽脈沖的B-LCL細胞(BLCL-NPs)用作靶細胞。培養后，通過離心收集上清液。使用液體閃爍計數器測量釋放到上清液中的51Cr量。使用下列公式確定細胞毒活性(％ )(樣品上清液中的51Cr釋放-自發性51Cr釋放)/(最大51Cr釋放-自發性51Cr釋放)X 100其中自發性51Cr釋放是當已整合了 51Cr的靶細胞在相同條件下單獨培養時所觀察到的51Cr釋放，且最大51Cr釋放是當使用TritonX-IOO將已整合了 51Cr的靶細胞完全裂解時觀察到的51Cr釋放。結果顯示于圖1-9。圖中，縱軸代表比裂解(％)，而橫軸代表E/T比。使用實線代表BLCL-Ps，并使用點線代表BLCL-NPs。經證實，與BLCL-M3s相比， 以 WTl251、WTI279、WT1312、WT1313、WT1338> WT1378、WTl386, WTl415 或 WTl436 誘導的 CTL 特異性損傷作為與 HLA-A*1101 分子的復合物呈遞 WTl 肽的 BLCL-Ps0 將以 WT1251、WT1279、WT1313、WTl338 或WTl386誘導的CTL用于下面的其他實驗。CTL對內源性表達WTl的細胞的細胞毒活性使用上述方法確定以WT1251、WTl279, WT1313、WTL8或WTl386誘導的CTL對表達WTl 的B-LCL的細胞毒活性。表達WTl的細胞是指引入人WTl基因、并在細胞中表達WTl蛋白質、并在HLA-A*1101分子上呈遞由加工所得的約9個氨基酸組成的肽的B-LCL。結果顯示于圖1、2、4、5和7中。圖中，使用短劃線代表表達WTl的B-LCL。經證實，以WT1251、WT1279、 WT1313> WTl338或WTl386誘導的CTL對內源性表達WTl基因的細胞具有細胞毒活性。WTl肽二聚體的制備將227. 5mg WTl378 肽單體、227. 5mg N-葡甲胺(N-methylglucamine) (NMG)和 23ml 水的混合物通過在室溫下攪拌約2天而空氣氧化。向得到的混合物加入2g乙酸鈉溶于5ml 水中的水溶液，并將該混合物在室溫下攪拌約20分鐘。將200ml水和約200ml乙腈加入產生的溶液中，并將混合物經Kiriyama漏斗過濾(濾紙號5C)，并以水洗滌(約50ml X 3)。將約200ml水加入殘余物，并將殘余物凍干以獲得158mg粗WTl378肽二聚體。粗WTl肽二聚體的純化將158mg 粗 WTl378 肽二聚體溶解于 9ml DMSO 并注射到 ODS C18 柱(5ο Φ X 50cm L, YMC Co.，LTD.)，所述 ODS 柱與 HPLC (Shimadzu，LC8AD 型)附著，并用 HPLC 泵以溶液 1 (H2O/1 % AcOH)平衡。將柱放置約30分鐘，并在360分鐘內以濃度梯度0%到40%的溶液 2(CH3CN/1%Ac0H)洗脫。在220nm監控UV吸收時，使用自動級分收集器收集含有WTl肽二聚體的級分。將收集的級分組合，注射到ODS Cw柱G.6mmOX25Cm L，YMC Co.，LTD.)，所述ODS柱與HPLC (Hitachi，L-4000型)附著，并以17%的溶液2平衡，并在30分鐘內以濃度梯度0%到47%的溶液2過洗脫，以在20. 51分鐘的保留時間獲得46. 6mg純化的WTl378 肽二聚體。FAB. MS 2365. 0 (理論值2342. 70)Na+F = 0. 25%通過WTl肽二聚體誘導CTL根據上述方法，使用來自HLA-A*1101陽性健康供體1_3的PBMC檢查產生的WTl378 肽二聚體、WTl378 肽、修飾的 WTl378 肽(G — I) (SEQ ID No 11)和修飾的 WTl378 肽(G — V) (SEQ ID No 12)以及WTI379 肽(SEQ ID No:13，公開于WO 2002Λ8414)誘導 CTL 的能力。結果示于圖10-14。圖中，縱軸代表比裂解(％ )，而橫軸代表E/T比。使用實線表示BLCL-Ps， 并使用點線表示BLCL-NPs。經證實，WTl378肽二聚體具有誘導CTL的能力。另外，發現各 WTl379肽誘導CTL的能力遠低于WTl378肽的能力，所述WTl3ra肽的氨基酸序列通過WTl蛋白質氨基酸序列中一個氨基酸不同于WTl3re肽，且因此，與已知肽相比，本發明的WTl肽具有卓越且出乎意料的作用。工業適用性本發明提供了 HLA-A*1101限制的WTl肽、編碼該肽的多核苷酸、含有其的藥物組合物等。因此，本發明可用于醫藥等領域，例如，預防或治療高水平表達WTl基因的各種造血腫瘤和實體癌的藥物組合物的開發和制備領域。序列表自由文本SEQ ID NO 11 修飾的 WTl 肽SEQ ID NO 12 修飾的 WTl 肽
1權利要求
1.治療或預防HLA-A*1101陽性受試者中的癌癥的藥物組合物，包含多核苷酸或含所述多核苷酸的表達載體，所述多核苷酸編碼由氨基酸序列ftO lie Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg(SEQ ID No 3)組成的肽。
2.多核苷酸或包含所述多核苷酸的表達載體用于制備治療或預防HLA-A*1101陽性受試者中的癌癥的藥物的用途，所述多核苷酸編碼由氨基酸序列ftx) lie Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg (SEQ ID No :3)組成的肽。
3.WTl 特異性CTL，通過由氨基酸序列Pro lie Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg(SEQ ID No 3)組成的肽誘導。
4.誘導WTl特異性CTL的體外方法，包括在由氨基酸序列ftx)lie Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg(SEQ ID No : 組成的肽的存在下培養外周血單核細胞，以從外周血單核細胞誘導WTl特異性CTL。
5.呈遞WTl肽的抗原呈遞細胞，通過由氨基酸序列ftx)lie Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg (SEQ ID No :3)組成的肽誘導。
6.誘導呈遞WT1肽的抗原呈遞細胞的體外方法，包括在由氨基酸序列ftx) lie Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg(SEQ ID No :3)組成的肽存在下培養未成熟抗原呈遞細胞，以從未成熟抗原呈遞細胞誘導呈遞WTl肽的抗原呈遞細胞。
全文摘要
公開的是HLA-A*1101限制的WT1肽，具體而言為含有由WT1蛋白質9個鄰接氨基酸殘基組成的氨基酸序列的肽，能夠結合HLA-A*1101分子，并且具有誘導CTL的能力；包含兩個肽單體的肽二聚體，所述肽單體各自包含含有至少一個半胱氨酸殘基且來自WT1蛋白質的由9個鄰接氨基酸組成的氨基酸序列，其中兩個肽單體通過二硫鍵彼此結合，且所述肽二聚體能夠結合HLA-A*1101分子并且具有誘導CTL的能力；編碼該肽的多核苷酸；含有肽或肽二聚體的用于治療和/或預防癌癥的藥物組合物；等等。
文檔編號C12N5/0784GK102335439SQ20111023550
公開日2012年2月1日 申請日期2007年12月14日 優先權日2006年12月28日
發明者杉山治夫 申請人:株式會社癌免疫研究所