專利名稱：多種細胞共培養支架的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種培養支架，特別是涉及一種多種細胞共培養支架。
背景技術：
細胞培養是將細胞置于體外條件下進行生長和繁殖，具有可直接觀察活細胞的形態結構和生命活動、直接觀察細胞的變化、易于提供大量生物性狀相似的實驗對象以及耗資少等優點。細胞的體外培養可以是一種細胞單獨培養和多種細胞共同培養。一種細胞的單獨培養，這是目前在基礎醫學及基礎與臨床相結合的研究中應用最 為廣泛的方式，主要用于研究某一種細胞的形態學、基因及蛋白的表達以及在不同處理因素作用下發生的變化及其機制。雖然培養過程中細胞獨立生存于人工模擬的體內環境，但該環境與真實的體內環境相比仍有很大差異。為了能夠建立更類似于體內環境的培養體系，盡可能使體外環境與體內環境相吻合，從而使細胞間能相互溝通信息，相互支撐生長增殖，20世紀80年代后期，人們在原有細胞培養的基礎上發展出了細胞共培養技術。細胞共培養技術是將2種或2種以上的細胞共同培養于同一環境中的技術，由于其具有更好反映體內環境的優點，所以這種方法被越來越廣泛地應用于現代細胞研究中。多種細胞共同培養，主要通過兩種方法建立直接共培養體系和間接共培養體系。直接共培養體系，是將2種或2種以上的細胞同時接種于同一培養容器內，不同類型的細胞之間直接接觸，不可否認，這種方式較一種細胞單獨培養能夠更好的反映體內的環境，但是由于不同的細胞生長在同一細胞容器內，無法分離各種細胞用于下一步的研究，限制了其應用。間接共培養體系，即將2種或2種以上的細胞分別接種于不同的載體上，然后將不同載體置于同一培養環境中，使不同種類的細胞共處于同一種培養體系中而不直接接觸，可以分別收取不同種類的細胞用于下一步的研究，彌補了直接共培養體系的不足。目前已經商品化的是可用于2種細胞共培養的體系，如美國康寧(corning)公司有商品化的各種規格的共培養體系(又稱transwell培養皿),而美國millipore公司則生產可適用于國內外各家培養器皿生產公司的懸掛式小室，組裝成為共培養體系，這些商品化的共培養體系操作簡單，目前在研究中得到廣泛應用。但是，由于在不同疾病的發生發展過程中，參與其中的細胞類型可能是許多種，而多種細胞之間復雜的相互作用是疾病產生的主要原因，國內外研究者迫切需要能夠將更多細胞納入到同一種培養環境中，并且能夠分別對各種細胞類型進行進一步研究的共培養體系。另外，為適應新化學物或產品快速增長的需求，迫切需要發展快速、高通量的毒性評價方法。常用的體外方法培養的細胞種類有限，研究者需要同時評價毒物對多種器官細胞的易感性和毒性作用，為滿足這一要求，美國的Li AP等用美國康寧公司的六孔板進行了改進，可以同時培養來自不同器官的6種細胞，稱為integrateddiscrete multiple organ co-culture (IdMOC ) plate,中文名稱為整體非連續性多器官共培養體系，此產品已申請專利(US 7186548B2, CHINA 626030)。但這一產品存在以下不足1)在培養板的一個大共培養孔中有6個小孔，每個小孔的高度只有0. 8毫米，且各個小孔之間距離太近，因此在操作時如果有輕微的晃動，一個小孔中的細胞可能會移動至另一小孔中，造成不同細胞之間的污染與混雜；而由于不能晃動，會導致細胞貼壁不均勻，出現中心細胞多，周圍細胞少的情況，影響細胞的生長；并且在收獲細胞時操作也有一定的難度；2)因為小孔的生長面積有限(每個小孔中最多只能容納300微升的液體)，不適合需要大量細胞的實驗；3)只適合貼壁細胞，不適合懸浮及半懸浮細胞的培養。綜上所述，目前已有的可多種細胞共同培養的體系IdMOC 有如下不足1)易造成不同細胞之間的污染與混雜；2)細胞貼壁不均勻；3)不適合需要大量細胞的實驗；4)只適合貼壁細胞，不適合懸浮及半懸浮細胞的培養；5)收獲細胞有一定難度。另外，IdMOC 體系主要用于評價毒物對多種器官細胞的易感性和毒性作用，難以滿足廣大研究者對于多種細胞共培養的不同需求。例如，在肝纖維化的發生過程中有三種細胞共同發揮著關鍵的作用肝細胞損傷、壞死，刺激和激活肝臟巨噬細胞(KupfTer細胞)，后者活化分泌細胞因子再激活肝臟星狀細胞并產生過量的細胞外基質，細胞外基質的過量堆積則引起肝纖維化的發生；另外，粘附分子在肝纖維化過程中也顯著上調，而其上調則與肝細胞和血竇內皮細胞誘導表達Integrin家族中的層連蛋白受體相關。在其他疾病的發病機制中，也常有3種或3種以上(常為3到5種)關鍵細胞的相互作用參與其中，并且有多種細胞屬于懸浮或半懸浮生長細胞。因此，設計出易于操作、同時適用于貼壁細胞和懸浮細胞共同培養、適用于研·究者多種不同需要的培養體系是十分必要的。

發明內容
為避免以上現有技術的不足，本發明提供一種多種細胞共培養支架，以解決一個可進行多種細胞共同培養的培養體系。本發明的技術方案為
多種細胞共培養支架，該支架包括支架面和與所述支架面連接的支撐架，所述的支架面上開設有固定孔。所述的支架面邊緣處連接有支撐架。所述的固定孔的邊緣處設有開口槽。所述的固定孔至少為2個。所述的開口槽為3個。所述的支撐架的高度為為17-20_。多種細胞共培養裝置，該裝置包括培養皿和放置于培養皿中的多細胞共培養支架，該多細胞共培養支架包括支架面和與所述支架面連接的支撐架，所述的支架面上開設有固定孔。該裝置的固定孔的邊緣處設有開口槽。該裝置還包括有培養小室。所述的多細胞共培養支架的高度大于所述培養小室的高度，而小于所述的培養皿的高度。在進行多種細胞共同培養時，將培養小室放到多細胞共培養支架上的固定孔上，培養小室的高度小于培養皿的高度，在培養支架的支撐下，培養小室的底部與培養皿容器的底部之間保持有一定的空間，各培養小室中的細胞能處于獨立培養環境的同時，又能置于一個大的培養體系中，且各種細胞彼此又不會直接接觸。
另一方面，當進行多細胞培養時，對培養小室進行晃動操作時，由于培養小室帶有固定裝置，該固定裝置與固定孔的開口槽匹配銜接，培養小室的位置能易于被固定而不至于滑動，以影響實驗結果。本發明具有如下優點
1)可根據需要進行3到5種細胞的共同培養；
2)可適用于多種貼壁細胞的共同培養；
3)適用于多種懸浮或半懸浮細胞的共同培養；
4)適用于貼壁細胞與懸浮或半懸浮細胞的共同培養；
5)各種細胞分別生長于不同的培養小室或培養皿內，不會造成不同細胞之間的污染與混雜，易于收獲細胞；· 6)可以通過輕微振蕩培養小室混勻細胞，使細胞貼壁均勻。


圖I: 3孔共培養支架正面俯視 圖2:帶開口槽的3孔共培養支架正面俯視 圖3 :多細胞共培養裝置中的培養皿正視圖。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明做進一步詳述。實施例I
以3孔共培養支架對3種細胞的共培養為例
如圖I所示，一種多種細胞共培養支架，該支架包括支架面I和與所述支架面I連接的支撐架2，所述的支架面I上開設有固定孔3，所述的支架面I可以在邊緣處與所述的支撐架2連接。所述的固定孔為3個。所述的支撐架的高度為選17mm。如圖3所示為多細胞共培養裝置中的培養皿正視圖。一種多種細胞共培養裝置，該裝置包括培養皿4和放置于培養皿中的共培養支架，該共培養支架包括支架面和與所述支架面連接的支撐架，所述的支架面上開設有固定孔。該裝置還包括有培養小室。所述的培養小室為一小盒，且小盒的邊緣處設有與所述開口槽匹配的固定裝置。上述的培養皿可采用美國corning公司直徑10厘米,高度為2厘米或同等規格的培養皿；培養小室米用millipore公司懸掛式培養小室。由于本發明培養支架的支撐架的高度設計為17mm，因此將載有培養小室的培養支架放入培養皿中，該培養小室底部與培養皿底部留有一定距離，彼此之間不會直接接觸。所述的培養皿、共培養支架和懸掛式培養小室則成為一個可進行多種細胞共同培養的共培養體系，每個懸掛式培養小室內可分別加入不同種類的細胞(可為貼壁細胞或懸浮細胞)。以下對3種細胞共同培養進行說明。首先，將3種不同種類的細胞(可為貼壁細胞或懸浮細胞)，如肝細胞、巨噬細胞和星狀細胞各放入共培養支架的培養小室中，再將該支架放入培養皿中，將整個共培養體系置于細胞培養箱中培養一段時間(6個小時或過夜培養)，使貼壁細胞充分貼壁(每種細胞的生長特性不同導致貼壁時間有一定差異)。培養小室內可加入2到3毫升的液體，以密度為I X IO7/毫升的細胞為例，可加入2至3 X IO7個細胞，適于需要大量細胞的實驗。此時各培養小室之間細胞獨立生長，培養液也不互相連通。其次，待貼壁細胞貼壁后，移除多余的培養液，在培養皿中加入新鮮培養液，高度使其能夠沒過懸掛式培養小室的底部。由于懸掛式培養小室的底部有不同大小的小孔，可允許液體自由通過，而細胞不能通過，因此，3種細胞即可通過培養液互相連通，處于同一生長環境中。此時定義為3種細胞共培養開始的時間，根據不同研究者的需求，在培養液中加入外源性干預因子。實驗結束后，根據研究者要求，可以收取共培養體系的上清，觀察共培養體系中分泌性蛋白的變化；將不同的懸掛式培養皿取出，分別收取3種不同細胞，用于下一步的實驗。實施例2
以3孔共培養支架對3種細胞的共培養為例
如圖2所示，一種多種細胞共培養支架，該支架包括支架面I和與所述支架面I連接的支撐架2，所述的支架面I上開設有固定孔3，所述的支架面I可以在邊緣處與所述的支撐架2連接。所述的固定孔3的邊緣處設有開口槽31。所述的固定孔3為3個。所述的開口槽31為3個。所述的支撐架的高度為為18mm。如圖3所示，一種多種細胞共培養裝置，該裝置包括培養皿4和放置于培養皿中的共培養支架，該共培養支架包括支架面和與所述支架面連接的支撐架，所述的支架面上開設有固定孔。所述的固定孔的邊緣處設有開口槽。該裝置還包括有培養小室。所述的培養小室為一小盒，且小盒的邊緣處設有與所述開口槽匹配的固定裝置。上述的培養皿可采用美國corning公司直徑10厘米,高度為2厘米或同等規格的培養皿；培養小室米用millipore公司懸掛式培養小室。由于本發明培養支架的支撐架的高度設計為18mm，因此將載有培養小室的培養支架放入培養皿中，該培養小室底部與培養皿底部留有一定距離，彼此之間不會直接接觸。所述的培養皿、共培養支架和懸掛式培養小室則成為一個可進行多種細胞共同培養的共培養體系，每個懸掛式培養小室內可分別加入不同種類的細胞(可為貼壁細胞或懸浮細胞)。以下對3種細胞共同培養進行說明。首先，將3種不同種類的細胞(可為貼壁細胞或懸浮細胞)，如肝細胞、巨噬細胞和星狀細胞各放入共培養支架的培養小室中，再將該支架放入培養皿中，將整個共培養體系置于細胞培養箱中培養一段時間(6個小時或過夜培養)，使貼壁細胞充分貼壁(每種細胞的生長特性不同導致貼壁時間有一定差異)。培養小室內可加入2到3毫升的液體，以密度為I X IO7/毫升的細胞為例，可加入2至3 X IO7個細胞，適于需要大量細胞的實驗。此時各培養小室之間細胞獨立生長，培養液也不互相連通。其次，待貼壁細胞貼壁后，移除多余的培養液，在培養皿中加入新鮮培養液，高度使其能夠沒過懸掛式培養小室的底部。由于懸掛式培養小室的底部有不同大小的小孔，可允許液體自由通過，而細胞不能通過，因此，3種細胞即可通過培養液互相連通，處于同一生長環境中。此時定義為3種細胞共培養開始的時間，根據不同研究者的需求，在培養液中加入外源性干預因子。實驗結束后，根據研究者要求，可以收取共培養體系的上清，觀察共培養體系中分泌性蛋白的變化；將不同的懸掛式培養皿取出，分別收取3種不同細胞，用于下一步的實驗。
實施例3
以3孔共培養支架對4種細胞的共培養為例
如圖I所示，一種多種細胞共培養支架，該支架包括支架面I和與所述支架面I連接的支撐架2，所述的支架面I上開設有固定孔3，所述的支架面I可以在邊緣處與所述的支撐架2連接。所述的固定孔為3個。所述的支撐架2的高度為為19mm。如圖3所示，一種多種細胞共培養裝置，該裝置包括培養皿4和放置于培養皿中的共培養支架，該共培養支架包括支架面和與所述支架面連接的支撐架，所述的支架面上開設有固定孔。該裝置還包括有培養小室，所述的培養小室為一小盒，且小盒的邊緣處設有與所述開口槽匹配的固定裝置。上述的培養皿可采用美國corning公司直徑10厘米,高度為2厘米或同等規格的培養皿；培養小室米用millipore公司懸掛式培養小室。由于本發明培養支架的支撐架的 高度設計為19mm，因此將載有培養小室的培養支架放入培養皿中，該培養小室底部與培養皿底部留有一定距離，彼此之間不會直接接觸。所述的培養皿、共培養支架和懸掛式培養小室則成為一個可進行多種細胞共同培養的共培養體系，每個懸掛式培養小室內可分別加入不同種類的細胞(可為貼壁細胞或懸浮細胞)。以下對4種細胞共同培養進行說明。首先，將3種不同種類的細胞(可為貼壁細胞或懸浮細胞)，如肝細胞、巨噬細胞和星狀細胞各放入共培養支架的培養小室中，再將該支架放入培養皿中，將整個共培養體系置于細胞培養箱中培養一段時間(6個小時或過夜培養)，使貼壁細胞充分貼壁(每種細胞的生長特性不同導致貼壁時間有一定差異)。培養小室內可加入2到3毫升的液體，以密度為I X IO7/毫升的細胞為例，可加入2至3 X IO7個細胞，適于需要大量細胞的實驗。此時各培養小室之間細胞獨立生長，培養液也不互相連通。其次，將第4種細胞血竇內皮細胞(可為貼壁細胞或懸浮細胞)置于另一培養皿內生長，使貼壁細胞充分貼壁(每種細胞的生長特性不同導致貼壁時間有一定差異)。再次，待貼壁細胞貼壁后，移除多余的培養液，將3孔共培養支架和生長有3種細胞的懸掛式培養小室組裝在生長有第4種細胞培養皿中，加入新鮮培養液，高度使其能夠沒過懸掛式培養小室的底部。由于懸掛式培養小室的底部有不同大小的小孔，可允許液體自由通過，而細胞不能通過，因此，4種細胞即可通過培養液互相連通，處于同一生長環境中。此時定義為4種細胞共培養開始的時間，根據不同研究者的需求，在培養液中加入外源性干預因子。實驗結束后，根據研究者要求，可以收取共培養體系的上清，觀察共培養體系中分泌性蛋白的變化；將不同的懸掛式培養皿取出，分別收取4種不同細胞，用于下一步的實驗。實施例4
以3孔共培養支架對4種細胞的共培養的為例
如圖2所示，一種多種細胞共培養支架，該支架包括支架面I和與所述支架面I連接的支撐架2，所述的支架面I上開設有固定孔3，所述的支架面I可以在邊緣處與所述的支撐架2連接。所述的固定孔3的邊緣處設有開口槽31。所述的固定孔為3個。所述的開口槽31為3個。所述的支撐架2的高度為為19mm。如圖3所示，一種多種細胞共培養裝置，該裝置包括培養皿4和放置于培養皿中的共培養支架，該共培養支架包括支架面和與所述支架面連接的支撐架，所述的支架面上開設有固定孔。所述的固定孔的邊緣處設有開口槽。該裝置還包括有培養小室。所述的培養小室為一小盒，且小盒的邊緣處設有與所述開口槽匹配的固定裝置。上述的培養皿可采用美國corning公司直徑10厘米,高度為2厘米或同等規格的培養皿；培養小室米用millipore公司懸掛式培養小室。由于本發明培養支架的支撐架的高度設計為19mm，因此將載有培養小室的培養支架放入培養皿中，該培養小室底部與培養皿底部留有一定距離，彼此之間不會直接接觸。所述的培養皿、共培養支架和懸掛式培養小室則成為一個可進行多種細胞共同培養的共培養體系，每個懸掛式培養小室內可分別加入不同種類的細胞(可為貼壁細胞或懸浮細胞)。以下對4種細胞共同培養進行說明。首先，將3種不同種類的細胞(可為貼壁細胞或懸浮細胞)，如肝細胞、巨噬細胞和星狀細胞各放入共培養支架的培養小室中，再將該支架放入培養皿中，將整個共培養體系置于細胞培養箱中培養一段時間(6個小時或過夜培養)，使貼壁細胞充分貼壁(每種細胞的生長特性不同導致貼壁時間有一定差異)。培養小室內可加入2到3毫升的液體，以密度為 I X IO7/毫升的細胞為例，可加入2至3 X IO7個細胞，適于需要大量細胞的實驗。此時各培養小室之間細胞獨立生長，培養液也不互相連通。其次，將第4種細胞血竇內皮細胞(可為貼壁細胞或懸浮細胞)置于另一培養皿內生長，使貼壁細胞充分貼壁(每種細胞的生長特性不同導致貼壁時間有一定差異)。再次，待貼壁細胞貼壁后，移除多余的培養液，將3孔共培養支架和生長有3種細胞的懸掛式培養小室組裝在生長有第4種細胞培養皿中，加入新鮮培養液，高度使其能夠沒過懸掛式培養小室的底部。由于懸掛式培養小室的底部有不同大小的小孔，可允許液體自由通過，而細胞不能通過，因此，4種細胞即可通過培養液互相連通，處于同一生長環境中。此時定義為4種細胞共培養開始的時間，根據不同研究者的需求，在培養液中加入外源性干預因子。實驗結束后，根據研究者要求，可以收取共培養體系的上清，觀察共培養體系中分泌性蛋白的變化；將不同的懸掛式培養皿取出，分別收取4種不同細胞，用于下一步的實驗。與上述三孔共培養支架及共培養裝置類似，四孔共培養支架可應用于4種或5種細胞的共同培養，本發明共培養支架與共培養裝置可拓展應用于5種以上細胞的共同培養。顯然，本發明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而并非是對本發明的實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無法對所有的實施方式予以窮舉。凡是屬于本發明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發明的保護范圍之列。
權利要求
1.多種細胞共培養支架，其特征在于，該支架包括支架面和與所述支架面連接的支撐架，所述的支架面上開設有固定孔。
2.根據權利要求I所述的多種細胞共培養支架，其特征在于，所述的支架面邊緣處連接有支撐架。
3.根據權利要求I或2所述的多種細胞共培養支架，其特征在于，所述的固定孔的邊緣處設有開口槽。
4.根據權利要求I所述的多種細胞共培養支架，其特征在于，所述的固定孔至少為2個。
5.根據權利要求3所述的多種細胞共培養支架，其特征在于，所述的開口槽為3個。
6.根據權利要求I所述的多種細胞共培養支架，其特征在于，所述的支撐架的高度為為 17_20mm。
7.多種細胞共培養裝置，其特征在于，該裝置包括培養皿和放置于培養皿中的多細胞共培養支架，該多細胞共培養支架包括支架面和與所述支架面連接的支撐架，所述的支架面上開設有固定孔。
8.根據權利要求7所述的多種細胞共培養裝置，其特征在于，所述的固定孔的邊緣處設有開口槽。
9.根據權利要求8所述的多種細胞共培養裝置，其特征在于，該裝置還包括有培養小室。
10.根據權利要求8所述的多種細胞共培養裝置，其特征在于，所述的多細胞共培養支架的高度大于所述培養小室的高度，而小于所述的培養皿的高度。
全文摘要
本發明涉及一種多種細胞共培養支架，該支架包括支架面和與所述支架面連接的支撐架，所述的支架面上開設有固定孔。所述的支架面邊緣處連接有支撐架。本發明可根據需要進行3到5種細胞的共同培養，可適用于多種貼壁細胞、懸浮或半懸浮細胞的共同培養。各種細胞分別生長于不同的培養小室或培養皿內，不會造成不同細胞之間的污染與混雜，易于收獲細胞。
文檔編號C12M3/00GK102952751SQ20111024202
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月23日 優先權日2011年8月23日
發明者劉天會, 尤紅, 賈繼東, 朱圣韜, 王萍, 叢敏 申請人:首都醫科大學附屬北京友誼醫院