一種去細胞主動脈瓣支架及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學材料技術領域，具體涉及一種組織工程心臟瓣膜去細胞支架材料及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002]目前組織工程心臟瓣膜的研宄主要是集中在以下幾方面:瓣膜支架制備及改性，種子細胞的選擇及培養(yǎng)，種子細胞與瓣膜支架材料的相互作用。而瓣膜支架的制備是整個組織工程心臟瓣膜研宄的前提，因此制備性能良好的瓣膜支架至關重要。
[0003]去細胞基質(zhì)由于其良好的生物相容性，并可為種子細胞黏附、增殖、分化等提供類似于體內(nèi)的基質(zhì)微環(huán)境，在組織工程學中得以廣泛應用。目前，去細胞的組織工程心臟瓣膜支架大多為動物的去細胞心臟瓣膜和去細胞心包，因其具有良好的生物學和力學性能，且來源廣泛，價格低廉，被越來越多的應用于組織工程心臟瓣膜研宄。理想的去細胞瓣膜支架應保持瓣膜細胞外基質(zhì)的完整性、良好的生物相容性、三維立體超微多孔結(jié)構(gòu)，進而為種子細胞和組織生長提供足夠的空間條件，這些特點都是合成材料很難模仿的。
[0004]應用去細胞瓣膜支架材料構(gòu)建組織工程心臟瓣膜，瓣膜的去細胞是至關重要的一步。根據(jù)去細胞方法性質(zhì)的不同，可以大體上將其分為物理、化學和酶學方法，在實際的工作過程中，根據(jù)需要也可以將不同的去細胞方法或者不同的試劑聯(lián)合應用，以得到接近理想去細胞瓣膜的效果。目前去細胞常用的物理方法包括快速凍融，聲波降解等，化學方法常用試劑有曲拉通、脫氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉、吐溫20等，酶學方法常用酶為低濃度的胰蛋白酶。但目前應用最多的是化學方法中的表面活性劑，陽離子表面活性劑的毒性最大，其次是陰離子表面活性劑，非離子表面活性劑最小，但去污能力以非離子表面活性劑最強，其次是陰離子表面活性劑。
[0005]目前去細胞技術還不成熟，所有的去細胞方法都會導致瓣膜結(jié)構(gòu)的破壞和表面成分的潛在丟失，在一定程度上加速瓣膜的變性和鈣化，并且常用的去細胞試劑都具有一定的毒性，且去細胞時間較長大多需48小時甚至更長，單純的表面活性劑用于瓣膜及其類似組織去細胞效果往往不理想，很難保證細胞去除完全和同時保證瓣膜及類似組織的細胞外基質(zhì)的完整性及機械性能不會變化。因此尋求一種試劑用于心臟瓣膜去細胞，對于構(gòu)建去細胞組織工程心臟瓣膜支架尤為必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所解決的技術問題是:現(xiàn)有技術的去細胞方法都會導致瓣膜結(jié)構(gòu)的破壞和表面成分的丟失，一定程度上加速瓣膜的變性和鈣化，而且會產(chǎn)生一定的毒性。
[0007]為了解決上述問題，需要一種去細胞主動脈瓣支架，使其具備天然心臟瓣膜的相關性能，同時安全無毒。本發(fā)明的目的在于提供一種去細胞主動脈瓣支架，使其具備天然心臟瓣膜的相關性能，同時安全無毒，DNA含量大幅降低，極大的減少瓣膜植入體內(nèi)后的免疫排斥反應。
[0008]具體來說，本發(fā)明提供了如下技術方案:
[0009]一種去細胞主動脈瓣支架，其經(jīng)聚乙二醇-聚己內(nèi)酯處理動物的主動脈瓣得到。
[0010]優(yōu)選的，所述的主動脈瓣支架，其通過包含如下步驟的方法制備得到:
[0011](I)將動物的主動脈瓣置于含聚乙二醇-聚己內(nèi)酯的緩沖液中處理；
[0012]以及
[0013](2)將所述的主動脈瓣置于含核酸酶的緩沖液中處理。
[0014]優(yōu)選的，所述的動物為哺乳動物。
[0015]一種去細胞主動脈瓣支架的制備方法，其包含如下步驟:
[0016](I)將動物的主動脈瓣置于含聚乙二醇-聚己內(nèi)酯的緩沖液中處理；
[0017]以及
[0018](2)將所述的主動脈瓣置于含核酸酶的緩沖液中處理。
[0019]優(yōu)選的，步驟(I)前，首先將所述的動物主動脈瓣置于4°C含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12?24小時。
[0020]優(yōu)選的，所述的培養(yǎng)基為高糖DMEM培養(yǎng)基，其中抗生素含量為青霉素80U/ml?120U/ml 和鏈霉素 80 μ g/ml ?120 μ g/ml。
[0021]優(yōu)選的，步驟⑴中所述的含聚乙二醇-聚己內(nèi)酯的緩沖液選自磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液或醋酸鹽緩沖液。
[0022]優(yōu)選的，步驟(I)中所述的含聚乙二醇-聚己內(nèi)酯的緩沖液為三羥甲基氨基甲燒-鹽酸緩沖液。
[0023]優(yōu)選的，所述的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液的濃度為0.01mol/L?0.02mol/L0
[0024]優(yōu)選的，步驟(I)中所述的含聚乙二醇-聚己內(nèi)酯的緩沖液中聚乙二醇-聚己內(nèi)酯的濃度為0.5?2% (w/v) ο
[0025]優(yōu)選的，步驟(I)中所述的含聚乙二醇-聚己內(nèi)酯的緩沖液中聚乙二醇-聚己內(nèi)酯的濃度為I % (w/v) ο
[0026]優(yōu)選的，步驟⑴中，所述的主動脈瓣在所述的含聚乙二醇-聚己內(nèi)酯的緩沖液中，于常溫?37°C、50?10rpm振蕩處理12?36小時。
[0027]優(yōu)選的，步驟⑴中，所述的主動脈瓣在所述的含聚乙二醇-聚己內(nèi)酯的緩沖液中振蕩處理的溫度為37°C。
[0028]優(yōu)選的，步驟⑵中，所述的緩沖液包含0.lmg/ml?0.3mg/ml的脫氧核糖核酸酶I和10 μ g/ml?30 μ g/ml核糖核酸酶A0
[0029]優(yōu)選的，步驟(2)中，所述的主動脈瓣在所述的核酸酶緩沖液中，于常溫?37°C、50?10rpm振蕩處理2?4小時。
[0030]優(yōu)選的，步驟(2)中，所述的主動脈瓣在所述的核酸酶緩沖液中振蕩處理的溫度為 37。。。
[0031]優(yōu)選的，所述的制備方法還包括如下步驟:將步驟(I)得到的主動脈瓣置于緩沖液中，于常溫?37°C、50?10rpm振蕩清洗12?36小時。
[0032]優(yōu)選的，步驟(I)得到的主動脈瓣置于緩沖液中振蕩清洗的溫度為37°C。
[0033]優(yōu)選的，所述緩沖液選自磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液或醋酸鹽緩沖液。
[0034]優(yōu)選的，所述的緩沖液為三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，所述的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液的濃度為0.03?0.08mol/Lo
[0035]一種去細胞主動脈瓣支架，其由上述所述的制備方法制備得到。
[0036]優(yōu)選的，所述的主動脈瓣支架在制備組織工程心臟瓣膜材料中的應用。
[0037]優(yōu)選的，所述的聚乙二醇-聚己內(nèi)酯的分子量為4000?6000，其中聚乙二醇鏈段的分子量為2000?3000。
[0038]優(yōu)選的，所述的聚乙二醇-聚己內(nèi)酯通過包括如下步驟的方法制備得到:
[0039]在氮氣環(huán)境下，以聚乙二醇和ε -己內(nèi)酯為原料，以辛酸亞錫為催化劑，90?100°C加熱得到聚乙二醇-聚己內(nèi)酯。
[0040]優(yōu)選的，所述的聚乙二醇和ε -己內(nèi)酯加熱反應24?36小時。
[0041]本發(fā)明所用到的聚乙二醇-聚己內(nèi)酯(PEG-PCL)可以自合成，也可以從市面上購買得到。
[0042]聚乙二醇-聚己內(nèi)酯屬于非離子型表面活性劑，可降解、無毒，去污能力強，價格低廉，且其構(gòu)成部分PEG和PCL均已被美國FDA組織批準在人體內(nèi)使用。
[0043]本發(fā)明應用PEG-PCL低滲液對豬主動脈瓣進行去細胞處理，再經(jīng)高滲、核酸酶處理，從而制備出去細胞完全的瓣膜支架材料。
[0044]本發(fā)明中的PEG-PCL為非離子表面活性劑，去污能力強，無毒可降解，且降解產(chǎn)物無毒，不污染環(huán)境。PEG-PCL聚合物中PEG鏈段以重復的乙二醇為基礎結(jié)構(gòu)，具有一定的表面活性，并且具有高度親水性、無毒、無抗原性和免疫原性及良好組織相容性等優(yōu)點。組織應用PEG-PCL浸泡，在去細胞的同時又能有效保護細胞外基質(zhì)蛋白成分，減輕植入體內(nèi)后的免疫排斥反應。PEG與疏水性PCL鏈段結(jié)合后的共聚物PEG-PCL作為非離子表面活性劑，在醫(yī)藥、食品等領域得到廣泛應用。PCL和PEG均已被美國FDA組織批準在人體內(nèi)使用，且PEG-PCL是經(jīng)國際認證無毒害，具有良好的生物降解性和相容性。
[0045]本發(fā)明所制備的去細胞主動脈瓣支架材料，經(jīng)生物學性能和力學性能評價，其中生物學性能檢測包括蘇木素-伊紅(HE)染色、MASSON染色，掃描電子顯微鏡觀察瓣膜去細胞情況，測定瓣膜DNA含量、含水量、膠原蛋白含量、彈性蛋白含量，細胞毒性以及瓣膜溶血實驗；力學性能測試包括最大拉伸強度、斷裂強度、斷裂伸長率和彈性模量的測定。實驗證實，本發(fā)明制備的去細胞主動脈瓣支架具備良好的生物學性能和力學性能，達到本發(fā)明的目的。
[0046]本發(fā)明所取得的有益效果:
[0047](I)本發(fā)明首次應用可降解無毒的表面活性劑PEG-PCL作為去細胞試劑，并成功地對豬主動脈瓣進行去細胞處理，細胞去除完全，去細胞細胞外基質(zhì)超微結(jié)構(gòu)保留完全且具備良好的生物相容性和力學性能，此為構(gòu)建組織工程心臟瓣膜支架材料提供了一種新的去細胞方法。
[0048](2)本發(fā)明中的非離子表面活性劑PEG-PCL作為一種去細胞試劑，與目前常用的去細胞試劑(曲拉通、脫氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉、胰酶等)相比，該試劑無毒無刺激性，可降解且降解產(chǎn)物無毒，去細胞方法簡單易行，便于去細胞支架材料的批量生產(chǎn)，并且該去細胞溶液便于消毒。PEG-PCL可自行合成，合成方法簡單，市場上亦有成品出售，價格低廉。
[0049](3)本發(fā)明所制備去細胞瓣的DNA含量與新鮮正常瓣膜相比大幅降低(P
<0.05)，說明本發(fā)明的去細胞方法能將瓣膜的免疫原性大幅降低，可減少瓣膜植入體內(nèi)后的免疫排斥反應。
[0050](4)應用本發(fā)明中的非離子表面活性劑PEG-PCL作為去細胞試劑，可解決目前常用去細胞試劑毒性殘留問題，應用PEG-PCL作為去細胞試劑在生物支架材料的構(gòu)建中具有重要的意義。
【附圖說明】
[0051]圖1為實施例一的共聚物PEG-PCL的紅外光譜圖。
[0052]圖2為實施例一的共聚物PEG-PCL的核磁共振氫譜圖。
[0053]圖3A為實施例一所述對照組新鮮正常主動脈瓣HE染色圖，圖3B為實驗組去細胞主動脈瓣HE染色圖。
[0054]圖4A為實施例一所述對照組新鮮正常主動脈瓣MASSON染色圖，圖4B為實驗組去細胞主動脈瓣MASSON染色圖。
[0055]圖5A為實施例一所述對照組新鮮正常主動脈瓣掃描電子顯微鏡圖，圖5B為實驗組去細胞主動脈辧掃描電子顯微鏡圖。
[0056]圖6A為實施例一拉