專利名稱：革胡子鯰生長激素基因表達定量pcr分析中用于內參基因擴增的引物序列的制作方法
技術領域：
本發明屬于機理研究的分子生物學技術領域。特別涉及一種革胡子鯰(Clarias gariepinus)在養殖過程中與生長相關的重要內分泌因子——革胡子鯰生長激素基因表達定量PCR分析中用于內參基因擴增的引物序列。
背景技術：
革胡子鯰具有耐低氧能力強、生長快、疾病少等特點，是一種發展前景良好的水產養殖品種，在國內外養殖非常普遍。在食用價值上該魚具有蛋白質含量高、營養豐富、肉味鮮美，刺少肉多的特點，并且具有滋補功效，對于手術傷口愈合有顯著的輔助治療作用。國內外對革胡子鯰的研究主要集中在人工繁殖和苗種培育、養殖模式及其養殖技術的研究， 而對革胡子鯰的基礎生物學方面的研究報道極少，主要有對其性激素、組織對氨的積累、對水中某些化學物質的組織病理學反應以及對水中重金屬離子的積累等研究。而對革胡子鯰生長迅速、抗逆性強的機理的基礎研究未見報道。魚類的生長與其他脊椎動物相同，是一個復雜的生物代謝過程，受基因型、激素、 營養、環境等多方面的影響。對動物生長機理的研究其首選是從生長軸入手，生長軸是動物體內從下丘腦——垂體——靴器官的一系列激素及其受體所組成的神經內分泌系統。其中，生長激素(GH)是調控脊椎動物生長的重要內分泌因子，也是研究動物生長最重要的因子。GH除了對魚類的生長有很強的促進作用外，同時對魚類的免疫系統、生殖生理及海水適應性也有著重要的影響。此外還有研究顯示GH基因多態性與動物的生產性能有關。從魚類生長軸中的關鍵因子GH入手，通過GH基因表達的實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)分析，探討高密度養殖革胡子鯰快速生長的機理。對于基因表達的qPCR分析，既要有擬分析的目標基因，又要有適宜的內參基因。常用的內參基因有beta-actirulSS rRNA和GAPDH基因。在qPCR中，引物序列對產物的特異性和有效擴增來說至關重要。只有適宜的寡核苷酸序列，在qPCR中同時滿足下述3個條件第一，利用較高濃度cDNA (如反轉錄后稀釋5 10倍的cDNA)在進行qPCR時Ct值應小于18 20 ；第二，每個反應的熔解曲線應為1個峰；第三，通過建立標準曲線得出的擴增效率應在90 105% (標準曲線的R2 值應大于0. 98，重復樣本Ct值的標準差應彡0. 5)。此時的寡核苷酸序列才能作為qPCR的引物。盡管qPCR技術已經成熟，目前已成為不同樣本間進行基因表達水平定量差異比較的權威性方法。在過去的10年間，該方法迅速流行，出版的文章超過2萬余篇，涉及醫學、 環境和農業研究。但在應用此技術的實驗過程中，需要研究人員自己設計并檢測引物是否可用于qPCR。目前沒有革胡子鯰相關目標基因表達qPCR分析適宜的引物核苷酸序列，特別是用于內參基因擴增的弓I物核苷酸序列。

發明內容
本發明目的是提供一種革胡子鯰生長激素基因表達定量PCR(qPCR)分析中用于內參基因擴增的引物核苷酸序列，提供有利于對革胡子鯰生長迅速的機理的基礎研究的工具。本發明設計并檢測了 2對目標基因(GH)和4對內參基因(beta-actin和18S rRNA 各2對)弓丨物序列，其中1對目標基因和2對內參基因的引物符合qPCR的要求。本發明的優點在于內參基因擴增的引物應用廣，不僅可以用于革胡子鯰的GH基因表達分析，理論上可用于該種魚類的任一基因的qPCR分析；此外，GenBank檢索認為，申請的2對內參基因的擴增引物，還可用于其他一些鯰形目魚類的基因表達的qPCR分析。這一發明為革胡子鯰以及幾種鯰形目魚類的基礎研究奠定了基礎。本發明具體內容一種革胡子鯰GH基因表達qPCR分析時用于內參基因(18S rRNA)擴增的2對引物的核苷酸序列，其特征見表1表1申請專利的引物核苷酸序列信息
引物對引物名稱引物序列5’—3’引物的堿基數bp第1對q-18SFlATTACCCATTCCCGACAC18q-18S RlACGCTCATTCCGATTACA18第2對q-18S F4 q-18SR4GCCGTCAAACTCGCCTGAATACCT AAATGCTTTCGCTTTCGTCCGTCT24 24表中的兩對引物不僅可作為革胡子鯰GH基因表達qPCR分析時內參基因(18S rRNA)的擴增引物，而且可作為革胡子鯰所有待檢目標基因表達qPCR分析時，以18S rRNA 為內參基因的擴增引物。表中的兩對引物不僅可應用于革胡子鯰的研究，還可應用于其它一些鯰形目魚類的待檢目標基因表達qPCR分析時以18S rRNA作為內參基因的研究。革胡子鯰GH基因表達qPCR分析時用于內參基因(18S rRNA)擴增的2對引物核苷酸序列的制作方法一、總體RNA的提取應用Trizol試劑提取單個垂體的總RNA，經瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測， 分析其完整性和純度。

圖1瓊脂糖凝膠電泳結果顯示RNA樣本的^S/18S rRNA的條帶亮度的比值在1 2之間，提示RNA樣本的完整性較好；而表2中RNA樣本的0D26_D28(1和OD26tl/ OD230的比值均在1. 8 2. 0之間，表明這兩個RNA樣本沒有蛋白和酚的污染，均可用于qPCR 實驗。表2總RNA的分光光度計檢測結果
權利要求
1. 一種革胡子鯰生長激素基因表達定量PCR分析中用于內參基因擴增的引物序列，其特征是引物對引物名稱引物序列5’—3’引物的堿基數bp第1對q-18SFlATTACCCATTCCCGACAC18q-18S RlACGCTCATTCCGATTACA18第2對q-18S F4 q-18SR4GCCGTCAAACTCGCCTGAATACCT AAATGCTTTCGCTTTCGTCCGTCT24 24
2.根據權利要求1所述的革胡子鯰生長激素基因表達定量PCR分析中用于內參基因擴增的引物序列，這兩對引物不僅可作為革胡子鯰GH基因表達qPCR分析時內參基因(18S rRNA)的擴增引物，而且可作為革胡子鯰所有待檢目標基因表達qPCR分析時，以18S rRNA 為內參基因的擴增引物。
3.根據權利要求1所述的革胡子鯰生長激素基因表達定量PCR分析中用于內參基因擴增的引物序列，這兩對引物不僅可應用于革胡子鯰的研究，還可應用于其它一些鯰形目魚類的待檢目標基因表達qPCR分析時以18S rRNA作為內參基因的研究。
4.革胡子鯰GH基因表達qPCR分析時用于內參基因(18SrRNA)擴增的兩對引物核苷酸序列的制作方法一、總體RNA的提取應用Trizol試劑提取單個垂體的總RNA，經瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測，分析其完整性和純度。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示RNA樣本的^S/18S rRNA的條帶亮度的比值在 1 2之間，提示RNA樣本的完整性較好；分光光度計檢測兩個RNA樣本的0D26_D28(1和OD26tl/ OD230的比值分別為1. 89和1. 99以及1. 96和2. 00，即兩個RNA樣本的OD26qaii28q和0D26(1/。D23。 的比值均在1. 8 2. O之間。表明這兩個RNA樣本沒有蛋白和酚的污染，均可用于qPCR實驗。二、RNA的反轉錄將上述1個RNA樣本反轉錄成cDNA第一條鏈(RevertAid cDNA第一條鏈合成試劑盒)，用于所設計引物的評估。三、引物的設計與常規PCR評估1). GH、18S rRNA和beta-actin基因片段擴增引物的設計本試驗中待檢目標基因為GH，擬用18S rRNA或beta-actin作為內參基因。GH基因擴增引物根據本實驗室克隆的革胡子鯰GH全長cDNA(GenBank檢索號FJ823972)、18S rRNA和beta-actin基因的擴增引物分別根據GenBank檢索的18S rRNA (GenBank檢索號 AJ876383)和 beta-actin(GenBank 檢索號腿76擬99)序列，應用軟件 Primer 5. O 設計。 根據qPCR引物設計的基本原則，從設計的數十對引物中預選出GH、18S rRNA和beta-actin 擴增的引物各2對，并由上海生工生物工程有限公司合成；其引物信息如下表。
全文摘要
一種革胡子鯰GH基因表達qPCR分析時用于內參基因(18S rRNA)擴增的2對引物的核苷酸序列，兩對引物不僅可作為革胡子鯰GH基因表達qPCR分析時內參基因(18S rRNA)的擴增引物，而且可作為革胡子鯰所有待檢目標基因表達qPCR分析時，以18SrRNA為內參基因的擴增引物。兩對引物不僅可應用于革胡子鯰的研究，還可應用于其它一些鯰形目魚類的待檢目標基因表達qPCR分析時以18S rRNA作為內參基因的研究。
文檔編號C12Q1/68GK102321624SQ201110252308
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月30日 優先權日2011年8月30日
發明者何靜慧, 徐敏, 王曉梅, 王茜, 郭永軍 申請人:天津農學院