專利名稱：一種人類骨髓、臍帶血、外周血細胞處理試劑盒及細胞處理方法
技術領域：
本發明書屬生物醫學技術應用領域。具體涉及一種體外分離人類骨髓、臍帶血及外周血中干細胞的方法，特別是一種人類骨髓、臍帶血、外周血干細胞處理試劑盒及細胞處理方法。
背景技術：
隨著現在科學技術的不斷發展，用于人類血液細胞的分離技術不斷地發展和優化，目前的干細胞分離處理方法包括免疫磁珠法、流式細胞儀法、血細胞分離機法、培養擴增法及密度梯度離心法等，但是皆存在諸多的弊端。(I)免疫磁珠法通過包被在磁珠微粒上的抗體與細胞表面相應抗原陽性的細胞反應結合，然后通過磁性吸附原理將非吸附的細胞去除掉，收集被磁珠抗體吸附的細胞，此方法造價高，增加了患者的負擔，不利于項目的 推廣和普及，而且對細胞活性有損傷，影響細胞療效。(2)流式細胞儀法也是利用對目標細胞進行標記識別的原理通過流式細胞儀進行分選、收集。該方法存在篩選細胞范圍小、細胞被標記后活性降低以及無法預知標記物在人體內的影響；而且該方法細胞污染風險高(3)血細胞分離機法只適用于從外周血中分離干細胞，應用受到限制；該方法需要給患者注射干細胞動員劑而增加治療負擔，同時分離后干細胞量小、液體體積大，對患者存在危險；(4)體外培養擴增法則需要對采集人類血液細胞進行培養，再清洗使用，此方法增加了污染風險，同時干細胞向未知方向分化為未知干細胞，培養時間長。目前基于密度梯度法的干細胞分離方法在臨床上得到較廣的應用。但是不同方法及操作步驟產生的效果不同，各有利弊，總體而言，存在如下幾個問題(I)不能標準化。比如申請號為200610035900. 5的“一種干細胞分層液及其用于干細胞分離的方法”需要操作者自己配制工作液，而且需要調節比重，此方法增加了操作者的人為影響因素，不利于干細胞分離的推廣和產業化。(2)紅細胞去除不干凈比如申請號為200610035900. 5的“一種干細胞分層液及其用于干細胞分離的方法”特別是對于臍帶血來說，該專利方法除不凈紅細胞，最終臨床應用的時候大大增加了患者產生排異反應的風險；申請號為200910187212.4的“人類骨髓、臍帶血、外周血細胞處理試劑盒及細胞處理方法”也存在相同的缺點；(3)干細胞得率不高比如申請號為200610114475.9的“用于分離骨髓單個核細胞的試劑盒”，其缺點是分離的干細胞得率數量不高，需要進行細胞培養，但是由此增加了細胞污染率，同時體外細胞擴增所產生的細胞功能性不穩定，很難用于臨床治療 ’另外申請號為200610106875. 5的“一種有核細胞體外分離試劑盒及其應用方法”所采用的HIST0PAGUE077的密度I. 077的淋巴細胞分離液，經分離后的細胞絕大多數為淋巴細胞，這樣直接導致細胞中能夠用于治療的干細胞占少數，影響臨床療效；(4)分離純化成本太高比如申請號為200710137781. 9的“骨髓臍帶血干細胞體外分離試劑盒及其應用方法”的專利，其試劑中添加了 Iin抗體，導致成本大大提高，投入臨床使用后，大大增加了患者的經濟負擔，導致患者看不起病，接受不起細胞治療，并且使用了 Iin抗體對細胞清洗造成了較大負擔，此種物質進入人體后對人體的影響還是個未知數，還有待進一步研究。(5)沒有考慮蛋白沉淀、細胞凝聚因素對后期干細胞應用的風險采用離心的方式分離純化干細胞，在操作過程中往往由于臍血、外周血樣品質量不同，干細胞在純化過程中產生凝聚和沉淀，但此沉淀如果沒有及時去除，在后期的應用過程中容易造成患者的微血管栓塞，影響治療效果，嚴重者可危及患者的生命安全。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是為了提供一種操作性強、臨床安全性高、便于臨床推廣的人類骨髓、臍帶血、外周血細胞處理試劑盒及細胞處理方法，它從根本上解決了現有 細胞分離技術中存在的造價高、細胞活性低、標記物進入人體后對人體影響不明，需要注射動員劑造成患者痛苦，繁瑣不適用臨床等問題。同時本試劑盒易于存儲運輸、可產業化、使用方便快捷。本發明的技術方案是人類骨髓、臍帶血、外周血細胞處理試劑盒，其技術要點是所述試劑盒中包含以下四種試劑A號液為稀釋液PBS液；B號液為密度液泛影酸鈉-聚蔗糖400#或HIST0PAQUE1077或Ficoll ;泛影酸鈉-聚蔗糖400#由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度為I. 075±0. 001的密度液；C號液為洗滌液0. 9%氯化鈉注射液；D號液為除紅細胞液0. 8%氯化氨溶液；一種應用如權利要求I所述的人類骨髓、臍帶血、外周血細胞處理試劑盒及細胞處理方法，其技術要點是將含有枸櫞酸鈉抗凝劑的骨髓或臍帶血或外周血按大于等于I I的比例加入A液，混勻；根據稀釋好的樣品體積，取適當數量的15ml離心管，先各裝4ml的B液，再各取IOml稀釋好的樣品鋪到B液上，然后以500_850g離心25分鐘，分出干細胞層，收集干細胞層后用C液清洗細胞I次，用5-10ml的C液重懸細胞，加入約三倍體積的D液，混勻，反應6分鐘，再以350-550g離心10分鐘，去除上清，收集干細胞后用C液清洗細胞1-2次，根據需要再用70微米過濾器進行過濾，收集過濾后的干細胞后用C液清洗細胞1-2次，離心濃縮后用C液稀釋到5-50毫升，待用。本發明的優點和積極的技術效果(I)本發明能夠分離人類骨髓或臍帶血或外周血中的干細胞，即將試劑盒中4種試劑組合應用，通過B號試劑密度梯度離心，根據各種細胞密度差異將它們分散于自上而下的試劑層次，去除人類骨髓或人類臍帶血或外周血中的血漿，血小板，血紅蛋白，粒細胞和大部分紅細胞等,經過本發明分離的干細胞回收率能夠達到85%以上；(2)本發明通過將濃縮后的干細胞加入三倍體積的D號液進行反應，使紅細胞破碎，再通過離心收集純化的干細胞，達到去除紅細胞的作用，避免了干細胞在后續的應用過程中患者產生排異反應的風險以及紅細胞干擾；(3)本發明將純化好的干細胞通過過濾器過濾，去除可能存在的沉淀雜質，通過本方法制備的干細胞，避免了后續干細胞應用過程中由于沉淀而引發的微血管栓塞危險。
(4)本試劑盒包含分離純化試劑盒的所有溶液，無需使用者另外準備溶液，簡便使用者的使用準備工作，也避免使用者人為的污染或者第三方污染引入。(5)本發明適用于人類骨髓、臍帶血、外周血的干細胞分離，對于不同的樣品，試劑組成相同，避免了國內現有的一些專利只能分離人類骨髓和臍帶血，不能分離外周血的問題。(6)本發明試劑原料便宜，配置過程簡單、質量可控，不使用質量難以控制的生物制品，具有造價低，無任何標記物，保留原有細胞活性，細胞數量能夠滿足臨床治療的需要等優點。(7)本發明可根據樣品體積的需要，按比例加入不同體積的試劑溶液進行操作即 可，適用于臨床小批量樣品的操作或者大批量操作，避免了樣品的浪費，是臨床上迫切需要的一種分離細胞的試劑盒及方法。
具體實施例方式下面結合具體實施兩例，進一步闡述本發明。本實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明要求保護的范圍。實施例I :本發明研制了一種骨髓、臍帶血、外周血細胞處理試劑盒，其中試劑盒包含以下四種試劑A號液為稀釋液PBS溶液；B號液為密度液泛影酸鈉-聚蔗糖400#或HIST0PAQUE1077或Ficoll ;泛影酸鈉-聚蔗糖400#由聚蔗糖和泛影酸鈉配制成的密度為I. 075±0. 001的密度液；C號液為洗滌液0. 9%氯化鈉注射液；D號液為除紅細胞液0. 8%氯化氨溶液；本發明也公開了一種應用上述試劑盒的細胞處理方法，其具體步驟是將含有枸櫞酸鈉抗凝劑的骨髓或臍帶血或外周血按大于等于I : I的比例加入A液，混勻；根據稀釋好的樣品體積，取適當數量的15ml離心管，先各裝4ml的B液，再各取IOml稀釋好的樣品鋪到B液上，然后以500-850g離心25分鐘，分出干細胞層，收集干細胞層后用C液清洗細胞I次，用5-10ml的C液重懸細胞，加入約三倍體積的D液，混勻，反應6分鐘，再以350-550g離心10分鐘，去除上清，收集干細胞后用C液清洗細胞1-2次，根據需要再用70微米過濾器進行過濾，收集過濾后的干細胞后用C液清洗細胞1-2次，離心濃縮后用C液稀釋到5-50暈升，待用。為了更好理解和說明本發明，下面利用實施例來詳細闡述。實施例2 應用本發明試劑盒分離臍帶血干細胞方法步驟試劑盒組成如下A號液為稀釋液PBS溶液；B號液為密度液Ficoll溶液；C號液為洗滌液0. 9%氯化鈉注射液溶液；D號液為除紅細胞液0. 8%氯化氨溶液；
將上述A號液經過10磅、10分鐘滅菌，檢測其內素含量彡0. 5EU/ml，裝瓶，4°C C保存。B號液經過10磅、10分鐘滅菌，檢測其內毒素含量彡0. 5EU/ml，裝瓶。利用上述試劑盒分離IOOml臍帶血干細胞方法步驟如下(I)取A液100ml，按I : I比例稀釋臍血，混勻，可4度保存備用；(2)取20個15ml的離心管，用IOml移液管吸取B液4ml加入各管中備用；(3)用IOml的移液管吸取臍血各10ml，沿管壁緩慢疊加于B液液面上，注意保持清楚的界面；(4)水平離心，轉速2114rpm，離心時間25分鐘，溫度21度；(5)取4個50ml離心管，各加入35ml C液,備用； (6)步驟4離心后，離心管內樣品溶液分為四層，用巴氏吸管吸取第三層(白色云霧層狹窄帶)平均分于步驟5中的4個離心管中，混勻；水平離心1674rpmX20分鐘，溫度21度；(7)用25ml移液管吸去上清，用IOml移液管吸取5ml的C液于一離心管中，重懸細胞，并依次將4管細胞匯集到一個50ml離心管中，輕柔吹打混勻；(8)若步驟7中紅細胞過多，則在離心管中緩慢加入15ml的D液，混勻，反應6分鐘，其中每隔2分鐘混勻一次；水平離心1674rpmX 10分鐘，溫度21度；(9)用IOml移液管吸去上清，加入20ml的C液，混勻；水平離心，轉速1674rpm，離心時間20分鐘，溫度21度；(10)若重懸的細胞出現明顯可見大顆粒沉淀，可采用過濾器進行過濾；再將過濾液進行離心；水平離心，轉速1674rpm，離心時間20分鐘，溫度21度；(11)用IOml移液管吸去上清，加入20ml的C液，混勻；水平離心，轉速1674rpm，離心時間20分鐘，溫度21度；(12)用IOml移液管吸去上清，根據需要加入5ml或者20ml的C液重懸細胞，保存備用。
權利要求
1.一種人類骨髓、臍帶血、外周血細胞處理試劑盒及細胞處理方法，其特征在于所述試劑盒中包含以下四種試劑 A號液為稀釋液PBS液； B號液為密度液泛影酸鈉-聚蔗糖400#或HIST0PAQUE1077或Ficoll ;泛影酸鈉-聚蔗糖400#由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度為I. 077±0. 001的密度液； C號液為洗滌液0. 9%氯化鈉液； D號液為紅細胞裂解液0. 8%氯化氨溶液。
2.—種應用如權利要求I所述的人類骨髓、臍帶血、外周血細胞處理試劑盒及細胞處理方法，其特征在于該方法包括下列步驟 將含有枸櫞酸鈉抗凝劑的骨髓或臍帶血或外周血按大于等于I:I的比例加入A液，混勻；根據稀釋好的樣品體積，取適當數量的15ml離心管，先各裝4ml的B液，再各取IOml稀釋好的樣品鋪到B液上，然后以500-850g離心25分鐘，分出干細胞層，收集干細胞層后用C液清洗細胞I次，用5-10ml的C液重懸細胞，加入約三倍體積的D液，混勻，反應6分鐘，再以350-550g離心10分鐘，去除上清，收集干細胞后用C液清洗細胞1-2次，根據需要再用過濾器進行過濾，收集過濾后的干細胞后用C液清洗細胞1-2次，離心濃縮后用C液稀釋到5-50暈升，待用。
3.—種應用如權利要求I和2所述的人類骨髓、臍帶血、外周血細胞處理試劑盒及細胞處理方法，其特征在于使用0. 8%氯化氨溶液處理干細胞中殘留的紅細胞。
4.一種應用如權利要求I和2所述的人類骨髓、臍帶血、外周血細胞處理試劑盒及細胞處理方法，其特征在于使用70微米孔徑過濾器過濾純化后的干細胞，以去除凝聚的細胞或者沉淀雜質。
全文摘要
本發明公開了一種人類骨髓、臍帶血、外周血細胞處理試劑盒，提供一種操作性強、臨床安全性高、便于臨床推廣的人類骨髓、臍帶血、外周血細胞處理試劑盒及細胞處理方法，所述試劑盒中包含以下四種試劑A號液為稀釋液；B號液為密度液；C號液為洗滌液；D號液為除紅細胞液。本發明從根本上解決了現有細胞分離技術中存在的造價高、細胞活性低、標記物進入人體后對人體影響不明，需要注射動員劑造成患者痛苦，繁瑣不適用臨床等問題。
文檔編號C12N5/0789GK102965339SQ20111025677
公開日2013年3月13日 申請日期2011年9月1日 優先權日2011年9月1日
發明者武棟成 申請人:武漢康苑生物醫藥科技有限公司