專利名稱：高密度糞腸球菌及其發酵培養工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及飼料級微生物及其發酵培養工藝，特別是高密度糞腸球菌及其發酵培養工藝。
背景技術：
糞腸球菌(Enterococcus faeccalis)，也叫糞鏈球菌，是我國農業部允許使用的16種飼料用微生物品種之一，美國食品藥物管理局(FDA)和美國飼料公定協會 (AAFCO)則公布了 44種“可直接飼喂且通常認為是安全的微生物(Generally Recognized as Safe, GRAS) ”作為微生態制劑的出發菌株，其中均有糞腸球菌。糞腸球菌作為農業部批準使用的有益微生物菌種之一，已被廣泛應用于養殖業中，為減少和避免使用抗生素發揮了很大作用。但現有工藝生產的糞腸球菌其質量要求中的一項為有效活菌數不足，直接影響其使用效果和推廣應用。經過廣泛不完全收集統計國內廠商樣品，發現國內固態發酵工藝生產廠家所生產產品含活菌量僅為20 30億/克的水平，且在保存期衰減損失率大，特別是經85°C高溫處理的損失率更大；未見糞腸球菌采用高密度固態發酵培養工藝生產的報道。糞腸球菌的研究在國外起步較早，在國內則尚處于研究初級階段，國外最為先進和著名的產品有瑞士百福門生物公司(Cerbios-Pharma S. A. Swizerland)于2001年進入中國市場的產品“LBC ME10”，農業部批準文號為J2001)外飼準285號。賜美健LBC MElO 的特點是菌數含量高，活力強，并采用菌種多層包埋技術對細胞進行保護，其含活菌量可達到100億/克。目前現有的糞腸球菌生產普遍采用液體深層發酵培養工藝，其存在發酵工藝生產設備投資大，原料及能源消耗量大，且生產出的產品保存性差，球菌活性不高，其含活菌量少，最高為100億/克。

發明內容
本發明內容是提供一種高密度糞腸球菌及其發酵培養工藝，用高密度固體發酵培養工藝，具有投資少、節能減排、清潔環保、產品保存性好，活性高，產品含活菌量高等特點。本發明一種糞腸球菌發酵培養工藝是采用固體發酵培養工藝，包括
1)以米糠、麩皮、玉米粉、豆粕中任意一種或幾種原料，和活性炭作固態培養基料；
2)于固態培養基料中加入營養液培養基作為固態發酵培養基；
3)將固態發酵培養基滅菌后，接種糞腸球菌種液，經培養，干燥，粉碎制得高密度糞腸球菌產品；
所述的營養液培養基各質量組分組成為葡萄糖5 20. 0，蛋白胨1 10. 0，牛肉膏1 5.0，酵母膏1 5.0，硫酸鎂0 0.5，硫酸錳0 0.2，磷酸氫二鉀0. 5 3. 0， 去離子水1000，pH6. 0 7. 5 ；
所述的糞腸球菌種液為用MRS液體培養基培養再接種糞腸球菌制得。本發明高密度糞腸球菌發酵培養工藝，優選所述固體發酵培養工藝，包括
1)固態培養基料各組分組成按質量比為米糠麩皮玉米粉豆粕活性炭=1 1. 5 2. 5: 1. 5 2. 5:2. 5 3. 5:1. 5 2. 5 的比例混合；
2)于上步固態培養基料中按質量比固態培養基料營養液培養基為1:1 1. 5的比例加入營養液培養基，并加入飼料用稀土添加劑，制成固態發酵培養基；
3)將2)步制得的固態發酵培養基，濕熱滅菌，冷卻后接種糞腸球菌種液，培養，干燥，粉碎制得糞腸球菌產品；
所述的糞腸球菌種液是用MRS液體培養基，經滅菌冷卻后，接種糞腸球菌斜面種子，在 30°C 40°C溫度，180rpm轉速下，于搖床上培養18 20小時制得。本發明所述3)步固態發酵培養基經滅菌冷卻后，接種糞腸球菌種液，糞腸球菌種液接入量為固態發酵培養基質量的5 20%，培養過程中控制培養溫度30 40°C，時間 20 72小時。本發明所述3)步的培養過程中至少進行一次以上營養液培養基的流加操作。本發明所述的活性炭為顆粒狀活性炭，其顆粒直徑控制在3 8mm。本發明3)步所述的干燥粉碎是發酵培養后，物料于35 50°C下通風干燥至含水量10%以下，再粉碎至60 80目即為糞腸球菌成品。本發明所述2)步飼料用稀土添加劑為含有鑭、鈰有效元素的飼料用稀土添加劑； 添加劑加入量按質量比是固態培養基料營養液培養基飼料用稀土添加劑為1 :ι. 0 1. 3 0. 00008 0. 00015。本發明所述的糞腸球菌種液的制備是MRS液體培養基各質量組分組成為蛋白胨8 12，牛肉膏8 12，酵母膏3 6，檸檬酸氫二銨1 3. 0，葡萄糖15 25，吐溫801， 乙酸鈉3 6，磷酸氫二鉀1 3，硫酸鎂0. 4 0. 8，硫酸錳0. 1 0. 3，蒸餾水800 1200 ，pH = 6. 2 6. 6 ；滅菌條件為溫度110 121°C，時間20 30分鐘，接種糞腸球菌斜面種子，放置于搖床上培養18 M小時，即得到糞腸球菌種液。本發明所述流加操作分二次進行，是兩次將滅菌后的營養液培養基用碳酸鈉調節 PH值到8 8. 5，制成為堿性營養液；再按堿性營養液固態發酵培養基=0. 3 :1的質量比例加入堿性營養液于固態發酵培養基培養料中，于無菌環境條件下翻料攪拌數分鐘，繼續培養到結束。一種高密度糞腸球菌依上面所述的發酵培養工藝制備獲得。下面是本發明產品和國內外樣品的對比表1 ；
表1 本發明高密度糞腸球菌與國內外樣品的儲存期損失率對照表
權利要求
1.一種高密度糞腸球菌發酵培養工藝，其特征是采用固體發酵培養工藝，包括1)以米糠、麩皮、玉米粉、豆粕中任意一種或幾種原料，和活性炭作為固態培養基料；2)于固態培養基料中加入營養液培養基作為固態發酵培養基；3)將固態發酵培養基滅菌后，接種糞腸球菌種液，經培養，干燥，粉碎制得高密度糞腸球菌產品；所述的營養液培養基各質量組分組成為葡萄糖5 20. 0，蛋白胨1 10. 0，牛肉膏1 5.0，酵母膏1 5.0，硫酸鎂0 0.5，硫酸錳0 0.2，磷酸氫二鉀0. 5 3. 0， 去離子水1000，pH6. 0 7. 5 ；所述的糞腸球菌種液為用MRS液體培養基接種糞腸球菌培養制得。
2.依據權利要求1所述的高密度糞腸球菌發酵培養工藝，其特征是所述固體發酵培養工藝，包括1)固態培養基料各組分組成按質量比為米糠麩皮玉米粉豆粕活性炭=1 1. 5 2. 5: 1. 5 2. 5:2. 5 3. 5:1. 5 2. 5 的比例混合；2)于上步固態培養基料中按質量比固態培養基料營養液培養基為1:1 1. 5的比例加入營養液培養基，并加入飼料用稀土添加劑，制成固態發酵培養基；3)將2)步制得的固態發酵培養基，濕熱滅菌，冷卻后接種糞腸球菌種液，培養，干燥，粉碎制糞腸球菌產品；所述的糞腸球菌種液是用MRS液體培養基，經滅菌冷卻后，接種糞腸球菌斜面種子，在 30°C 40°C溫度，180rpm轉速下，于搖床上培養18 20小時制得。
3.依據權利要求1或2所的高密度糞腸球菌發酵培養工藝，其特征是所述3)步固態發酵培養基經滅菌冷卻后，接種糞腸球菌種液，糞腸球菌種液接入量為固態發酵培養基質量的5 20%，培養過程中控制培養溫度30 40°C，時間20 72小時。
4.依據權利要求1或2所述的高密度糞腸球菌發酵培養工藝，其特征是所述3)步的培養過程中至少進行一次以上營養液培養基的流加操作。
5.依據權利要求1或2所述的高密度糞腸球菌發酵培養工藝，其特征是所述活性炭為顆粒狀活性炭，其顆粒直徑控制在3 8mm。
6.依據權利要求1或2所的高密度糞腸球菌發酵培養工藝，其特征是3)步所述的干燥粉碎是發酵培養后，物料于35 50°C下通風干燥至含水量10%以下，再粉碎至60 80目即為糞腸球菌成品。
7.依據權利要求2所述的高密度糞腸球菌發酵培養工藝，其特征是所述2)步飼料用稀土添加劑為含有鑭、鈰有效元素的飼料用稀土添加劑；添加劑加入量按質量比是固態培養基料營養液培養基飼料用稀土添加劑為1 1.0~ 1.3 0. 00008 0. 00015。
8.依據權利要求1或2所述的高密度糞腸球菌發酵培養工藝，其特征是所述的糞腸球菌種液的制備是MRS液體培養基各質量組分組成為蛋白胨8 12，牛肉膏8 12，酵母膏3 6，檸檬酸氫二銨1 3. 0，葡萄糖15 25，吐溫801，乙酸鈉3 6，磷酸氫二鉀1 3，硫酸鎂0. 4 0. 8，硫酸錳0. 1 0. 3，蒸餾水800 1200，pH = 6. 2 6. 6 ；滅菌條件為溫度110 121°C，時間20 30分鐘，接種糞腸球菌斜面種子，放置于搖床上培養18 M小時，即得到糞腸球菌種液。
9.依據權利要求4所述的高密度糞腸球菌發酵培養工藝，其特征是分二次進行流加操作，是兩次將滅菌后的營養液培養基用碳酸鈉調節PH值到8 8. 5，制成為堿性營養液；再按堿性營養液固態發酵培養基=0.3:1的質量比例加入堿性營養液于固態發酵培養基培養料中，于無菌環境條件下翻料攪拌數分鐘，繼續培養到結束。
10. 一種高密度糞腸球菌依據權利要求1所述的糞腸球菌發酵培養工藝制備獲得。
全文摘要
本發明就是要提供一種高密度糞腸球菌及其發酵培養工藝，用高密度固體發酵培養工藝，1)以米糠、麩皮、玉米粉、豆粕中任意一種或幾種原料，和活性炭作固態培養基料；2)于固態培養基料中加入營養液培養基作為固態發酵培養基；3)將固態發酵培養基滅菌后,接種糞腸球菌種液，經培養，干燥，粉碎制得高密度糞腸球菌產品；所述的營養液培養基各質量組分組成為葡萄糖5～20.0，蛋白胨1～10.0，牛肉膏1～5.0，酵母膏1～5.0，硫酸鎂0～0.5，硫酸錳0～0.2，磷酸氫二鉀0.5～3.0，去離子水1000，pH6.0～7.5；具有投資少、節能減排、清潔環保、產品保存性好，活性高，產品含活菌量高等特點。
文檔編號C12N1/20GK102286417SQ20111026851
公開日2011年12月21日 申請日期2011年9月9日 優先權日2011年9月9日
發明者楊林海, 鐘啟平 申請人:宜春強微生物科技有限公司