專利名稱：一種高密度發酵生產谷胱甘肽的方法
技術領域：
本發明涉及生物發酵工程領域，具體涉及高密度發酵生產谷胱甘肽的方法。
背景技術：
谷胱甘肽(glutathione, GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結合而成的三肽，半胱氨酸上的巰基為其活性基團。谷胱甘肽作為一種活性三膚，廣泛存在于大多數動物、植物和微生物中，是生物體內最重要的一種非蛋白琉基化合物。谷胱甘肽分為還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)兩種，在生物體內大量存在并起主要作用的是GSH，它在細胞內主要作為抗氧化劑、免疫增加劑和解毒劑參與了許多生理活動，對生物機體的生化防御體系起著重要作用。
生物體內谷胱甘肽的生成主要通過合成和還原兩條途徑谷胱甘肽生物合成由兩步依靠三磷酸腺苷的酶促反應構成，首先谷氨酸和半胱氨酸在Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶(Y -glutamylcysteine synthetase)催化下合成Y -谷氨酰半胱氨酸,合成的原料由細胞外轉運或通過谷氨酰轉肽酶反應而來，然后在谷胱甘肽合成酶(glutathionesynthetase)作用下，Y -谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成谷胱甘肽。而谷胱甘肽還原途徑可由谷胱甘肽還原酶作用于氧化性谷胱甘肽(GSSG)而獲得，參與還原作用的NADPH由磷酸戊糖途徑而來。在正常生理情況下，反應主要向GSH方向進行，但GSH和GSSG這兩種形態可以相互轉化。自從谷胱甘肽被發現以來，它不僅作為試劑廣泛用于生物化學、醫學、生物學和化學的研究測定中，并且已成為一種極其重要的生物化學藥物。根據國外情報機構預測，谷胱甘肽作為一種多功能的生物活性添加劑在食品加工業中的應用將會愈來愈廣，它的需求量正日益增大。隨著谷胱甘肽的生理生化功能和性質被不斷研究發現，人們對其在醫藥工業、食品工業、體育運動領域及有關生物研究領域上的興趣將日益增長，對其需求量也將不斷增加。所以，谷胱甘肽具有一個極其廣闊的市場前景。

發明內容
本發明的目的在于運用高密度發酵生產谷胱甘肽，可以大幅度提高谷胱甘肽產量，并有效地降低發酵成本。為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案是一種高密度發酵生產谷胱甘肽的方法，它包括以巴斯德畢赤酵母(Pichia. pastoris SL1220)為發酵菌株,通過一級培養和二級培養后的二級種子接種于酵母培養基進行發酵培養，當發酵液OD達到100 200后，補加谷胱甘肽的前體氨基酸，控制發酵液中的碳源濃度在O. 01 O. 02mol/L,培養至48 64h為止。本發明選用巴斯德畢赤酵母(Pichia. pastoris SL1220)進行優化培養。巴斯德畢赤酵母，是甲醇營養型酵母中的一類能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源的酵母菌。與其它酵母一樣，在無性生長期主要以單倍體形式存在，當環境營養限制時，常誘導2個生理類型不同的接合型單倍體細胞交配，融合成雙倍體。所選用的巴斯德畢赤酵母其特征在于所要求的菌株為高產生物工程改造菌。
進一步在上述高密度發酵生產谷胱甘肽的方法中，所述的一級培養和二級培養是指從新鮮斜面上挑取巴斯德畢赤酵母(Pichia. pastoris SL1220)發酵菌株的菌體，接入裝有50±5ml培養液的250ml搖瓶中，100±5rpm，32±2°C振蕩培養10 12h ;再以10%的接種量將一級種子接入二級種子培養液，控制pH值6. 5±0. 5，溶氧大于等于50%，32±2°C培養12 14h后得二級種子，所述的一、二級培養液均是本領域技術人員常用的菌種培養液。二級種子接入到酵母培養基的接種量為O. 5 5%。優選的接種量為1. 5%。接種量是指移入種子液的體積和接種后培養液體積的比例，接種量的大小決定于生產菌種在發酵罐中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短發酵罐中菌絲繁殖達到高峰的時間，使產物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長機會。但接種量過大或者過小，均會影響發酵。過大會引起溶氧不足，影響產物 合成；而且會過多移入代謝廢物，也不經濟；過小會延長培養時間，降低發酵罐的生產率。酵母培養基的碳源為葡萄糖、甲醇、糖蜜、麥芽汁、蔗糖中的至少一種，酵母培養基的氮源為酵母粉、酵母膏、蛋白胨、豆柏粉、氨水中的至少一種酵母培養基的碳源優選的是糖蜜，酵母培養基的氮源優選的是蛋白胨。在酵母培養基中的發酵培養pH為5. O 8. 0，發酵培養溫度為25 32°C。在酵母培養基中最優的發酵培養pH為6. 5，最優的發酵培養溫度為30°C。谷胱甘肽的前體氨基酸是L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L-甘氨酸中的至少一種，優選的是L-半胱氨酸。與現有技術相比,本發明選用巴斯德畢赤酵母(Pichia. pastoris SL1220)進行優化培養。巴斯德畢赤酵母，是甲醇營養型酵母中的一類能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源的酵母菌。與其它酵母一樣，在無性生長期主要以單倍體形式存在，當環境營養限制時，常誘導2個生理類型不同的接合型單倍體細胞交配，融合成雙倍體。所選用的巴斯德畢赤酵母其特征在于所要求的菌株為高產生物工程改造菌。所以本方法能大幅度提高谷胱甘肽產量，并有效地降低發酵成本。
具體實施例方式為更好理解本發明，下面結合實施例對本發明作進一步介紹，但需要說明的是，本發明所要求的保護的范圍并不局限于實施例所表述的范圍。實例I發酵菌株(Pichia. pastoris SL1220)經過一級、二級培養后,將1% (v/v)接種量接種至含有糖蜜和蛋白胨的發酵培養基中，使用50升發酵罐進行培養發酵，風量O. 5 3. OM3,轉速100 700rpm，pH7. 0，溫度32°C，培養63h，通過ALLOXAN (四氧嘧啶)衍生法測定發酵液中的谷胱甘肽含量，結果谷胱甘肽產率為4. 32g/L。實例2發酵菌株(Pichia. pastoris SL1220)經過一級、二級培養后,將1. 5% (v/v)接種量接種至含有糖蜜和蛋白胨的發酵培養基中，使用50升發酵罐進行培養發酵，風量0. 5
3.0M3，轉速100 700rpm，pH7. 0，溫度32°C，發酵后期加入L-半胱氨酸、L-甘氨酸，培養54h，通過ALLOXAN (四氧嘧啶)衍生法測定發酵液中的谷胱甘肽含量，結果谷胱甘肽產率為
4.81g/L。實例3發酵菌株(Pichia. pastoris SL1220)經過一級、二級培養后,將2. 5% (v/v)接種量接種至含有糖蜜和蛋白胨的發酵培養基中，使用50升發酵罐進行培養發酵，風量O. 5 3. OM3,轉速100 700rpm，pH7. O,溫度32°C，發酵后期加入L-半胱氨酸，培養52h，通過ALLOXAN (四氧嘧啶)衍生法測定發酵液中的谷胱甘肽含量，結果谷胱甘肽產率為4. 53g/L。實例4發酵菌株(Pichia. pastoris SL1220)經過一級、二級培養后,將1. 5% (v/v)接種量接種至含有糖蜜和蛋白胨的發酵培養基中，使用50升發酵罐進行培養發酵，風量O. 5 3. 0M3，轉速100 700rpm，pH6. 0，溫度32°C，發酵后期加入L-半胱氨酸、L-甘氨酸和L-谷氨酸，培養55h，通過ALLOXAN (四氧嘧啶)衍生法測定發酵液中的谷胱甘肽含量，結果谷胱甘肽產率為5. 43g/L。實例5發酵菌株(Pichia. pastoris SL1220)經過一級、二級培養后,將1. 5% (v/v)接種 量接種至含有糖蜜和蛋白胨的發酵培養基中，使用50升發酵罐進行培養發酵，風量O. 5 3. 0M3，轉速100 700rpm，pH6. 5，溫度32°C，發酵后期加入L-半胱氨酸、L-甘氨酸和L-谷氨酸，培養55h，通過ALLOXAN (四氧嘧啶)衍生法測定發酵液中的谷胱甘肽含量，結果谷胱甘肽產率為5. 74g/L。實例6發酵菌株(Pichia. pastoris SL1220)經過一級、二級培養后,將1. 5% (v/v)接種量接種至含有糖蜜和蛋白胨的發酵培養基中，使用50升發酵罐進行培養發酵，風量0. 5 3. 0M3，轉速100 700rpm，pH6. 5，溫度30°C，發酵后期加入L-半胱氨酸、L-甘氨酸和L-谷氨酸，培養53h，通過ALLOXAN (四氧嘧啶)衍生法測定發酵液中的谷胱甘肽含量，結果谷胱甘肽產率為6. 33g/L。實例7發酵菌株(Pichia. pastoris SL1220)經過一級、二級培養后,將1. 5% (v/v)接種量接種至含有糖蜜和蛋白胨的發酵培養基中，使用50升發酵罐進行培養發酵，風量0. 5
3.0M3，轉速100 700rpm，pH6. 5，溫度25°C，發酵后期加入L-半胱氨酸、L-甘氨酸和L-谷氨酸，培養55h，通過ALLOXAN (四氧嘧啶)衍生法測定發酵液中的谷胱甘肽含量，結果谷胱甘肽產率為5. 84g/L。
權利要求
1.一種高密度發酵生產谷胱甘肽的方法，其特征在于包括以巴斯德畢赤酵母 (Pichia. pastoris SL1220)為發酵菌株，通過一級培養和二級培養后的二級種子接種于酵母培養基進行發酵培養，當發酵液OD達到100 200后，補加谷胱甘肽的前體氨基酸，控制發酵液中的碳源濃度在O. 01 O. 02mol/L，培養至48 64h為止。
2.根據權利要求1所述的高密度發酵生產谷胱甘肽的方法，其特征在于所述的一級培養和二級培養是指從新鮮斜面上挑取巴斯德畢赤酵母(Pichia. pastoris SL1220)發酵菌株的菌體，接入裝有50±5ml培養液的250ml搖瓶中，100±5rpm，32±2°C振蕩培養10 12h ;再以10%的接種量將一級種子接入二級種子培養液，控制pH值6. 5±0. 5，溶氧大于等于50%，32±2°C培養12 14h后得二級種子。
3.根據權利要求2所述高密度發酵生產谷胱甘肽的方法，其特征在于二級種子接入到酵母培養基的接種量為O. 5 5%。
4.根據權利要求3所述高密度發酵生產谷胱甘肽的方法，其特征在于優選的接種量為1. 5%ο
5.根據權利要求3所述高密度發酵生產谷胱甘肽的方法，其特征在于酵母培養基的碳源為葡萄糖、甲醇、糖蜜、麥芽汁、蔗糖中的至少一種，酵母培養基的氮源為酵母粉、酵母膏、蛋白胨、豆柏粉、氨水中的至少一種。
6.根據權利要求5所述高密度發酵生產谷胱甘肽的方法，其特征在于酵母培養基的碳源優選的是糖蜜，酵母培養基的氮源優選的是蛋白胨。
7.根據權利要求3所述高密度發酵生產谷胱甘肽的方法，其特征在于在酵母培養基中的發酵培養pH為5. O 8. 0，發酵培養溫度為25 32°C。
8.根據權利要求7所述高密度發酵生產谷胱甘肽的方法，其特征在于在酵母培養基中的發酵培養pH為6. 5,發酵培養溫度為30°C。
9.根據權利要求3所述高密度發酵生產谷胱甘肽的方法，其特征在于谷胱甘肽的前體氨基酸是L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L-甘氨酸中的至少一種。
10.根據權利要求9所述高密度發酵生產谷胱甘肽的方法，其特征在于谷胱甘肽的前體氨基酸是L-半胱氨酸。
全文摘要
本發明公開了一種高密度發酵生產谷胱甘肽的方法，它包括以巴斯德畢赤酵母(Pichia.pastoris SL1220)為發酵菌株，通過一級培養和二級培養后的二級種子接種于酵母培養基進行發酵培養，當發酵液OD達到100～200后，補加谷胱甘肽的前體氨基酸，控制發酵液中的碳源濃度在0.01～0.02mol/L，培養至48～64h為止。本方法能大幅度提高谷胱甘肽產量，并有效地降低發酵成本。
文檔編號C12R1/84GK103014104SQ201210574778
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月26日 優先權日2012年12月26日
發明者朱義福, 周新榮, 吳平剛, 黃健華 申請人:廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司