專利名稱：一種球孢白僵菌的分階段固體培養方法
技術領域：
本發明涉及一種真菌的固體培養方法，特別是涉及一種球孢白僵菌ife^/^ria bassiana (以下簡稱白僵菌)的固體培養方法，屬生物發酵方法領域。
背景技術：
白僵菌是一類對農林害蟲寄主范圍廣且致病性強的昆蟲病原真菌，在害蟲生物防治的研究與應用中占有舉足輕重的地位。由于白僵菌具有對環境和脊椎動物無害，易培養、 殺蟲譜廣、致病力強等特點，是目前應用最為廣泛的真菌殺蟲劑，在多種農林害蟲的生物防治中都取得了明顯成效。目前國內外白僵菌生產主要采用液一固雙相發酵工藝，即首先經過液體發酵得到白僵菌芽生孢子或菌絲體，再將其接種于固體料上繼續培養，以獲得分生孢子。固態發酵階段目前在我國大多數生產廠家采用淺盤、紗窗等開放式生產模式，生產過程存在著對溫、濕度要求高，發酵周期長，且容易感染雜菌，產品質量不穩定等不足，這些問題阻礙了白僵菌殺蟲劑的生產應用及防治效果。

發明內容
為了解決目前白僵菌固態發酵階段存在的問題，本發明提供了一種工藝簡單，成本低，發酵周期短的白僵菌分階段固體培養方法。本發明的技術方案如下
將球孢白僵菌固體培養分為兩個階段，菌絲生長階段和產孢階段；在菌絲生長階段采用密閉式發酵，液體菌種接種固體培養料于密閉容器中進行培養；產孢階段將長滿菌絲的固體培養料扣出，采用開放式發酵。所述的密閉容器為可重復使用的PP材質帶蓋盒子，培養前進行表面消毒。所述菌絲生長階段的培養周期為2-3d，培養溫度設定為23士2°C。所述產孢階段的培養周期為3-4d，培養溫度設定為^±2°C。所述固體培養料的配方以重量百分比為單位，甘蔗渣或谷殼8-12%，麥麩 38-4 ，余量為水。在產孢階段將固體培養料扣出后同時分割固體培養料，可增加通氣量，促進白僵菌更快產孢。本發明將白僵菌固體培養分為兩個階段，菌絲生長階段和產孢階段。即在菌絲生長階段(固體培養前期)使用密閉容器進行培養，這可有效保證在菌絲生長階段所需求的高濕度，使菌絲迅速長滿整個培養料，同時極大減少了培養過程中的污染幾率；產孢階段(固體培養后期)采用開放式發酵，可明顯改善培養料的通氣性能，促進分生孢子的產生。本發明發酵工藝簡單，生產成本低，不需要復雜設備，發酵周期短，產品質量穩定，適合白僵菌實驗室生產及中試生產，亦可作為眾多中小白僵菌生產企業生產工藝改進的優選方案。本發明同時提供一種白僵菌固體培養料配方，該配方以麥麩和甘蔗渣(或谷殼)作為主要載體，
3原料價廉、易得，大大降低了生產成本。本發明的積極有益效果
本發明用于培養白僵菌的固體培養料配方簡單，原料主要為農副產品，廉價易得，成本低，制作簡單。不僅是農業廢棄物得以有效利用，且固體培養料的間隙度、疏松度合適，培養過程中無需額外通氣。本發明的分階段固體培養白僵菌的方法，是針對白僵菌生長的特點而設計，在菌絲生長階段，需要較高濕度，使用密閉的培養容器，可保證培養料和培養環境的濕度始終較高，從而滿足菌絲生長需要，這樣克服了開放式培養中濕度無法控制的缺點。同時，因白僵菌生產中，雜菌污染多出現在早期菌絲生長的階段，密閉式培養，可大大降低污染的概率，且即使出現污染的情況，亦不會擴散蔓延。白僵菌產孢階段，對環境濕度要求沒有菌絲生長階段高，甚至過高的濕度，會使得孢子二次萌發，從而影響產孢的進程。故產孢階段，采用開放式培養；且因培養料已經布滿白僵菌菌絲，不會出現雜菌污染情況。所以，整個固體培養過程無需調控環境濕度。3-本發明的白僵菌固體培養方法，工藝簡單，不需要復雜設備，發酵周期由同類技術的10-14d縮短到6-7d，極大地提高了生產效率，同時對環境濕度要求不高，顯著減少了雜菌污染概率，生產成本低廉，易控制，成功率高，產品質量穩定?？蓱糜趯嶒炇疑a及作為眾多中小白僵菌生產廠家技術升級的優選方案。具有顯著的社會和經濟效益。
具體實施例方式本發明的一種白僵菌分階段固體培養方法 1液體菌種的培養，包括如下步驟
1.1菌種白僵菌菌種，一般以斜面低溫保存。1. 2斜面菌種預先將白僵菌菌種用試管斜面在25士 1°C條件下傳代培養、活化， 當斜面表面長滿孢子時即可使用。斜面培養基為微生物培養中所通用的SDAY培養基。1.3液體培養基為通用的SDY培養基，每個500ml三角瓶中裝入200ml培養基， 121°C下蒸汽高溫滅菌30min，冷卻后備用。1.4接種于無菌操作臺中，從菌種斜面上挑取少量孢子及菌苔接入上述液體培
養基中。1.5搖床培養25士 1°C恒溫振蕩培養箱中振蕩培養60-7池，待長成白色粘稠菌絲體后即可接入固體培養料，進行白僵菌固體培養。2固體培養，包括如下步驟 2. 1固體培養料配方及制備
白僵菌固體培養料配方以重量份為單位，配方中含麥麩38-4 ，甘蔗渣8-12%，余量為水?；?，麥麩38-4 ，谷殼11-14%，余量為水。制備方法將麥麩和甘蔗渣(或谷殼)分別稱量，然后加入水后，攪拌均勻，裝入塑料袋中，放入高壓滅菌鍋中，121°C下蒸汽高溫滅菌50min，冷卻后備用。2.2接種在預先進行了空間滅菌的密閉房間內進行，按10-20%的接種量，將液體菌種倒入固體培養料中，攪拌均勻，裝入已經過表面消毒的密閉培養容器中(料厚度
43-4cm),蓋上蓋子，隨即轉入培養室培養。2. 3菌絲生長階段將上述裝有接種后固體培養料的密閉培養容器放入23士2°C 的培養室中，培養2-3d，待固體培養料長滿白色菌絲即可。該培養階段由于使用容器密閉培養，培養料自身濕度不會散失，所以對室內濕度無特殊的要求。2.4產孢階段去掉密閉培養容器的蓋子，將其反扣于培養室內鋪有報紙或尼龍網的培養架上，輕拍使長滿白色菌絲的固體培養料落下，鋪在培養架上，并用刀片或薄塑料片將成塊的固體培養料輕輕分割為邊長5 7cm的小方塊，然后保持培養室內溫度在 ^±2°C，繼續培養3-4天，待固體料內外長滿白色(或偏乳黃色)孢子后，將固體培養物置于陰涼通風處自然晾干即成粗粉劑(或在3(T35°C烘干箱中烘36h，含水率< 10%)。步驟1. 2中所述SDAY培養基是指薩氏培養基，具體配方為含4%葡萄糖、1%蛋白胨、1%酵母粉及洲瓊脂。步驟1.3中所述SDY培養基為SDAY培養基配方中去掉瓊脂，其它物質比例不變。步驟2. 1中所述的塑料袋為PP材質聚丙烯袋，該袋特點是可耐130°C以上的高溫， 適用于高壓滅菌。步驟2. 2中所述接種量是指液體菌種體積與固體培養料重量的比(ml g)。步驟2. 2中所述的密閉培養容器為可以重復使用的PP材質帶蓋盒子，規格為 26cmX17cmX9cm (長X寬X高)，亦可根據情況對容器大小進行定制。培養前進行表面消毒。裝入固體培養料后，需將蓋子蓋好，可保證固體培養料的水分不會散失，故此過程中對環境濕度無要求。培養溫度設定為23士2°C，不宜過高或過低。若過高，培養料發酵過程中亦會產生熱量，從而產生“燒料”現象；若溫度過低，則菌絲生長緩慢。步驟2. 4中所述刀片或薄塑料片使用前需進行表面消毒。所述將成塊的固體培養料分割，可改善固體培養料的通氣狀況，促進白僵菌產孢，從而提高產孢量。以下為本發明的幾個具體實例，進一步描述本發明，但是本發明不僅限于此。實施例一
1液體菌種的培養，包括如下步驟
1.1菌種球孢白僵菌m^CeFZOl菌株(福建林業科技，2006，33 O) :129-131.)，福建省林業科學研究院森林保護研究所保存，為公知菌株。1. 2斜面菌種預先將白僵菌菌種用試管斜面培養基在25°C條件下傳代培養、活化，當斜面表面長滿孢子時即可使用。斜面培養基為SDAY培養基。1. 3液體培養基配制SDY培養基2L，用500ml三角瓶中裝入，每個裝200ml培養基，121°C下蒸汽高溫滅菌30min，冷卻后備用。1.4接種于無菌操作臺中，從菌種斜面上挑取少量孢子及菌苔接入上述液體培
養基中。1. 5搖床培養25士 1°C恒溫振蕩培養箱中振蕩培養72h，待長成白色粘稠菌絲體后即可接入固體培養料，進行白僵菌固體培養。2固體培養，包括如下步驟
2.1固體培養料配方及制備
白僵菌固體培養料配方麥麩mcg，甘蔗渣^cg，水10L。制備方法將麥麩和甘蔗渣分別稱量，加入水后攪拌均勻，裝入塑料袋中，放入高
5壓滅菌鍋中，121°C下蒸汽高溫滅菌50min，冷卻后備用。2. 2接種在預先進行空間滅菌的密閉房間內進行，按10%的接種量，將液體菌種倒入固體培養料中，攪拌均勻，裝入預先進行過表面消毒的PP塑料盒中(培養料厚度 3-4cm),蓋上蓋子，隨即轉入培養室培養。2. 3菌絲生長階段將上述裝有接種后固體培養料的PP塑料盒放入23士2°C的培養室中培養，2天后待固體培養料長滿白色菌絲即可。培養階段由于培養容器密閉，培養料自身濕度不會散失，所以室內無濕度要求。2.4 產孢階段去掉培養容器的蓋子，將其反扣于鋪有報紙或尼龍網的培養架上，輕拍使長滿白色菌絲的固體培養料落下，鋪在培養架上，并用刀片將成塊的固體培養料輕輕分割為5 7cm左右的小方塊，然后保持培養室內溫度在^±3°C，繼續培養，4d后，待固體料內外長滿白色(或偏乳黃色)孢子即可，將固體培養物置于陰涼通風處晾干即成粗粉劑 (或在30 35°C烘干箱中烘36h，含水率< 10%)。3培養結果發酵周期為6d，晾干后隨機稱取粗粉劑5g，用0. 3%。吐溫-80溶液進行稀釋，血球計數板計數，結果培養物含孢量為2. 3 X 101°孢子/克粗粉劑。粗粉劑制作成粉炮用于林業害蟲防治。實施例二
1液體菌種的培養，包括如下步驟
1.1菌種球孢白僵菌m3SMYXTR03菌株(福建林業科技，2011，38 (2) :10_13)，福建省林業科學研究院森林保護研究所保存，為公知菌株。1. 2斜面菌種同實施例一。1. 3液體培養基同實施例一，共配制4L。1.4接種于同實施例一。1.5搖床培養同實施例一，不同的是搖床培養時間為60h。2固體培養，包括如下步驟
2.1固體培養料配方及制備
白僵菌固體培養料配方麥麩10. 7kg份，谷殼3. 5kg,水12. 4L。制備方法同實施例一。2. 2接種同實施例一，不同的是接種量為15%，。2. 3菌絲生長階段同實施例一，不同的是培養時間為3天。2. 4產孢階段同實施例一。3培養結果發酵周期為7天，晾干后隨機稱取粗粉劑5g，用0. 3%。吐溫-80溶液進行稀釋，然后用血球計數板計數，結果培養物含孢量為2. 1 X 101°孢子/克粗粉劑。粗粉劑直接用于防治林業害蟲。實施例三
1液體菌種的培養，包括如下步驟
1. 1菌種球孢白僵菌B08 (中國森林病蟲，2008，27 O) :1_3，18.)菌株，福建省林業科學研究院森林保護研究所保存，為公知菌株。1. 2斜面菌種同實施例一。1. 3液體培養基同實施例一，共配制8L。
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1.4接種于同實施例一。1.5搖床培養同實施例一，不同的是搖床培養時間為60h。2固體培養，包括如下步驟 2. 1固體培養料配方及制備
白僵菌固體培養料配方麥麩20kg份，甘蔗渣^g，水25L。制備方法同實施例一。2. 2接種同實施例一。2. 3菌絲生長階段同實施例一。2. 4產孢階段同實施例一。3培養結果發酵周期為6天，晾干后隨機稱取粗粉劑5g，用0. 3%。吐溫-80溶液進行稀釋，血球計數板計數，結果培養物含孢量為2. 8X 101°孢子/克粗粉劑。粗粉劑經過提純制成高孢粉。實施例四
1液體菌種的培養，包括如下步驟
1.1菌種球孢白僵菌Bso6菌株(福建林業科技，2006，33 O) 129-131.)，福建省林業科學研究院森林保護研究所保存，為公知菌株。1. 2斜面菌種同實施例一。1. 3液體培養基同實施例一，共配制4L。1. 4接種于同實施例一。1.5搖床培養同實施例一 2固體培養，包括如下步驟
2. 1固體培養料配方及制備
白僵菌固體培養料配方麥麩16kg份，甘蔗渣4kg，水20L。制備方法同實施例一。2. 2接種同實施例一。2. 3菌絲生長階段同實施例一，不同的是培養周期為3d。2. 4產孢階段同實施例一。3培養結果發酵周期為7d，晾干后隨機稱取粗粉劑5g，用0. 3%。吐溫-80溶液進行稀釋，用血球計數板計數，結果培養物含孢量為2. 6X 101°孢子/ g粗粉劑。粗粉劑制作成粉炮用于林業害蟲防治。
權利要求
1.一種球孢白僵菌的分階段固體培養方法，其特征在于將球孢白僵菌固體培養分為兩個階段，菌絲生長階段和產孢階段；在菌絲生長階段采用密閉式發酵，液體菌種接種固體培養料于密閉容器中進行培養；產孢階段將長滿菌絲的固體培養料扣出，采用開放式發酵。
2.根據權利要求1所述的球孢白僵菌的分階段固體培養方法，其特征在于所述的密閉容器為可重復使用的PP材質帶蓋盒子，培養前進行表面消毒。
3.根據權利要求1所述的球孢白僵菌的分階段固體培養方法，其特征在于所述菌絲生長階段的培養周期為2-3d，培養溫度設定為23士2°C。
4.根據權利要求1所述的球孢白僵菌的分階段固體培養方法，其特征在于所述產孢階段的培養周期為3-4d，培養溫度設定為^±2°C。
5.所述固體培養料的配方以重量百分比為單位，甘蔗渣或谷殼8-12%，麥麩38-4 ， 余量為水。
6.根據權利要求1所述的球孢白僵菌的分階段固體培養方法，其特征在于在產孢階段將固體培養料扣出后同時分割固體培養料，增加通氣量。
全文摘要
本發明提供了一種球孢白僵菌的分階段固體培養方法，其特征在于將球孢白僵菌固體培養分為兩個階段，菌絲生長階段和產孢階段；在菌絲生長階段采用密閉式發酵，液體菌種接種固體培養料于密閉容器中進行培養；產孢階段將長滿菌絲的固體培養料扣出，采用開放式發酵。本發明的白僵菌固體培養方法，工藝簡單，不需要復雜設備，發酵周期由同類技術的10-14d縮短到6-7d，極大地提高了生產效率，同時對環境濕度要求不高，顯著減少了雜菌污染概率，生產成本低廉，易控制，成功率高，產品質量穩定?？蓱糜趯嶒炇疑a及作為眾多中小白僵菌生產廠家技術升級的優選方案。具有顯著的社會和經濟效益。
文檔編號C12N1/14GK102286385SQ20111027780
公開日2011年12月21日 申請日期2011年9月19日 優先權日2011年9月19日
發明者何學友, 楊希, 熊瑜, 蔡守平, 黃金水 申請人:福建省林業科學研究院