專利名稱：檢測水產品中四種常見致病菌的試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種可同時快速檢測水產品中沙門氏菌(Salmonella spp.)、志賀氏菌(Shigella spp.)、金黃色葡萄球菌(Vibrio, parahaemolyticus)和副溶血性弧菌 (Staphylococcus aureus)的多重PCR試劑盒和改良型檢測方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
近幾年我國水產品消費量不斷上升，而水產品在養殖、捕撈、儲藏、加工、運輸、銷售等環節容易受到病原微生物的污染，因此病原微生物檢測是水產品及其加工品衛生檢測中的一項重要工作，其關系到消費者的健康及生命安全。其中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、 副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌被認為是重要的污染水產品的致病菌，已引起各個國家衛生檢測部門的廣泛重視。我國標準DB11/519-2008《生食水產品衛生要求》規定沙門氏菌、 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、志賀氏菌等不得檢出。嚴格的食品微生物檢驗是保障食品安全的重要環節。然而，傳統檢測方法檢測時間長，一般檢測周期在5-10天，檢測程序繁瑣，工作量大，很難適應現代化食品安全快速檢測的需要，因此亟需建立一種操作簡便、快速準確、靈敏度和特異性都較高的現代化檢測方法。分子生物學檢測技術的發展為病原微生物快速檢測提供了良好的技術平臺，如基因探針、NASBA(核酸序列依賴性擴增法)、ATP生物發光法以及PCR等技術已逐漸被研究并完善以用于病原微生物的檢測當中。其中多重PCROmiltiplex-PCR)技術不同于傳統PCR 技術只能檢測單一靶基因，其是通過在同一 PCR反應體系里加入多對特征引物，同時擴增出多個目標核酸片段的PCR反應，可用于多種病原微生物的同時快速檢測或鑒定。Germini 等根據沙門氏菌的irwA基因，單核細胞增生李斯特菌的prfA基因，大腸桿菌0157:H7的 eaeA基因以及細菌的16S rRNA基因設計引物，應用多重PCR技術對全蛋液進行測定，特異性地檢出上述菌種，靈敏度高，檢測效果穩定。國內陳偉等對肉品中的沙門氏菌、志賀氏菌及大腸桿菌0157:H7三種致病菌建立了多重PCR檢測體系，檢測靈敏度可達lCFU/ml，可在 24h內完成檢測工作，并集成了快速檢測試劑盒。然而，目前對水產品中常見的四種致病菌沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的同時共增菌方法及多重PCR快速檢測試劑盒未有報道和公開。

發明內容
本發明的目的在于提供一種用于同時檢測水產品中沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌四種常見致病菌的多重PCR快速檢測試劑盒和檢測方法，可以有效的節約檢測時間，提高檢測效率。檢測水產品中四種常見致病菌的試劑盒，包括Mg2+、dNTP、Taq酶、PCR Buffer、引物、滅菌雙蒸水，其特征在于，所述引物由以下序列組成沙門氏菌引物上游序列5，-GGT CGT CGT TGG GAC TGA TTG G-3，，下游序列 5， -CCG TGG CAT GTC TGA GCA CTT C-3'；
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志賀氏菌引物上游序列5，-GCT CGA AAC GGG CTG TGC TAA TG-3，，下游序列 5， -ACG GTA TCG GAA AGG CGG TCAA-3'；金黃色葡萄球菌引物上游序列5’-AAC GGC AAT ACG CAA AGA GG-3’、下游序列 5' -TAT ACG CTA AGC CAC GTC CAT A-3'；副溶血性弧菌引物上游序列5，-CTGATA ACA ATG ACG CCT CTG CTA AT-3，，下游序歹丨J :5，-TCT GAT ACT CAC CAA TCT GAC GGA ACT-3，。本發明根據金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因nuc、沙門氏菌的侵襲蛋白基因 invA、志賀氏菌的侵染性質粒抗原H基因ipaH、副溶血性弧菌的毒力表達調控基因toxR作為特征靶基因設計出4對特異性引物(見表1)各引物針對相應致病菌高度種內保守，種間特異基因或者毒力相關基因設計。擴增后片段長度大小各異，可通過電泳進行分開辨別。表1四種目標菌的引物序列和擴增PCR產物大小
權利要求
1.檢測水產品中四種常見致病菌的試劑盒，包括Mg2+、dNTP、Taq酶、PCRBuffer、引物、 滅菌雙蒸水，其特征在于，所述引物由以下序列組成沙門氏菌引物上游序列5’ -GGTCGTCGT TGGGACTGATTGG-3’，下游序列 5， -CCGTGGCATGTCTGAGCACTTC-3’ ；志賀氏菌引物上游序列5’ -GCTCGAAACGGGCTGTGCTAATG-3’，下游序列 5， -ACGGTATCGGAAAGGCGGTCA A-3’ ；金黃色葡萄球菌引物上游序列5’ -AACGGCAATACGCAA AGAGG-3’、下游序列 5’ -TATACGCTAAGCCACGTCCATA-3’ ；副溶血性弧菌引物上游序列5，-CTGATAACAATGACGCCTCTGCTA AT-3，，下游序列5，_TC TGATACTCACCAATCTGACGGAACT-3’。
2.檢測水產品中四種常見致病菌的方法，其特征在于包括以下步驟a)樣品增菌培養配制選擇性增菌培養液，各組分的濃度為緩沖蛋白胨水20g/L、 魚蛋白胨12 g/L、膽鹽3號3 g/L、檸檬酸鈉1.5 g/L、氯化鋰1 g/L、亞碲酸鉀1. 2 mg/L、氯化鈉15 g/L、葡萄糖2 g/L、甘露醇1 g/L、丙酮酸鈉4 g/L，調節pH值為7. 8 ；取水產品樣品加入選擇性增菌培養液中，均質1分鐘，于恒溫振蕩器中37 150 rpm培養6 h；b)提取菌液DNA;c)PCR擴增使用權利要求1所述的試劑盒對菌液DNA進行擴增，擴增反應條件如下 采用冷啟動，94°C預變性4 min，變性94°C 30 s，退火58. 1°C 1 min，延伸72°C 1 min，30 個循環，終延伸72 °C 5 min ；d)將擴增產物于瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。
全文摘要
本發明公開了一種檢測水產品中四種常見致病菌的試劑盒，包括Mg2+、dNTP、Taq酶、PCRBuffer、引物、滅菌雙蒸水。本發明還提供了檢測水產品中四種常見致病菌的方法，包括樣品增菌培養、提取菌液DNA、PCR擴增、將擴增產物于2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測等步驟。該方法在常規多重PCR檢測技術上，對該檢測方法從前增菌到PCR擴增等步驟進行了改良和優化，整合后的多重PCR快速檢測試劑盒配置便捷，易于產業化生產，檢測結果特異性強，靈敏度高。
文檔編號C12Q1/14GK102337333SQ20111027781
公開日2012年2月1日 申請日期2011年9月19日 優先權日2011年9月19日
發明者勵建榮, 朱軍莉, 翁思聰 申請人:浙江工商大學