專利名稱：一種中華鱉虹彩病毒的超分支滾環擴增檢測方法
技術領域：
本發明涉及中華鱉虹彩病毒的檢測方法，尤其是涉及一種中華鱉虹彩病毒的超分支滾環擴增檢測方法。
背景技術：
中華鱉是一種珍貴的水生爬行動物，肉味鮮美，營養豐富，具有重要的研究價值。 隨著人民生活水平的提高，市場需求量有所增加，中華鱉人工養殖業蓬勃發展。由于中華鱉的高密度集約化養殖方式，加上中華鱉商品和種苗交易頻繁，各種疾病頻繁發生，鱉病已經嚴重威脅著我國養鱉業，年經濟損失達數億元，制約了養鱉業的進一步發展。因此，疾病防治是中華鱉養殖業的重要研究方向。引起中華鱉傳染性病害的病原體主要有細菌、真菌、寄生蟲、病毒等，而且經常是幾種病原混合感染。針對前三種病原，養殖者已經有一套比較成熟的預防和治療方法。然而，病毒病的研究還處在起步階段。關于中華鱉病毒病的研究報導甚少。近年來，由病毒引起的甲魚疾病呈明顯上升趨勢，給中華鱉養殖業造成重大的經濟損失。到目前為止，在我國發現的中華鱉病毒有7種，即彈狀病毒、類呼腸孤病毒、類腺病毒、 類似核糖核酸病毒的中華鱉病毒、類似嵌杯樣病毒的中華鱉球狀病毒、中華鱉虹彩病毒，陳在賢等從中華鱉的體內分離到一株直徑為120-160nm的虹彩病毒(Soft-shelled turtle iridovirus, STIV)。病害的防控迫切需要建立快速、特異、準確的診斷技術。現行的中華鱉虹彩病毒(Soft-shelled turtle iridovirus，STIV)的檢測方法主要有血清學檢測和膠體金免疫檢測等常規診斷方法，這些方法操作繁復、檢測周期長、檢測靈敏度低；基于靶標DNA擴增的PCR技術作為成熟的分子檢測方法，已用于該病毒的檢測鑒定(范萬紅等2007)，但常規的PCR技術是對檢測靶標的擴增，增加了交叉感染的風險，以及靈敏度偏低，無法及時準確地檢測病害；而且上述檢測方法往往需要特定的設備、實驗室及分子生物學專業實驗人員操作，在實際現場操作時會有較大的局限性。超分支滾環擴增法(hyperbranched rolling circle amplification,HRCA)因其高特異性、高靈敏度、快速簡便等優點越來越多的應用于分子生物學基礎研究和實際檢測中。該技術能在短時間內(Ih)進行大量擴增，擴增倍數達到IO7(Thomas et al. 1999)，靈敏度極高，能夠檢測到單分子水平Chang et al. 2001)。HRCA技術安全、快捷、高效、高靈敏度且無設備及技術限制，具有其他技術所無法替代的優勢，HRCA技術已成為研究熱點，廣泛運用于醫藥、畜牧與獸醫，農林等領域。但很少見到HRCA在水產動物病原檢測方面的報道，本發明第一次將HRCA技術應用于STIV的檢測。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種基于超分支滾環擴增技術檢測中華鱉虹彩病毒的方法，以實現對中華鱉虹彩病毒進行快速、特異、簡便的現場檢測。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為一種中華鱉虹彩病毒的超分支滾環擴增檢測方法，包括以下步驟
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(1)鎖式探針的合成從基因庫中選取一段中華鱉虹彩病毒獨有的主衣殼蛋白 MCP (major capsid protein)(登錄號為ETO27010)基因序列，從MCP基因序列中分別選取 20個堿基作為鎖式探針5'端和3'端的特異識別區，5'末端堿基和3'末端堿基在MCP 基因序列上連續，從質粒載體pNAKl中選取一段序列，將該序列中與5'末端堿基和3'末端堿基互補的堿基替換后形成的核苷酸序列作為鎖式探針的連接段部分，然后進行鎖式探針的合成，所述的鎖式探針的核苷酸序列如下5，-CTGCGTCACTCCCGTCGTGGtggactgctgaatccgttagccagcagccgcctccttattatcact tattcaggcgtagcaccagTCCGTCGGCTCCAATTACAC-3‘ ；105(2)根據鎖式探針的連接段序列設計一對通用引物CFl和CF2，序列如下CFl 5，-CTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGA-3，，24CF2 5 ’ -GCTGAATCCGTTAGCCAGCAG-3’； 21(5)鎖式探針的連接反應連接反應體系的終濃度分別為鎖式探針分別為IOOpM-IO μΜ,ΙΟΧT4DNA LigaseBuffer 1 μ 1，樣品模板DNA 2 μ 1，加雙蒸水至反應總體積10 μ 1，連接的條件為在 94°C下變性 5min 后，再加 IU/μ 1 Τ4 DNA Ligase，在 16°C 的條件下，反應 10_60min ；(4) HRCA反應體系擴增HRCA 反應體系的終濃度分別為dNTPs 0. 4mM, CF10. 4 μ Μ, CF20. 4 μ Μ, ρΗ 8. 8deTris-HCl 20mM,KCl IOmMjMgSO4 6. 5mM, (NH4) 2S04 10mM,0. 1% Triton x_100，8U Bst DNA聚合酶大片段和連接反應產物2 μ L，加雙蒸水至反應體系總體積為25 μ L，將上述反應體系進行擴增反應，擴增反應溫度為61-65°C，擴增反應時間為10-60min ；(5) HRCA反應產物的檢測將HRCA擴增反應產物通過瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增條帶，HRCA的產物序列在長度上分布不連續，從凝膠電泳圖上看呈階梯狀分布。其中長度最小的帶為引物Fl和F2之間的距離，其后每大一級的條帶大小均在前一級條帶大小的基礎上增加一個鎖式探針的大小，通過觀察電泳條帶的亮度，即可判斷連接及HRCA反應的最適條件。如果條帶呈階梯狀分布則表示該樣品的STIV的檢測結果為陽性，反之無擴增條帶或擴增條帶為非階梯狀分布，則為陰性。步驟(3)中連接反應最適條件為在16°C的條件下，反應lOmin。步驟⑷中HRCA擴增反應最適條件為61°C反應20min。與現有技術相比，本發明的優點在于(1)超高靈敏度HRCA具有較PCR更強的擴增能力，可以在Ih內對靶序列進行IO9 的擴增，這一高靈敏度特性使其能夠在短時間內檢測到單分子水平。(2)高序列特異性基于PCR技術的檢測方法都是對靶標DNA的擴增，這增加了交叉污染的幾率，HRCA檢測方法中擴增的不是靶標DNA序列而是鎖式探針的序列，靶標DNA只為環化鎖式探針提供互補序列，從而最大限度的減少反應污染的風險。鎖式探針具有很高的特異性及單堿基錯配識別能力，利用鎖式探針檢測靶序列時，由于探針5'端與3'端的連接需要探針的兩段識別序列與靶序列完全互補，當有錯配存在時，探針的連接反應就無法完成，也就不會被擴增，因此確保了檢測中的高特異性。(3)多元性環化的鎖式探針可以通過通用引物進行擴增，通用引物可以等效率地擴增多條相異的鎖式探針，克服了 PCR等其他液相擴增方法中反應物和擴增產物的相互反應和干擾、多重PCR中引物競爭等問題，實現檢測信號的放大以及多元檢測。(4)簡單易操作HRCA核酸擴增是在等溫條件下進行的，不需要模板的熱變性、長時間溫度循環。不需要特別的熱循環儀器，可以在簡單的水浴鍋中進行。如在體系中加入 SYBR Green I熒光染料，可通過熒光變化目測判斷，使檢測更為方便。(5)快速高效滾環擴增技術是一種指數的體外核酸擴增技術，可以在Ih內對靶序列進行109倍的擴增，比常規PCR檢測節省2 4h。


圖 1 為 HRCA 法檢測 SITV 的靈敏度的電泳圖；M =GeneRuler IOObp DNA Ladder Plus ； 1、2、3、4、5、6 的樣品模板濃度(copies/μ 1)分別為 Io5UO4UO3UO2UO1UOq ；7 雙蒸水作空白對照；圖2為常規PCR法檢測STIV的靈敏的電泳圖；M :GeneRuler IOObp DNA Ladder Plus ； 1、2、3、4、5、6 的樣品模板濃度(copies/μ 1)分別為 Io5UO4UO3UO2UO1UOq ；7 雙蒸水作空白對照；圖 3 為 HRCA 法的特異性試驗電泳圖；M :GeneRuler IOObp DNA Ladder Plus ；1 中華鱉虹彩病毒；2 對蝦白斑綜合癥病毒；3 新加坡石斑魚虹彩病毒；4 梭子蟹呼腸孤病毒；5 無模板。
具體實施例方式以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。實施例11、制備SITV基因組的DNA樣品模板和標準樣品1. 1中華鱉虹彩病毒DNA的提取1. 1. 1病毒的純化將20克感染的組織剪碎，置于200mlTNE緩沖液中，8000r/min、4°C離心20min取上清。4°C下、35000g離心lh。棄上清，除沉淀黑圈及其以外的沉淀。重懸于5mlTM緩沖液中。過夜，將過夜的沉淀輕輕吹打均勻，8000r/min、4°C離心20min取上清，4°C下、35000g離心lh，所得白色沉淀即為純化病毒。1.1.2純化病毒DNA的提取用500微升TE緩沖液將病毒完全轉移至離心管中。向管中加入125微升10% SDS 使其終濃度為2%。向EP管中加入蛋白酶K，使其終濃度為lmg/mL。50°C 60°C水浴鍋 1 2h，間歇震蕩。向其中加入等體積的飽和酚翻轉30min，4°C、12000rpm、20min。取上層水樣，加入新的EP管中，加入等體積的酚氯仿異戊醇05 24 1)混勻15min，4(TC、 12000rpm、15min。取上清，加入等體積氯仿異戊醇(24 1)混勻15min，4°C、12000rpm、 15min。取上清，加入1/10體積的3M的NaAc和2倍體積預冷的無水乙醇(_20°C冰箱中) 放于_20°C冰箱，沉淀過夜。將過夜處理的溶液4°C、lOOOOrpm, 15min離心。加入75%酒精， 洗滌兩次，除去鹽離子，室溫放置直至酒精無味。用20 μ 1純水溶解_20°C保存備用。1.2標準樣品的制備
以上述提取的STIV基因組DNA為樣品模板，用引物STIV-F(+)/STIV-R進行PCR 擴增，PCR 擴增反應為 25 μ L 體系，包含 IOmM Tris-HCl (pH 8. 3), 50mM KCl, 1. 5mM MgCl2, 0. 8mM dNTPs，0. 2μΜ 引物 STIV_F(+)，0. 2 μ M 引物 STIV-R, STIV 基因組 DNA L 0μ L，5U/ μ L rTaq DNA聚合酶；反應經94°C預變性^iin后，循環擴增30次94°C變性30s，55°C復性30s，72°C反應1. 5min，循環結束后72°C延伸反應IOmin ；擴增產物經(w/v)瓊脂糖凝膠電泳分離后，預期大小的擴增條帶用QIAquick Gel Extraction純化回收，通過分光光度計測定，將所得PCR產物定量后進行梯度稀釋作為標準品。2、中華鱉虹彩病毒的超分支滾環擴增檢測方法2. 1材料和方法2. 1.1 材料Bst DNA聚合酶大片段(含IOX緩沖液)購自New England Biolabs公司，dNTPs、 rTaq DNA 聚合酶、T4DNA Ligase (含 IOX 緩沖液)、GeneRuler IOObp DNA Ladder Plus 購自TaKaRa公司，鎖式探針和通用引物CF1/CF2由上海英俊生物技術有限公司。2. 1. 2 方法(1)鎖式探針的合成從基因庫中選取一段中華鱉虹彩病毒獨有的主衣殼蛋白 MCP (major capsid protein)(登錄號為ETO27010)基因序列，從MCP基因序列中分別選取 20個堿基作為鎖式探針5'端和3'端的特異識別區，5'末端堿基和3'末端堿基在MCP 基因序列上連續，鎖式探針5'端和3'端各有20個堿基在靶DNA上緊鄰并完全互補配對， 從質粒載體pNAKl中選取一段序列，將該序列中與5'末端堿基和3'末端堿基互補的堿基替換后形成的核苷酸序列作為鎖式探針的連接段部分，然后進行鎖式探針的合成，該鎖式探針的核苷酸序列如下5，-CTGCGTCACTCCCGTCGTGGtggactgctgaatccgttagccagcagccgcctccttattatcact t attcaggcgtagcaccagTCCGTCGGCTCCAATTACAC-3，；105(2)根據鎖式探針的連接段序列設計一對通用引物CFl和CF2，序列如下CFl 5 ’ -CTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGA-3’，24CF2 :5，-GCTGAATCCGTTAGCCAGCAG-3，；21(3)鎖式探針的連接反應連接反應體系的終濃度分別為鎖式探針分別為ΙΟΟρΜ，10 X T4DNA Ligase Buffer 1 μ 1，去上述方法制備的樣品模板DNA 2 μ 1，加雙蒸水水至反應總體積10 μ 1，連接的條件為在94°C下變性5min后，再加lU/μ 1 T4 DNA Ligase，在16°C的條件下，反應 IOmin ； (4) HRCA反應體系擴增HRCA 反應體系的終濃度分別為dNTPs 0. 4mM, CFl 0. 4 μ Μ, CF20. 4 μ Μ, pH 8. 8de Tris-HCl 20mM, KCl IOmMjMgSO4 6. 5mM, (NH4)2SCM 10mM,0. 1% Triton x_100，8U Bst DNA 聚合酶大片段和連接反應產物2 μ L，加雙蒸水至反應體系總體積為25 μ L，將上述反應體系進行擴增反應，擴增反應溫度為61°C，擴增反應時間為20min ；(5) HRCA反應產物的檢測將HRCA擴增反應產物通過瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增條帶，HRCA的產物序列在長度上分布不連續，從凝膠電泳圖上看呈階梯狀分布。其中長度最小的帶為引物Fl和F2之
6間的距離，其后每大一級的條帶大小均在前一級條帶大小的基礎上增加一個鎖式探針的大小，通過觀察電泳條帶的亮度，即可判斷連接及HRCA反應的最適條件。如果條帶呈階梯狀分布則表示該樣品的STIV的檢測結果為陽性，反之無擴增條帶或擴增條帶為非階梯狀分布，則為陰性。除上述實施例1外，鎖式探針還可以為1ηΜ，10ηΜ，100ηΜ，1μΜ，10μΜ，鎖式探針的連接反應的時間還可以為20min、30min、40min、50min、60min，HRCA反應體系擴增反應的溫度還可以為62°C、63°C、64°C、65°C，擴增反應的時間還可以10min、30min、40min、50min、 60mino實施例2本發明基于HRCA技術檢測STIV方法的靈敏度測定1、標準品的制備用分光光度計測定提取的DNA樣品的濃度，稀釋到IOltlc0Pies/ μ L作為標準品。取制備好的標準品稀釋到10°-105COpieS/yL分別作為模板。2、使用實施例1得出的最適條件法對各濃度的模板進行檢測，從而得出本發明的靈敏度，另外進行常規PCR檢測，進行靈敏度比對。2. 1鎖式探針的連接連接反應體系如下鎖式探針0. 1 μ M，T4DNA Ligase IU/μ 1，10XT4DNA Ligase Buffer 1 μ 1，樣品模板DNA 2 μ 1，加水至反應總體積10 μ 1，連接的條件為在94°C下變性 5min后，再加IU/μ 1 Τ4 DNA Ligase，在16°C的條件下，反應10，連接反應液待用。2. 2HRCA 反應反應體系的終濃度分另U為dNIPs 0. 4mM, CFl 0. 4 μ Μ, CF20. 4μΜ, Tris-HCl (ρΗ8. 8) 20mM, KCl 1 OmM，MgSO4 6. 5mM, (MM)2SO4 10mM,0. 1% Triton x_100，8U Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs)和2 μ L連接產物，加雙蒸水使反應體系總體積為25yL。反應條件為61°C，20min。2. 3PCR 反應PCR 反應為 25 μ L 體系，包含 IOmM Tris-HCl(pH 8. 3), 50mM KCl, 1. 5mM MgCl2, 0. 8mM (1^1^，0.2口]\1引物511￥-卩(+)，0.2口]\1引物511￥-1 ，511￥基因組0嫩 1. 0μ L,5U/y L rTaq DNA聚合酶；反應經94°C預變性^iin后，循環擴增30次94°C變性30s，55°C復性30s， 72°C反應1. 5min，循環結束后72°C延伸反應lOmin，其中PCR引物對為STIV-F/STIV-R(擴增序列為926bp)序列如下STIV-F 5' -TTTGTCAAGGAGCACTACCC-3’STIV-R 5' -ACGGGATCTACCGCAAGG-3，；檢測結果表明，HRCA法所能檢測到的最低模板量接近IO1C0Py,而常規PCR的檢測下限為103。因此，由靈敏度實驗得出，HRCA法的靈敏度比常規PCR法具有更高的靈敏度， 結果如圖1、圖2所示。實施例3本發明基于滾環擴增技術檢測STIV方法的特異性測定以STIV基因組DNA作為陽性對照，另取3種不同相關度的病毒進行本研究的特異性驗證，即對蝦白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus，WSSV)、新加坡石斑魚虹彩病毒(Singapore grouperiridovirus, SGIV)和梭子蟹呼腸孤病毒，其中雙蒸水作為陰性對照。擴增產物分別通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果顯示見圖3，說明本發明提供的HRCA檢測方法能保證對STIV的特異性檢測，并不與其他相關病毒發生交叉反應。
上述實施例是對本發明的詳細說明，本發明的保護范圍不限于上述實施方式所述的技術方案，而應以權利要求所述的保護范圍為準。
權利要求
1.一種中華鱉虹彩病毒的超分支滾環擴增檢測方法，其特征在于包括以下步驟(1)鎖式探針的合成從基因庫中選取一段中華鱉虹彩病毒獨有的主衣殼蛋白MCP基因序列，從MCP基因序列中分別選取20個堿基作為鎖式探針5'端和3'端的特異識別區， 5'末端堿基和3'末端堿基在MCP基因序列上連續，從質粒載體pNAKl中選取一段序列，將該序列中與5'末端堿基和3'末端堿基互補的堿基替換后形成的核苷酸序列作為鎖式探針的連接段部分，然后進行鎖式探針的合成，所述的鎖式探針的核苷酸序列如下5' -CTGCGTCACTCCCGTCGTGGtggactgctgaatccgttagccagcagccgcctccttattatcacttatt caggcgtagcaccagTCCGTCGGCTCCAATTACAC-3‘ ；105(2)根據鎖式探針的連接段序列設計一對通用引物CFl和CF2，序列如下CFl 5' -CTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGA-3',24CF2 5' -GCTGAATCCGTTAGCCAGCAG-3‘ ；21(5)鎖式探針的連接反應連接反應體系的終濃度分別為鎖式探針分別為100ρΜ-10μΜ，10ΧΤ4 DNA Ligase Buffer 1 μ 1，樣品模板DNA 2 μ 1，加雙蒸水至反應總體積10μ 1，連接的條件為在94°C下變性5min后，再加IU/μ 1 Τ4 DNA Ligase，在16°C的條件下，反應10_60min ；(4)HRCA反應體系擴增HRCA 反應體系的終濃度分別為dNTPs 0. 4mM, CFl 0. 4 μ Μ, CF2 0. 4 μ Μ, ρΗ 8. 8de Tris-HCl 20mM, KCl IOmMjMgSO4 6. 5mM, (NH4) 2S04 10mM,0. 1% Triton x_100，8U Bst DNA 聚合酶大片段和連接反應產物2 μ L，加雙蒸水至反應體系總體積為25 μ L，將上述反應體系進行擴增反應，擴增反應溫度為61-65°C，擴增反應時間為10-60min ；(5)HRCA反應產物的檢測將HRCA擴增反應產物通過瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增條帶，如果條帶呈階梯狀分布則表示該樣品的STIV的檢測結果為陽性，反之無擴增條帶或擴增條帶為非階梯狀分布，則為陰性。
2.根據權利要求1所述的一種中華鱉虹彩病毒的超分支滾環擴增檢測方法，其特征在于步驟(3)中連接反應最適條件為在16°C的條件下，反應lOmin。
3.根據權利要求1所述的一種中華鱉虹彩病毒的超分支滾環擴增檢測方法，其特征在于步驟中HRCA擴增反應最適條件為61°C反應20min。
全文摘要
本發明公開了一種中華鱉虹彩病毒的超分支滾環擴增檢測方法，特點是包括以下步驟(1)設計1條鎖式探針和1對針對鎖式探針連接序列的通用引物；(2)配制鎖式探針連接反應體系，進行連接反應；(3)配制HRCA反應體系，進行HRCA擴增反應，最后對HRCA反應產物進行檢測，優點是具有比現有技術的PCR檢測中華鱉虹彩病毒的方法具有更高的靈敏度、特異性和便捷性，并且簡單易操作，檢測方法快速高效，比常規PCR檢測節省2-4h。
文檔編號C12Q1/70GK102329892SQ20111028235
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月22日 優先權日2011年9月22日
發明者劉聯國, 周永強, 彭嬌, 李民云, 李登峰, 王忠平, 王洪強, 陳炯 申請人:寧波大學