專利名稱：檢測THRA基因三種mRNA亞型的引物及所用試劑盒的制作方法
檢測THRA基因三種mRNA亞型的引物及所用試劑盒技術領域
本發明涉及生物實驗技術和醫學診斷技術領域，特別是涉及THRA基因檢測領域的用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的引物及所用試劑盒。
背景技術：
THRA 基因(thyr ·oid hormone receptor α )即甲狀腺激素受:體 α,于 I988 年由 Debuire B.克隆成功。THRA基因由457個腺嘌呤、635個胞嘧啶、637個鳥嘌呤、83個胸腺嘧啶組成，位于人類染色體17qll. 2位置。THRA基因編碼的蛋白是甲狀腺激素受體，它是甲狀腺激素的幾個受體之一，能夠調節甲狀腺激素的生物活性。近年來研究發現，THRA基因與多種疾病相關聯。2011年研究發現，THRA基因與乳腺癌相關。甲狀腺受體基因的突變和基因表達的改變會導致癌癥的發生，Guigon等研究發現，新型的非基因組甲狀腺激素受體基因的突變導致甲狀腺癌變。2011年，Goumidi L等人研究了 THRA基因多態性與之間的關聯，它編碼T3核受體TRa I。SNP標記rs939348 TT基因型對阿爾茨海默氏病(AD)存在高風險。甲狀腺激素對聽力的發展有著至關重要的作用。2001年，Rusch等人研究發現， 發病早期甲狀腺功能減退引起耳聾，說明甲狀腺激素對聽力的發展至關重要。同年，Lily 等人發現，甲狀腺激素受體基因的突變抑制了耳聾和甲狀腺發育不全。1998年，Williams 研究發現等THRA基因在視網膜發育過程中表達，影響視網膜細胞的生長和增殖。1997年， Sourvinos G等人檢測I 42個成對乳腺癌外周血DNA樣本，發現24個腫瘤(57%)表現出遺傳變異，而標記基因THRAl是抑癌基因的一個有力候選基因。因此，對THRA基因的分析和篩查有助于多種疾病的診斷和檢查。
PCR (polymerase chain reaction,聚合酶鏈式反應)因其靈敏度高,特異性強， 檢測簡便、快速，已成為一種成熟技術成為分子生物學研究的關鍵技術。該技術廣泛應用于生物科學的各領域實驗中。在PCR實驗中，要擴增模板DNA，首先要設計引物，引物是決定 PCR擴增片段長度、位置和結果的關鍵，引物與模板的結合及引物鏈的延伸都遵循堿基配對原則的。PCR擴增完成之后，再對PCR產物進行進一步的分析。
THRA的外顯子有三種形式，以往針對THRA基因的檢查需要分別對三種外顯子進行獨立的實驗過程。容易交叉重復干擾，實驗過程相對復雜。
PCR過程由高溫變性、低溫復性和一定溫度下延伸三個步驟循環構成。所以在PCR 實驗中，對溫度的控制非常重要。
在常規的PCR實驗中，通常是將DNA樣本、引物等試劑根據要求放置于普通384孔或96孔塑料基板內，在基板的表層附上一層透明的塑料膜，以封閉溶液體系。在PCR實驗平臺的往復溫度變化后，通過普通光源或激光透過塑料膜進行分析。
在PCR實驗中一般要求DNA樣本溫度隨著PCR的溫度同時變化，PCR反應中，從高溫到低溫或從低溫到高溫的溫度變化靈敏性越高越好。在普通塑料基板上，由于塑料本身在溫度傳遞上有一定的延遲，而且也會吸收一定的熱能，導致溶液體系的溫度與理想溫度有一定誤差。另外在通過光源分析時，由于基板的變形及塑料膜本身透光率的問題，導致反應結果出現一定的系統誤差。并且當實驗的樣本量不是很大的情況下，在普通的384孔或 96孔板的基板上，一旦附上塑料膜，對區別已加樣的孔和沒加樣的孔需要仔細辨認，加大了實驗者的工作量和工作強度。發明內容
本發明的目的是提供可以在一次檢測實驗過程中對THRA基因三種亞型進行分別獨立擴增的引物及用于THRA基因三種亞型檢測的試劑盒，該引物大大地提高實驗效率，避免交叉重復干擾，減少工作量，縮短檢測實驗的時間過程；該試劑盒能增加溶液體系的溫度敏感性和光透率，實現溶液體系的溫度隨PCR儀器的溫度變化同步迅速變化。
為達到上述目的，本發明的技術方案是一種檢測THRA基因三種mRNA亞型的引物，包括共用引物和THRA-1、THRA-2、THRA_3共 4條引物。
其中，所述共用引物的序列是CTTCGAGCACTACGTCAACCA。
其中，所述THRA-1 引物的序列是 GCTACAGAATCGAACTCTGCACT。
其中，所述THRA-2 引物的序列是 GACCTGCGGACCCTTCAT。
其中，所述THRA-3 引物的序列是 CGATCATGCGGAGGTCAGT。
本發明還提供一種用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的試劑盒，所述試劑盒包括包括基板和設于所述基板上面的表面覆膜，所述表面覆膜上設有有穴坑，所述穴坑內設有反應體系,所述反應體系含有根據權利要求1至5任一所述的用于檢測THRA基因三種mRNA 亞型的引物。
優選的，所述穴坑設有凸沿。
優選的，所述凸沿與所述表面覆膜一體成型。
優選的，所述基板采用親水性、耐腐蝕、高溫下不易變形的透明材料。
優選的，所述基板采用硼硅酸鹽超薄玻璃材料。
優選的，所述表面覆膜采用耐高溫、變形率小的材料。
優選的，所述表面覆膜采用有機硅塑料為材料。
優選的，所述表面覆膜與所述基板接觸的一面設有熱熔粘合劑。
優選的，所述反應體系上面設有用于封閉所述反應體系的封閉層。
優選的，所述封閉層為石蠟。
本發明的技術方案中，共用引物的堿基序列是CTTCGAGCACTACGTCAACCA。 THRA-1引物的堿基序列是GCTACAGAATCGAACTCTGCACT。 THRA-2引物的堿基序列是 GACCTGCGGACCCTTCAT ο THRA-3 引物的堿基序列是 CGATCATGCGGAGGTCAGT。
THRA基因有三種亞型，這三種亞型非常相似，其幾個外顯子分別有三種形式。
第一種為CTGCCTTGCGAAGACCAGATCATCCTCCTGAAGGGGTGCTGCATGGAGATCATGTCCCTGCGGGCGGCTGTCCGCTACGACCCTGAGAGCGACACCCTGACGCTGAGTGGGGAGATGGCTGTCAAGCGGGAGCAGCTCAAGAATGGCGGCCTGGGCGTAGTCTCCGACGCCATCTTTGAACTGGGCAAGTCACTCTCTGCCTTTAACCTGGATGACACGGAAGTGGCTCTGCTGCAGGCTGTGCTGCTAATGTCAACAGACCGCTCGGGCCTGCTGTGTGTGGACAAGATCGAGAAGAGTCAGGAGGCGTACCTGCTGGCGTTCGAGCACTACGTCAACCACCGCAAACACAACATTCCGCACTTCTGGCCCAAGCTGCTGATGAAGGAGAGAGAAGTGCAGAGTTCGATTCTGTACAAGGGGGCAGCGGCAGAAGGCCGGCCGGGCGGGTCACTGGGCGTCCACCCGGAAGGACAGCAGCTTCTCGGAATGCATGTTGTTCAGGGTCCGCAGGTCCGGCAGCTTGAGCAGCAGCTTGGTGAAGCGGGAAGTCTCCAAGGGCCGGTTCTTCAGCACCAGAGCCCGAAGAGCCCGCAGCAGCGTCTCCTGGAGCTGCTCCACCGAAGCGGAATTCTCCATGCCCGAGCGGTCTGTGGGGAAGACGACAGCAGTGAGGCGGACTCCCCGAGCTCCTCTGAGGAGGAACCGGAGGTCTGCGAGGACCTGGCAGGCAATGCAGCCTCTCCCTGAAGCCCCCCAGAAGGCCGATGGGGAAGGAGAAGGAGTGCCATACCTTCTCCCAGGCCTCTGCCCCAAGAGCAGGAGGTGCCTGAAAGCTGGGAGCGTGGGCTCAGCAGGGCTGGTCACCTCCCATCCCGTAAGACCACCTTCCCTTCCTCAGCAGGCCAAACATGGCCAGACTCCCTTGCTTTTTGCTGTGTAGTTCCCTCTGCCTGGGATGCCCTTCCCCCTTTCTCTGCCTGGCAACATCTTACTTGTCCTTTGAGGCCCCAACTCAAGTGTCACCTCCTTCCCCAGCTCCCCCAGGCAGAAATAGTTGTCTGTGCTTCCTTGGTTCATGCTTCTACTGTGACACTTATCTCACTGTTTTATAATTAGTCGGGCATGAGTCTGTTTCCCAAGCTAGACTGTGTCTGAATCATGTCTGTATCCCCAGTGCCCGGTGCAGGGCCTGGCATAGAGTAGGTACTCCATAAAAGGTGTGTTGAATTGAA第二種為CTGCCTTGCGAAGACCAGATCATCCTCCTGAAGGGGTGCTGCATGGAGATCATGTCCCTGCGGGCGGCTGTC CGCTACGACCCTGAGAGCGACACCCTGACGCTGAGTGGGGAGATGGCTGTCAAGCGGGAGCAGCTCAAGAATGGCGG CCTGGGCGTAGTCTCCGACGCCATCTTTGAACTGGGCAAGTCACTCTCTGCCTTTAACCTGGATGACACGGAAGTGG CTCTGCTGCAGGCTGTGCTGCTAATGTCAACAGACCGCTCGGGCCTGCTGTGTGTGGACAAGATCGAGAAGAGTCAG GAGGCGTACCTGCTGGCGTTCGAGCACTACGTCAACCACCGCAAACACAACATTCCGCACTTCTGGCCCAAGCTGCT GATGAAGGGTCCGCAGGTCCGGCAGCTTGAGCAGCAGCTTGGTGAAGCGGGAAGTCTCCAAGGGCCGGTTCTTCAGC ACCAGAGCCCGAAGAGCCCGCAGCAGCGTCTCCTGGAGCTGCTCCACCGAAGCGGAATTCTCCATGCCCGAGCGGTC TGTGGGGAAGACGACAGCAGTGAGGCGGACTCCCCGAGCTCCTCTGAGGAGGAACCGGAGGTCTGCGAGGACCTGGC AGGCAATGCAGCCTCTCCCTGAAGCCCCCCAGAAGGCCGATGGGGAAGGAGAAGGAGTGCCATACCTTCTCCCAGGC CTCTGCCCCAAGAGCAGGAGGTGCCTGAAAGCTGGGAGCGTGGGCTCAGCAGGGCTGGTCACCTCCCATCCCGTAAG ACCACCTTCCCTTCCTCAGCAGGCCAAACATGGCCAGACTCCCTTGCTTTTTGCTGTGTAGTTCCCTCTGCCTGGGA TGCCCTTCCCCCTTTCTCTGCCTGGCAACATCTTACTTGTCCTTTGAGGCCCCAACTCAAGTGTCACCTCCTTCCCC AGCTCCCCCAGGCAGAAATAGTTGTCTGTGCTTCCTTGGTTCATGCTTCTACTGTGACACTTATCTCACTGTTTTAT AATTAGTCGGGCATGAGTCTGTTTCCCAAGCTAGACTGTGTCTGAATCATGTCTGTATCCCCAGTGCCCGGTGCAGG GCCTGGCATAGAGTAGGTACTCCATAAAAGGTGTGTTGAATTGAA 第二種為CTGCCTTGCGAAGACCAGATCATCCTCCTGAAGGGGTGCTGCATGGAGATCATGTCCCTGCGGGCGGCTGTCCGCTACGACCCTGAGAGCGACACCCTGACGCTGAGTGGGGAGATGGCTGTCAAGCGGGAGCAGCTCAAGAATGGCGGCCTGGGCGTAGTCTCCGACGCCATCTTTGAACTGGGCAAGTCACTCTCTGCCTTTAACCTGGATGACACGGAAGTGGCTCTGCTGCAGGCTGTGCTGCTAATGTCAACAGACCGCTCGGGCCTGCTGTGTGTGGACAAGATCGAGAAGAGTCAGGAGGCGTACCTGCTGGCGTTCGAGCACTACGTCAACCACCGCAAACACAACATTCCGCACTTCTGGCCCAAGCTGCTGATGAAGGTGACTGACCTCCGCATGATCGGGGCCTGCCACGCCAGCCGCTTCCTCCACATGAAAGTCGAGTGCCCCACCGAACTCTTCCCCCCACTCTTCCTCGAGGTCTTTGAGGATCAGGAAGTCTAAAGCCTCAGGCGGCCAGAGGGTGTGCGGAGCTGGTGGGGAGGAGCCTGGAGAGAAGGGGCAGAGCTGGGGGCTGAGGGAGACCCCCCCACACCCCTTCTCTCCTTCCTCTCGTCCTTGGATAGATTCAGCTCCCACACACACACCCGCACTGCCCAGGTCCCTCCTCAGACCTCCAGCCCTGGGACAGGGCAAACAACTGAACTTGCTATGGAAAGGACAGTGTGGGAGGCTGGGGGAGCTGTGTCCTGCAGTTCCCAGGACCCCATCCTCTCAGAAGGTAGGGGAAGGGCGGGAGGATTGAGAAGGGACAAGCCACCTTGACCGTAGGGGAAGGAGGAATGTGGGCTGGGGGAAGATGCCCTCAACTCACCCCCTACACACACATGAGAGAGAGCCCCCACCCAGTTCCTTGGCCTAGGTCTCCCCTCCAGGCTGAGGGCCTCTCTACTTCCCCAGATGCCTGGGTGCAAAGAACGGCTTGGCTTGGCTCCTCCTCTGGAGGTTAAAATTTATAGTCATTCTAACTGCACTTTGGAAACCAAGCAAGGGGAGAAGACAAATGAAGAAAAACTAGACAGAGA這三種外顯子都有相同的部分
權利要求
1.一種檢測THRA基因三種mRNA亞型的引物，其特征在于，包括共用引物和THRA-1、THRA-2、THRA-3 共 4 條引物。
2.根據權利要求1所述的檢測THRA基因三種mRNA亞型的引物，其特征在于，所述共用引物的序列是 CTTCGAGCACTACGTCAACCA。
3.根據權利要求1所述的檢測THRA基因三種mRNA亞型的引物，其特征在于，所述THRA-1 引物的序列是 GCTACAGAATCGAACTCTGCACT。
4.根據權利要求1所述的檢測THRA基因三種mRNA亞型的引物，其特征在于，所述THRA-2 引物的序列是 GACCTGCGGACCCTTCAT。
5.根據權利要求1所述的檢測THRA基因三種mRNA亞型的引物，其特征在于，所述THRA-3 引物的序列是 CGATCATGCGGAGGTCAGT。
6.一種用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括包括基板和設于所述基板上面的表面覆膜，所述表面覆膜上設有有穴坑，所述穴坑內設有反應體系，所述反應體系含有根據權利要求1至5任一所述的用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的引物。
7.根據權利要求6所述的用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的試劑盒，其特征在于，所述穴坑設有凸沿。
8.根據權利要求7所述的用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的試劑盒，其特征在于，所述凸沿與所述表面覆膜一體成型。
9.根據權利要求6到8任一所述的用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的試劑盒，其特征在于，所述基板采用親水性、耐腐蝕、高溫下不易變形的透明材料。
10.根據權利要求9所述的用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的試劑盒，其特征在于，所述基板采用硼硅酸鹽超薄玻璃材料。
11.根據權利要求6到8任一所述的用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的試劑盒，其特征在于，所述表面覆膜采用耐高溫、變形率小的材料。
12.根據權利要求11所述的用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的試劑盒，其特征在于，所述表面覆膜采用有機硅塑料為材料。
13.根據權利要求6到8任一所述的用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的試劑盒，其特征在于，所述表面覆膜與所述基板接觸的一面設有熱熔粘合劑。
14.根據權利要求6到8任一所述的用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的試劑盒，其特征在于，所述反應體系上面設有用于封閉所述反應體系的封閉層。
15.根據權利要求9所述的用于檢測THRA基因三種mRNA亞型的試劑盒，其特征在于，所述封閉層為石蠟。
全文摘要
本發明公開了檢測THRA基因三種mRNA亞型的引物及用于檢測檢測THRA基因三種mRNA亞型的試劑盒。包括THRA共用引物和THRA-1、THRA-2、THRA-3共4條引物，通過PCR擴增和凝膠電泳，能夠實現在一次檢測實驗過程中對THRA基因的三種亞型mRNA基因進行分別獨立擴增，提高了實驗效率，避免交叉重復干擾，減少工作量，縮短檢測實驗的時間過程，也降低了實驗成本。還包括一種試劑盒，有基板和表面覆膜，能增加溶液體系的溫度敏感性和光透率，實現溶液體系的溫度隨PCR儀器的溫度變化同步迅速變化。
文檔編號C12Q1/68GK103014140SQ20111028591
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月23日 優先權日2011年9月23日
發明者邵敏華, 黃迅威, 沈玲宇 申請人:上海熙洛生物技術有限公司