專利名稱：擬南芥脫水應答原件結合蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，特別涉及一種擬南芥(Arabidopsis thaliana)脫水應答原件結合蛋白及其編碼基因與應用，具體涉及一個擬南芥中脫水應答原件結合蛋白2A 基因(AtDREB2A)的克隆、重組及應用。
背景技術：
植物總是直接生活在復雜多變的自然環境中。干旱、鹽堿、寒冷及高溫等逆境會使植物受到生理傷害，嚴重時甚至導致植物死亡。為了適應這些逆境，植物在漫長的的進化過程中演化出了對這些非生物脅迫的抗性機制，例如氣孔關閉、細胞膜及胞質成分的改變等。植物在非生物脅迫的作用下，能夠通過信號傳導途徑，使一些基因的表達受逆境調控， 從而對脅迫作出應答(Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki，1996)。轉錄因子是一類能夠特異地結合于特定DNA區，并對其下游基因的轉錄有激活或抑制作用的蛋白質。植物中的轉錄因子起著調控逆境脅迫應答，病原反應以及發育等相關基因表達的作用。其中的CBF/ DREB (C-repeat-binding-factor/dehydration-responsive-element-binding)轉錄因子是植物非生物脅迫應答的重要成分，誘導表達后，可以激活許多下游抗逆基因的表達，從而增強植株的抗逆性。自從1997年，Stocking等人用酵母一元雜交的方法從擬南芥中分離了一個 DRE/CRT結合蛋白CBFl以來(Stockinger et al. 1997)，已經到了許多DREB相關基因 (DREB-Iike)，這些基因產物能夠結合啟動子區的DRE/CRT元件，以啟動一序列非生物抗性基因的表達，并賦予植物耐鹽、干旱、寒冷、高溫等能力。(Gilmour et al. 1998 ；Liu et al. 1998 ；Shinwari et al. 1998)。一般認為，與植物抗病機制不同，植物對干旱和高鹽等逆境的抗性受多基因控制， 因此，利用基因工程技術導入單個功能基因很難大幅度地提高植物的抗逆性。而信號調控途徑中的上游基因，如轉錄因子則能夠基因啟動子區域的順式作用元件特異性結合，在誘導下游抗逆相關的功能基因表達中起到關鍵作用，因此利用轉錄因子增強植物抗逆性成為改良植物抗逆性的重要途徑。在抗鹽基因工程領域，DREB-直備受關注，研究者們通過轉基因手段DREB導入植物基因組中，得到了許多抗性增強的轉基因品種。DREB2A基因是DREB基因家族的成員，它的全cDNA序列與35S啟動子相連轉入擬南芥，發現在非脅迫條件下DREB2A能夠表達，但下游基因表達微弱，植株抗性沒有得到明顯提高，推測DREB2A需要經過轉錄后加工比如磷酸化等。生物信息學分析表明，DREB2A蛋白的136-165位氨基酸殘基富含泛素化位點，這些位點的存在，使得該蛋白進入降解途徑， 因而不能長期穩定存在，發揮功能。這也許是植物體內存在的對這個蛋白的負調控機制。在國內，周淼平等人將擬南芥DREB2A與bar基因同時導入小麥，測定了共轉化頻率，但并未對轉基因小麥的抗鹽性做出評估。我們通過折疊延伸PCR的方法將DREB2A中第136-165位氨基酸刪除，得到組成型激活的DREB2A-CA。通過農桿菌介導的轉基因方法，在轉基因煙草中驗證其功能。發現該基因能夠有效地提高植物的抗鹽，抗旱，抗高溫能力。
發明內容
本發明的目的在于提供一種擬南芥來源的脫水應答原件結合蛋白2A組成型激活 (constitutive activation/CA) (AtDREB2A-CA)。本發明的第二個目的是提供該重組基因編碼的蛋白質。本發明的再一個目的還在于提供含有該重組基因的重組載體和宿主細胞。本發明的另一個目的在于提供該基因的用途。本發明提供了一種擬南芥脫水應答原件結合蛋白2A組成型激活基因 (AtDREB2A-CA)，如序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列構成。本發明提供了一種上述擬南芥脫水應答原件結合蛋白2A組成型激活基因 (AtDREB2A-CA)編碼的蛋白質，如序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的蛋白質。本發明提供了一種上述擬南芥脫水應答原件結合蛋白2A組成型激活基因 (AtDREB2A-CA)重組克隆載體 pBS-T_AtDREB2A_CA。含有上述的擬南芥脫水應答原件結合蛋白2A組成型激活基因(AtDREB2A_CA)的重組載體，這些重組載體包括質粒和植物表達載體。所述的重組植物表達載體pH7m24GW，3-Prd29A-DREB2A_CA。含有上述擬南芥脫水應答原件結合蛋白2A組成型激活基因(AtDREB2A-CA)完整編碼閱讀框序列的宿主細胞，如含有上述重組載體的宿主細胞也屬于本發明的保護范圍。所述的宿主細胞選自大腸桿菌細胞、農桿菌細胞或煙草細胞。本發明提供了一種含有AtDREB2A_CA的基因工程菌。上述擬南芥脫水應答原件結合蛋白2A組成型激活基因(AtDREB2A_CA)的應用包括該基因編碼的蛋白在植物中的應用；用所述的重組載體，如植物表達載體轉化玉米細胞； 或者用所述含有該基因的農桿菌與玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、馬鈴薯、棉花、谷子、大麥以及花卉和蔬菜等細胞共培養，得到轉基因的再生植株；或者用所述的AtDREB2A-CA遺傳轉化獲得上述物種轉基因植株。本發明的技術方案具體概述如下一種擬南芥脫水應答原件結合蛋白2A組成型激活基因(AtDREB2A_CA)，如序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，還包括SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的70%以上同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。一種含有擬南芥脫水應答原件結合蛋白2A組成型激活基因(AtDREB2A_CA)重組載體 pH7m24GW，3-Prd29A-DREB2A_CA 的農桿菌 C58。一種擬南芥脫水應答原件結合蛋白2A組成型激活基因(AtDREB2A_CA)編碼的蛋白，如序列表中SEQ ID N0. 2所示氨基酸序列。一種擬南芥脫水應答原件結合蛋白2A組成型激活基因(AtDREB2A_CA)編碼的蛋白在煙草，玉米和大豆中的應用。所述的擬南芥脫水應答原件結合蛋白2A組成型激活基因(AtDREB2A_CA)還應用于制備轉基因大豆、水稻、花生、向日葵、馬鈴薯、棉花、谷子、大麥以及花卉和蔬菜等植株。本發明的克隆方法由下述步驟組成從擬南芥葉片中提取總RNA，根據GenBank中擬南芥脫水應答原件結合蛋白 2A(AtDREB2A)的天然序列，設計由SEQ ID N0. 3所示的上游引物P1，和由SEQ ID N0. 4所示的下游引物P2，克隆得到AtDREB2A基因，將此基因連接PBS-TII載體。得到中間載體 PBS-TII-AtDREB2A然后利用折疊延伸PCR(SOE-PCR)方法擴增得到擬南芥脫水應答原件結合蛋白2A組成型激活基因(AtDREB2A-CA)。本發明構建含擬南芥脫水應答原件結合蛋白2A組成型激活基因的植物表達載體 pH7m24GW，3-Prd29A-DREB2A-CA，由下述步驟組成設計由SEQ ID NO. 5所示的上游引物F1，和由SEQ ID NO. 6所示的下游引物Rl， 以PBS-TII-AtDREB2A為模板，進行PCR擴增，得到第一個PCR片段。再用SEQ ID NO. 7所示的上游引物F2，和由SEQ ID NO. 8所示的下游引物R2，以PBS-TII_AtDREB2A為模板， 進行第二次PCR擴增，得到第二個PCR片段。然后將上訴兩個片段做SOE-PCR得到一個融合DNA片段，即AtDREB2A-CA，將此PCR擴增產物經EcoRI和EcoRV酶切后，將植物表達載體pH7m24GW，3_Prd29A經EcoRI和EcoRV酶切，二者進行連接反應，得到植物表達載體 pH7m24Gff,3-Prd29A-DREB2A_CA。本發明提供了一種擬南芥脫水應答原件結合蛋白2A組成型激活基因基因及包括該基因的重組載體和宿主細胞及應用。然后連接到植物表達載體上，利用農桿菌侵染法轉化煙草，獲得的轉基因植株，進行了抗鹽性分析，結果表明轉基因煙草抗鹽能力得到提高。


圖1用AtDREB2A弓丨物對擬南芥cDNA的PCR電泳圖。圖2AtDREB2A連接PBS-TII載體的PCR驗證驗證結果。圖 3PBS-TII_AtDREB2A 載體示意圖。圖4用SOE-PCR得到AtDREB2A_CA的電泳驗證結果。圖 5 植物表達載體 pH7m24GW，3-Prd29A-DREB2A_CA 用 HindiIII 酶切驗證。圖 6 植物表達載體 pH7m24GW，3-Prd29A-DREB2A_CA 示意圖。圖7煙草轉基因過程。圖8轉基因煙草基因組PCR。圖9轉基因煙草的抗鹽性能測試。
具體實施例方式實施例1擬南芥脫水應答原件結合蛋白2A組成型激活基因AtDREB2A基因的克隆及中間載體 pBS-T-AtDREB2A 的構建以擬南芥 RNA 為模板，使用 Reverse Transcription System (Promega 公司)試齊[J 盒進行反轉錄，合成cDNA第一鏈。1.將1 μ g(2y 1)的總RNA置于1. 5ml的離心管中，70°C加熱lOmin，迅速在冰上冷卻，短暫離心后，置于冰上；2.反轉錄-的反應體系如下Total RNA1 pg (2 μ ) MgCl2 (25 mM) 4 μ Reverse Transcription IOxBuffer 2 μι dNTP Mixture (10 mM) 2 pL Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor 0.5 μ
AMV Reverse Transcriptase (High Cone.)15 U (0.7 μ )
Oligo(CiT)15 Primer0.5 pg (1 pL) Nuclease-Free ddWater 力口至 20 μ 3.混勻后，42°C溫浴 50min ；4. 95°C加熱5min，4°C放置5min，使AMV逆轉錄酶失活，不再與cDNA鏈相結合；5.取1 μ LcDNA反應液為模板，進行PCR反應，用AtDREB2A基因特異引物，SEQ ID N0. 3 及 SEQ ID N0. 4 F5' -GGGAAGGAGATGGCAGTTT-3‘ 19ntR5' -GTTGTGGGATTAAGGCAAATA-3‘ 2 IntPCR反應體系如下
上游引物IpL
下游引物IpL
2.5mMdNTPs2 μL
IOxPCR buffer2.5μl
模板0.5μ
PfU DNA 聚合酶(5U/pL) 0.25μl ddH2017.75μl
Total volume25 μlPCR擴增條件為
預變性 94 °C 4min 變性94 °C 30 s
退火58 °C 30 s
延伸72 °C Imin
循環重復步驟2-4 30次延伸72°C IOmin取5 μ L PCR產物進行凝膠電泳檢測。電泳結果見圖1所示。然后按照上述方法將DREB基因的PCR片段連接pBS_TII載體，將AtDREB2A基因與pBS_TII載體鏈接，反應體系如下
PCR片段3 μl
pBS-T 載體1 μ l
2χΤ4 DNA Rapid Ligation Buffer5 μl
T4 DNA Ligase1 μl
反應條件23°C，IOmin0連接產物轉化大腸桿菌T0P10細胞(購買于天根公司)， 涂布于含氨芐的LB平板。連接產物鑒定挑取抗性菌落，在含有Amp 100mg/L的LB液體培養基中培養12h，提取質粒，進行 PCR驗證，PCR電泳驗證結構見圖2。由此，我們到的了中間載體pBS-T-AtDREB2A，載體示意圖見圖3。將該載體送往華大基因公司測序，我們得到了該基因的堿基序列，用ClustalX2 軟件進行序列比對，與Genbank所公布的序列完全一致。實施例2構建植物表達載體pH7m24GW，3-Prd29A-DREB2A_CA
引物設計如 F1，R1 和 F2，R2，序列見 SEQ ID NO. 5，SEQ ID NO. 6，SEQ ID NO. 7，SEQ ID NO. 8。用擬南芥pBS-T-AtDREB2A為模板，分別以Fl，Rl和F2，R2為引物，用PFU酶分別做 PCR。體系如下
上游引物2μ
下游引物2汕
2.5mMdNTPs4 μ
IOxPCRbuffer5μ
模板bL
Pfo DNA 聚合酶(5υ/μ ) 0.5μ ddH2035.5μ
Total volume50 μ 反應條件為
預變性 94°C 5 min 變性94。C 30 s
退火57°C 30 s
延伸72°C 1 min40s
循環重復步驟2-4 30次延伸72°C 8 min以上兩對引物PCR產物見圖4中第1及第2泳道。切膠回收以上兩種片段然后做連接
上游片段2μ
下游片段2μ
2.5mMdNTPs2μΙ
IOxPCR buffer2.5吣
Taq DNA 聚合酶(5U/^L) 0.25μ ddH2016.5μ
Total volume25 \ih
反應條件為
預變性 94°C 5 min 變性94°C 30 s
退火50°C 30 s
延伸72°C 45s
循環重復步驟2-4 4次延伸72°C 8 min于是得到連接產物。將此連接產物做全長延伸，體系如下
引物Fl\μΙ
下游R2
2.5mMdNTPs4 成
IOxPCR buffer5μΙ
連接產物20
Pfu DNA 聚合酶(5υ/μ ) 0.5μ ddH2036.5μ
Total volume50 μ 反應條件為
預變性 94°C 5 min 變性94°C 30 s
退火50。C 30 s
延伸72。C 45s
循環重復步驟2-4 4次延伸72°C 8 min連接產物即AtDREB2A_CA，結構見圖4中第3泳道。PCR產物直接用EcoRI和EcoRV酶切，酶切體系為
PCR片段12盹
IOxTanger Buffer 6\iL EcoRlΙμ
EcoRVlμL
補水至總體積 30 μL37°C 12h進行完全酶切，酶切產物做切膠回收，確定濃度，連接植物表達載體，連
接體系為PCR片段7.5燦
載體片段ΙΟμ
10χΤ4 DNA 連接 Buffer2\xL
T4DNA Iigase0.5μ
Total volume20μL反應產物與大腸桿菌感受態細胞ToplO混合，做轉化，并涂布于含壯觀霉素Spe 的抗性平板上，提取質粒，用HindIII做酶切檢測，結構見圖5。于是得到了植物表達載體 pH7m24Gff, 3-Prd29A-AtDREB2A_CA，載體示意圖見圖6。將該載體送往華大基因公司測序，我們得到了擬南芥脫水應答原件結合蛋白2A組成型激活(constitutive activation/CA)基因AtDREB2A-CA的堿基序列，即SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。實施例3用于植物轉基因的農桿菌工程菌種C58 :pH7m24GW, 3-Prd29A-DREB2A_CA的構建。農桿菌感受態細胞制備1.將農桿菌C58單菌落接種于5mL YEP液體培養基中，28°C，180r/min振蕩培養過夜；2.將上述菌液轉入IOOmL YEP液體培養基中，28°C，180r/min,振蕩培養(OD6tltl值約為0. 5)；3.冰浴30min后，4°C，4000r/min離心lOmin，收集菌體，重懸于20mL預冷的H2O 中；4. 41，400017/1^11離心101^11，收集菌體，重懸于預冷的10%甘油中，每管20(^1^ 分裝，液氮速凍，存于-80°C備用。、植物表達載體的電擊轉化1.將-80°C取出的C58感受態細胞置于冰上，使其緩慢融化；2.加入2 μ L質粒，混勻；3.轉移至電擊杯中，以上操作均在冰上進行；4.設置電擊轉化儀參數25μ F，400olm，1500V, 5ms,電擊轉化；5.室溫靜置2min后加入ImL YEB液體培養基，28°C，180r/min振蕩培養4h ；6.取501^菌液涂布于含10011^/1 Ka抗性的YEB平板上，倒置平板，28°C培養 48h，直至看到清晰的單菌落。菌落PCR1.挑取若干C58單菌落，分別溶于30 μ L ddH20中，98°C煮沸IOmin ；2.取上述菌液IyL作為模板，依照上述該基因的反應程序進行PCR反應。實施例5農桿菌介導的煙草遺傳轉化煙草苗的無菌培養將煙草種子播種在培養基上，選飽滿、健康的煙草種子，用 75%乙醇浸泡Imin 25%的安替福明(有效氯2. 5% )水溶液滅菌8min，無菌水漂洗三次， 將種子放在MS培養基中，25°C光培養，16h/8h光周期。本實驗用到的培養基
培養基煙草試管苗培養基侵染培養基
共培養培養基
脫菌篩選培養基抗性苗生根培養基
成分PH
MS5.8
MS+0.5 mg/L 6-BA+ 0.05 mg/L NAA+100 μιηοΙ/L5.8
AS (液體)
MS+0.5 mg/L 6-BA+ 0.05 mg/L NAA+100 μιηοΙ/L5.8
AS (固體)
MS + 1 mg/L 6-BA+ 0.1 mg/L NAA+100 mg/L Kar5.8 + 400mg/L Cef
l/2MS+100mg/L Kar +400mg/L Cef.5.8
煙草的農桿菌轉化浸染菌液的制備(1)挑取陽性農桿菌單菌落，接種到含100mg/L卡那霉素的LB液體培養基中，于 28°C、200r/min的搖床上過夜培養。(2)當菌液處于旺盛生長期(0D· = 0.6-0.9)時，將菌液倒入50ml離心管，在 4000r/min下離心15min，棄上清液，收集菌體。(3)用無菌水清洗菌體2次。(4)用侵染培養基重懸菌體，使OD6tltl = 0. 9-1. 2。外植體浸染將煙草葉片去除主脈和葉邊緣，然后將葉片切成IcmX Icm大小，浸入制備好的農桿菌菌液，浸泡8-15min，其間搖動2_3次，使葉片充分接觸菌液，取出葉片，用無菌的濾紙吸凈多余的菌液，葉面朝下、葉背朝上接種于共培養基中，25°C左右培養3-4天。(2)將葉片轉移至篩選培養基中，20天左右更換一次培養基，誘導抗性芽產生(圖 7a)，當抗性芽從愈傷組織上長到Icm左右(圖7b)，從愈傷上切取抗性芽，接種于抗性苗生根培養基(圖7c)。轉基因苗移栽將根系生長良好、生命力旺盛的煙草組培苗從組培瓶中取出圖，用自來水沖洗培養基(盡量減少根系損傷)，種植在蛭石和腐殖土的培養土中，覆蓋薄膜保溫保濕15天，然后揭開薄膜，定期澆水、施肥，使之在溫室中正常生長(圖7d)。實施例6轉基因煙草的分子檢測和抗鹽性檢測轉基因煙草基因組DNA的PCR檢測1. CTAB法提取煙草總DNA ；2.以基因組DNA 為模板，進行PCR檢測，引物為P5、P6，反應條件DI B2A檢測引物F TGACGGTACTACTGTGGCTR TTCTACAATCCCTTGCTCCPCR反應體系
上游引物Ιμ
下游引物Ιμ
2.5mMdNTPs2 IOxPCRbuffer
模板0.5pL
Taq DNA 聚合酶(5U/pL) 0.25成
CidH2O\^. SμL
Total volume25 pLPCR擴增條件
預變性94 0C4 min變性94 0C30 s退火55 0C30 s延伸72 0C45 s循環重復步驟2-430次延伸72 0C10 min取上述PCR產物5微升，進行電泳檢測，如圖8所示，說明AtDREBA2A_CA基因已成功轉入煙草。轉基因煙草的抗鹽性檢測將在溫室正常生長的，5-7cm轉基因煙草苗和野生型對照苗，分別澆上含 300mmol/L及500mmol/L濃度的NaCl的水，在溫室中保持85 %的濕度。監測發現，在 300mmOl/LNaCl的生長條件下，野生型的煙草生長緩慢，生物量較少。如此相反，轉基因煙草能夠開花結實，相對生物量較高。見圖9a。在500mmOl/LNaCl的生長條件下，生長一周以后，野生型煙草葉片發黃，萎蔫，組織壞死，不能正常生長。盡管轉基因煙草的生長也受到一定程度的抑制，但遠不像野生型煙草那樣明顯。見圖％。
權利要求
1.一種擬南芥來源的脫水應答原件結合蛋白2A組成型激活基因(AtDREB2A-CA)，其特征在于選自以下核苷酸序列之一1)具有SEQID No. 1所示的核苷酸序列；2)SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的70%的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
2.權利要求1所述的擬南芥脫水應答原件結合蛋白2A組成型激活基因編碼的蛋白質， 其特征在于所述的蛋白質具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
3.—種重組載體，其特征在于含有權利要求1所述的擬南芥脫水應答原件結合蛋白2A 組成型激活基因(AtDREB2A-CA)全序列或部分片段。
4.一種權利要求3所述的重組載體，其特征在于它是重組植物表達載體pH7m24GW， 3-Prd29A-DREB2A-CA0
5.一種宿主細胞，其特征在于含有權利要求1所述的擬南芥脫水應答原件結合蛋白2A 組成型激活基因(AtDREB2A-CA)全序列或部分片段。
6.一種權利要求5所述的宿主細胞，其特征在于它是農桿菌細胞，煙草細胞，玉米細胞或者大豆細胞。
7.權利要求1所述的擬南芥來源的脫水應答原件結合蛋白2A組成型激活基因 (AtDREB2A-CA)的克隆方法，其特征在于由下述步驟組成(1)從擬南芥葉片中提取總RNA，做逆轉錄PCR，得到AtDREB2A基因，將此基因連接 PBS-TII 載體；得到中間載體 PBS-TII-AtDREB2A ；(2)以PBS-TII-AtDREB2A為模板，用折疊延伸PCR(SOE-PCR)方法擴增得到擬南芥脫水應答原件結合蛋白2A組成型激活基因(AtDREB2A-CA)；(3)將上述PCR擴增產物經EcoRI和EcoRV酶切后，將植物表達載體pH7m24GW， 3-Prd29A經EcoRI和EcoRV酶切，二者進行連接反應，得到植物表達載體pH7m24GW， 3-Prd29A-DREB2A-CA0
8.—種權利要求1所述的擬南芥脫水應答原件結合蛋白2A組成型激活基因 (AtDREB2A-CA)的應用，其特征在于它用于制備轉基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、馬鈴薯、棉花、谷子、大麥以及花卉和蔬菜植株。
全文摘要
本發明涉及一個擬南芥中脫水應答原件結合蛋白2A基因(AtDREB2A)的克隆、重組及應用。它具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。從擬南芥葉片中提取總RNA，做逆轉錄PCR，得到AtDREB2A基因并將其連接到PBS-TII載體，得到中間載體PBS-TII-AtDREB2A。以PBS-TII-AtDREB2A為模板，用折疊延伸PCR(SOE-PCR)方法PCR擴增得到擬南芥脫水應答原件結合蛋白2A組成型激活基因(AtDREB2A-CA)，并將擴增產物連接到植物表達載體，得到植物表達載體pH7m24GW，3-Prd29A-AtDREB2A-CA。用電擊法將此載體導入農桿菌C58細胞，用這種細胞浸染煙草，得到了轉入AtDREB2A-CA的煙草，通過測試，發現了轉基因煙草抗鹽性得到很大提高。
文檔編號C12N15/29GK102329804SQ201110289908
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月28日 優先權日2011年9月28日
發明者關春峰, 季靜, 王罡, 趙清 申請人:天津大學