專利名稱：一種分子標記鑒定雜交大豆種子的方法
技術領域：
本發明公開一種分子標記檢測雜交大豆種子的方法，適用于RN型細胞質雄性不育“三系”育成的雜交大豆審定品種種子純度的鑒定，屬于植物分子標記檢測技術領域。
背景技術：
利用雜種優勢是大幅度提高大豆單產最有效的措施之一。我國在大豆雜種優勢研究領域處于國際領先地位，吉林省農業科學院利用細胞質雄性不育“三系”于2002年育成并審定了世界上第一個大豆雜交種“雜交豆1號”，比對照增產20. 9%。之后吉林省農業科學院又育成并審定了雜交豆2號、3號、4號和5號，安徽省農業科學院育成并審定了雜優豆 1和2號，阜陽市農業科學研究所育成并審定了阜雜交豆1號。目前這些雜交種部分已在生產上應用，這標志著大豆雜種優勢利用進入產業化開發階段。然而優良雜交種的推廣應用需要大量優質的種子，雜交種純度的高低直接影響著雜交大豆的產量和農民種植雜交種的積極性。為保護農民的利益，降低因純度低而導致的減產，迫切需要進行大豆雜交種純度的檢驗工作，并建立一種準確、簡單、快捷的雜交種純度鑒定方法。大豆種子純度常規鑒定多采用形態學鑒定法和生化鑒定法。形態學鑒定法是依靠種子或植株的表型性狀來鑒別不同的個體，該方法比較直觀、簡便，但由于可直接觀測的農藝性狀十分有限，有些性狀要在特定的生育期才能檢測，有些性狀易受環境條件的影響，從而受到很大限制。關鍵是如果混雜的材料在表型上與被鑒定雜交種的性狀完全一致，采用這種方法就無法鑒定出偽雜種。生化鑒定法是通過鑒別不同品種基因表達產物蛋白質之間的特異性差異來鑒定種子純度。該技術的應用對準確、快速檢驗種子純度起了很大的推動作用，但由于其多態性較低，且有組織和器官特異性，使取材受到嚴格限制，從而限制了其應用。

發明內容
本發明提供一種分子標記鑒定雜交大豆種子的方法，解決了現有用于種子純度鑒定鑒定法存在的諸多缺陷，具有省時、省力、方法簡單，操作方便，鑒定快速，準確可靠，工作效率高等特點。實現本發明提供一種分子標記鑒定雜交大豆種子的方法，包括以下步驟
(1)提取大豆雜交種種子的基因組DNA；以基因組DNA為模版，用引物JLHSSSR1進行擴
增；
引物序列為
上游引物5，-GCAGCTTGCTCAGAACATCA-3，， 下游引物5，-AAACCCTAACGCCGTTTCTT-3，；
(2)對擴增產物進行凝膠電泳；
(3)對電泳結果進行分析，其中
SSR引物JLHSSSR1產生的母本特異標記為兩條；產生的父本特異標記也為兩條；通過應用幾HSSSRl對雜交大豆種子的標記基因型進行分析，只有同時具有親本特異條帶的單株才是真正的雜交種，缺少其中任意一個條帶或無親本條帶，均被視為假雜種，檢測得到的純度結果的平均值即為雜交大豆種子的純度。雜交大豆基因組DNA的提取
取一粒雜交大豆種子置于研缽中，加入液氮研磨成粉末，取0. 2g粉末倒入1. 5 ml離心管中，向離心管中加入600ml 65°C預熱的IXCTAB緩沖液和40ml巰基乙醇；將樣品粉末與緩沖液迅速攪勻使之不成團，65°C水浴30分鐘，其間輕搖3-5次；4°C，SOOOrpm離心， 取上清液轉入1. 5ml離心管，加入等體積氯仿-異戊醇(24 1)混勻；室溫，IOOOOrpm離心 lOmin，取上清液；加2 / 3體積的預冷異丙醇，_20°C沉淀30min ；4°C IOOOOrpm離心5min， 棄上清，加入500 μ 1 70%乙醇洗2次，吸干上清液，室溫晾干，約10分鐘；加入200 μ 1已滅菌的的TE溶液(ρΗ8. 0)，混勻后，即得DNA溶液，置于_20°C保存備用； PCR擴增反應
PCR反應體系為10 μ 1，其中包括基因組DNA 30 ng，2.5 mmol · L_1 MgCl2, dNTPs各 0. 2mmol · L-1，引物 0. 5 μ mol · L_1，0. 3U Taq DNA 聚合酶； PCR反應程序
首先 94°C 3min;然后 94°C 30s, 46 °C 30s, 72 °C 30s，共 30 個循環；最后 72 °C 10 min ；PCR擴增反應在PCR基因擴增儀上進行； 凝膠電泳
擴增產物在質量體積比濃度為8%的垂直板變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上進行電泳，恒功率80W電泳，電泳結束后，將膠版置于固定液中固定20min，蒸餾水沖洗3次，每次至少2 分鐘，銀染30min，顯色后加入固定液固定，再用蒸餾水洗滌凝膠2次，每次至少2分鐘，然后晾干，將晾干的玻璃板置于燈箱上觀察結果或照相記錄。通過RN型細胞質雄性不育“三系”，吉林省農業科學院目前已經育成了雜交豆1 號、2號、3號、4號和5號，共五個雜交大豆品種，并分別于2002、2006、2009、2010、2011年通過吉林省品種審定委員會審定。這些品種是世界上第一批可商用大豆雜交種。因此，為保證農民種植優良雜交種產生最大的經濟效益，需要一種準確、簡單、快捷的雜交種純度鑒定方法對其商用種子的真偽及純度進行快速鑒定。本發明提供1個能夠在雜交種中同時產生具有父、母本特異標記的條帶，而且帶型清晰、重復性好、可靠性強的引物JLHSSSR1作為鑒定RN型細胞質雄性不育“三系”育成的雜交大豆品種種子真偽的特征引物。本發明與傳統大豆種子純度鑒定方法相比積極效果在于用SSR標記方法鑒定大豆商用雜交種純度，這有利于商用雜交大豆品種種子的質量控制，具有如下特點
(1)快速、準確、可靠，DNA提取及電泳檢測，僅需一個工作日即可完成；
(2)操作方法簡單，普通實驗室技術人員就可完成；
(3)所需設備為普通分子生物學實驗室常用設備；
(4)沒有季節和時間限制，任何時間皆可進行檢測，省去常規種子純度鑒定所需土地、 溫度、光照等條件，及植株生長過程中耗費的時間。通過對雜交大豆品種的隨機群體鑒定，其結果與田間鑒定相一致。本發明方法簡便，操作方便，該方法以篩選的特異分子標記，可快速、準確、可靠地通過實驗手段鑒定RN型細胞質雄性不育“三系”育成的雜交大豆審定品種種子純度，降低大豆雜交種銷售過程中，因種子純度不夠而可能招致減產的風險。


圖1為本發明特異性SSR標記篩選示意其中，Pl 父本；P2 母本；Fl 雜交種JLHSSSR1—JLHSSSR11 篩選用SSR引物； 圖2為本發明標記幾HYSSRl擴增鑒定雜交大豆品種雜交豆1號種子純度實施例示意
其中，被檢測種子；其中 2、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、21、23、24、 25、27、30 為真雜交種；1、3、9、20、22、26、28、29 ；
圖3為本發明標記幾HYSSRl擴增鑒定雜交大豆品種雜交豆2號種子純度實施例示意
圖
其中，1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15、17、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29為真雜交種；8、16、19為假雜交種；
圖4為本發明標記JLHYSSR1擴增鑒定雜交大豆品種雜交豆3號種子純度實施例示意
其，1、2、3、5、6、7、8、9、11、12、15、16、17、18、19、20、21、22、23、28、30、33 為真雜交種； 4、10、13、14、24、25、26、27、29、31、32 為假雜交種；
圖5為本發明標記JLHYSSR1擴增鑒定雜交大豆品種雜交豆4號種子純度實施例示意
圖
其中，1、2、3、4、5、6、9、10、11、12、13、14、16、18、19、20、22、23、24、25、27 為真雜交種； 7、8、15、17、21、26、28 為假雜交種；
圖6為本發明標記JLHYSSR1擴增鑒定雜交大豆品種雜交豆5號種子純度實施例示意
其中，3、6、7、9、10、11、12、13、14、16、21 為真雜交種；1、2、4、5、8、15、17、18、19、20 為假
雜交種。
具體實施例方式下面通過基于PCR技術的SSR標記分析實施例進一步說明本發明，并不以任何方式限制本發明，在不背離本發明的技術解決方案的前提下，對本發明所作的本領域普通技術人員容易實現的任何改動或改變都將落入本發明的權利要求范圍之內。實施例1
實驗材料為雜交大豆種子及其各自親本材料種子。實驗方法為提取上述實驗材料的基因組DNA，采用SSR分子標記進行PCR擴增，將擴增產物進行凝膠電泳，統計結果并篩選特征引物，用特征引物對要檢測的雜交種進行純度鑒定。大豆種子基因組DNA提取
(1)取一粒雜交大豆種子置于研缽中，加入液氮研磨成粉末，取0. 2g粉末倒入1. 5 ml 離心管中；(2)向離心管中加入600ml 65°C預熱的 IXCTAB 緩沖液(50 mM Tris-Cl pH8. 0,0. 7 M NaCl，10 mM EDTA pH8. 0，1% CTAB )和40ml巰基乙醇；將樣品粉末與緩沖液迅速攪勻使之不成團，65°C水浴30分鐘，其間輕搖3-5次；
(3)4°C，SOOOrpm離心，取上清液轉入1.5ml離心管，加入等體積氯仿-異戊醇(24 1) 混勻，室溫，IOOOOrpm離心IOmin ；
(4)取上清液；加2/ 3體積的預冷異丙醇，-20°C沉淀30min ；4°C IOOOOrpm離心 5min ；
(5)棄上清，加入500μ 1 70%乙醇洗DNA，IOOOOrpm離心5min ；倒掉上清液，重復洗一次，吸干上清液，室溫晾干，約IOmin ；
(6)加入200μ 1已滅菌的的TE溶液(ρΗ8. 0)，混勻后，即為DNA溶液，置于_20°C保存分子標記分析
SSR反應體系為10 μ 1，其中包括基因組DNA 30 ng，2.5 mmol · L-I MgCl2, dNTPs各 0. 2mmol · L-1，引物 0. 5 μ mol · L_1，0. 3U Taq DNA 聚合酶。PCR 反應程序首先 94°C 3min;然后 94°C 30s，46°C 30s, 72°C 30s，共 30 個循環；最后72°C 10 min00 PCR擴增反應在PCR基因擴增儀上進行。擴增產物在質量體積比濃度為8%的垂直板變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上進行電泳，恒功率80W電泳；電泳結束后，將膠版置于固定液(10%冰乙酸)中固定20min ；蒸餾水沖洗3次，每次至少2分鐘；將膠板移至染色液(2升雙蒸水預冷，臨用時加2克硝酸銀，3 ml 37%甲醛)中，銀染30min ；然后將膠板放入雙蒸水中5_10秒，迅速取出并浙水，膠板放入預冷的顯影液(2L雙蒸水中溶解60克碳酸鈉，冷卻至10-12°C，用時加入3 ml 37%甲醛， 400 μ 1硫代硫酸鈉溶液)中，輕搖至電泳條帶清晰顯示出來；顯色后加入固定液固定；再用蒸餾水洗滌凝膠2次，每次至少2分鐘，然后晾干；將晾干的玻璃板置于燈箱上觀察結果或照相記錄。篩選純度鑒定的特征引物
從所用的引物中篩選出能夠在雜交種中同時產生父、母本特異標記條帶，且帶型清晰、 重復性好、可靠性強的引物1對，命名為幾HYSSRl，作為雜交大豆種子真實性或/和品種純度鑒定的引物，見圖1。JLHYSSR1引物序列為 F GCAGCTTGCTCAGAACATCA R:AAACCCTAACGCCGTTTCTT
SSR引物JLHSSSR1產生的母本特異標記為兩條；產生的父本特異標記也為兩條。用特征引物對雜交種進行純度鑒定
應用上述特征引物，對通過需要檢測的雜交大豆種子進行純度鑒定，步驟同1-3。只有同時具有親本特異條帶的單株才是真正的雜交種，缺少其中任意一個條帶或無親本條帶均被視為假雜種，檢測得到的純度結果的平均值即為雜交種的純度。此引物在多次重復中表現穩定，與大田鑒定數據相一致可以準確地鑒定大豆雜交種的純度。其中SSR引物代號JLHSSSR1的含義是“幾”代表吉林；“HS”代表Hybrid Soybean ;“1”代表本引物編號。試驗例1驗證實施例鑒定雜交大豆品種雜交豆1號種子純度 (1)雜交大豆種子基因組DNA提取
其過程是將雜交大豆品種雜交豆1號種子置于研缽中，加入液氮研磨成粉末，取0. 2g 粉末倒入1.5 ml離心管中；向離心管中加入600ml 65°C預熱的1 XCTAB緩沖液(50 mM Tris-Cl ρΗ8· 0,0. 7 M NaCl, 10 mM EDTA ρΗ8· 0，1% CTAB )禾口 40ml 巰基乙醇；將樣品粉末與緩沖液迅速攪勻使之不成團，65°C水浴30分鐘，其間輕搖3-5次；4°C，SOOOrpm離心， 取上清液轉入1. 5ml離心管，加入等體積氯仿-異戊醇(24 1)混勻，室溫，IOOOOrpm離心 IOmin ；取上清液；加2 / 3體積的預冷異丙醇，_20°C沉淀30min ；4°C IOOOOrpm離心5min ； 棄上清，加入500 μ 1 70%乙醇洗DNA，IOOOOrpm離心5min ；倒掉上清液，重復洗一次，吸干上清液，室溫晾干，約IOmin ；加入200 μ 1已滅菌的TE溶液(ρΗ8. 0)，混勻后，即為DNA溶液，置于_20°C保存備用。(2 ) JLHSSSR1 弓 | 物 PCR 擴增
PCR反應體系為10 μ 1，其中包括基因組DNA 30 ng，2.5 mmol · L_1 MgCl 2, dNTPs各 0. 2mmol · L-1，引物 0. 5 μ mol · L_1，0. 3U Taq DNA 聚合酶。PCR 反應程序首先 94°C 3min;然后 94°C 30s,46°C 30s,72°C 30s，共 30 個循環；最后72°C 10 min0 PCR擴增反應在PCR基因擴增儀上進行。( 3 )擴增產物凝膠電泳分析
擴增產物在質量體積比濃度為8%的垂直板變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上進行電泳，恒功率80W電泳；電泳結束后，將膠版置于固定液(10%冰乙酸)中固定20min ；蒸餾水沖洗3 次，每次至少2分鐘；將膠板移至染色液(2升雙蒸水預冷，臨用時加2克硝酸銀，3 ml 37% 甲醛)中，銀染30min;然后將膠板放入雙蒸水中5-10秒，迅速取出并浙水，膠板放入預冷的顯影液(2L雙蒸水中溶解60克碳酸鈉，冷卻至10-12°C，用時加入3 ml 37%甲醛，400μ 1硫代硫酸鈉溶液)中，輕搖至電泳條帶清晰顯示出來；顯色后加入固定液固定；再用蒸餾水洗滌凝膠2次，每次至少2分鐘，然后晾干；將晾干的玻璃板置于燈箱上觀察結果并照相記錄。(4)雜交大豆種子純度計算
本試驗例共選取30粒雜交大豆種子進行純度鑒定，結果見圖2。通過對種子基因組DNA 擴增帶型進行分析，22粒種子擴增結果同時具有親本特異條帶，認定其為真雜交種；8粒種子DNA擴增結果為缺少其中任意一個親本條帶，認定其為假雜交種，計算檢測結果得出，本實施例中大豆雜交種的純度為73. 33%，與常規鑒定數據相一致。試驗例2
驗證實施例鑒定雜交大豆品種雜交豆2號種子純度
(1)雜交大豆種子基因組DNA提取，同試驗例1；
(2)JLHSSSR1引物PCR擴增，方法同試驗例1 ；
(3)擴增產物凝膠電泳分析，方法同試驗例1；
(4)雜交大豆種子純度計算，方法同試驗例1；
本試驗例共選取29粒雜交大豆種子進行純度鑒定，結果見圖3。通過對種子基因組DNA 擴增帶型進行分析，26粒種子擴增結果同時具有親本特異條帶，認定其為真雜交種；3粒種子DNA擴增結果為缺少其中任意一個親本條帶或無親本條帶，認定其為假雜交種，計算檢測結果得出，本實施例中大豆雜交種的純度為89. 66%，與常規鑒定數據相一致。
試驗例3
驗證實施例鑒定雜交大豆品種雜交豆3號種子純度
(1)雜交大豆種子基因組DNA提取，方法同試驗例1；
(2)JLHSSSR1引物PCR擴增，方法同試驗例1 ；
(3)擴增產物凝膠電泳分析，方法同試驗例1；
(4)雜交大豆種子純度計算，方法同試驗例1；
本試驗例共選取33粒雜交大豆種子進行純度鑒定，結果見圖4。通過對種子基因組DNA 擴增帶型進行分析，22粒種子擴增結果同時具有親本特異條帶，認定其為真雜交種；11粒種子DNA擴增結果為缺少其中任意一個親本條帶或無親本條帶，認定其為假雜交種，計算檢測結果得出，本實施例中大豆雜交種的純度為66. 67%，與常規鑒定數據相一致。試驗例4
驗證實施例鑒定雜交大豆品種雜交豆4號種子純度
(1)雜交大豆種子基因組DNA提取，方法同試驗例1；
(2)JLHSSSR1引物PCR擴增，方法同試驗例1 ；
(3)擴增產物凝膠電泳分析，方法同試驗例1；
(4)雜交大豆種子純度計算，方法同試驗例1；
本試驗例共選取28粒雜交大豆種子進行純度鑒定，結果見圖5。通過對種子基因組DNA 擴增帶型進行分析，21粒種子擴增結果同時具有親本特異條帶，認定其為真雜交種；7粒種子DNA擴增結果為缺少其中任意一個親本條帶或無親本條帶，認定其為假雜交種，計算檢測結果得出，本實施例中大豆雜交種的純度為75. 00%，與常規鑒定數據相一致。試驗例5
驗證實施例鑒定雜交大豆品種雜交豆5號種子純度
(1)雜交大豆種子基因組DNA提取，方法同試驗例1；
(2)JLHSSSR1引物PCR擴增，方法同試驗例1 ；
(3)擴增產物凝膠電泳分析，方法同試驗例1；
(4)雜交大豆種子純度計算，方法同試驗例1；
本試驗例共選取21粒雜交大豆種子進行純度鑒定，結果見圖6。通過對種子基因組DNA 擴增帶型進行分析，11粒種子擴增結果同時具有親本特異條帶，認定其為真雜交種；10粒種子DNA擴增結果為缺少其中任意一個親本條帶或無親本條帶，認定其為假雜交種，計算檢測結果得出，本實施例中大豆雜交種的純度為52. 38%，與常規鑒定數據相一致。
權利要求
1.用于鑒定雜交大豆種子純度的引物JLHSSSR1，其特征在于引物序列為上游引物5，-GCAGCTTGCTCAGAACATCA-3，，下游引物5’ -AAACCCTAACGCCGTTTCTT-3，。
2.一種分子標記鑒定雜交大豆種子純度的方法，包括以下步驟(1)提取大豆雜交種種子的基因組DNA；以基因組DNA為模版，用引物JLHSSSR1進行擴增；(2)對擴增產物進行凝膠電泳；(3)對電泳結果進行分析，其中SSR引物JLHSSSR1產生的母本特異標記為兩條；產生的父本特異標記也為兩條；通過應用幾HSSSRl對雜交大豆種子的標記基因型進行分析，只有同時具有親本特異條帶的單株才是真正的雜交種，缺少其中任意一個條帶或無親本條帶，均被視為假雜種，檢測得到的純度結果的平均值即為雜交大豆種子的純度。
3.根據權利要求2所述分子標記鑒定雜交大豆種子純度的方法，其特征在于雜交大豆基因組DNA的提取取一粒雜交大豆種子置于研缽中，加入液氮研磨成粉末，取0. 2g粉末倒入1. 5 ml離心管中，向離心管中加入600ml 65°C預熱的IXCTAB緩沖液和40ml巰基乙醇；將樣品粉末與緩沖液迅速攪勻使之不成團，65°C水浴30分鐘，其間輕搖3-5次；4°C，SOOOrpm離心， 取上清液轉入1. 5ml離心管，加入等體積氯仿-異戊醇(24 1)混勻；室溫，IOOOOrpm離心 lOmin，取上清液；加2 / 3體積的預冷異丙醇，_20°C沉淀30min ；4°C IOOOOrpm離心5min， 棄上清，加入500 μ 1 70%乙醇洗2次，吸干上清液，室溫晾干，約10分鐘；加入200 μ 1已滅菌的的TE溶液(ρΗ8. 0)，混勻后，即得DNA溶液，置于_20°C保存備用；PCR擴增反應PCR反應體系為10 μ 1，其中包括基因組DNA 30 ng，2.5 mmol · L_1 MgCl2, dNTPs各 0. 2mmol · L-1，引物 0. 5 μ mol · L_1，0. 3U Taq DNA 聚合酶；PCR反應程序首先 94°C 3min;然后 94°C 30s, 46 °C 30s, 72 °C 30s，共 30 個循環；最后 72 °C 10 min ；PCR擴增反應在PCR基因擴增儀上進行；凝膠電泳擴增產物在質量體積比濃度為8%的垂直板變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上進行電泳，恒功率80W電泳，電泳結束后，將膠版置于固定液中固定20min，蒸餾水沖洗3次，每次至少2 分鐘，銀染30min，顯色后加入固定液固定，再用蒸餾水洗滌凝膠2次，每次至少2分鐘，然后晾干，將晾干的玻璃板置于燈箱上觀察結果或照相記錄。
全文摘要
本發明公開一種分子標記鑒定雜交大豆種子純度的方法，以RN型細胞質雄性不育“三系”育成的雜交大豆審定品種及其親本的基因組DNA為模版，通過SSR分析，建立了雜交大豆及其各自親本的SSR特異性指紋圖譜，成功地獲得了一個能將親本及雜交種明確區分的共顯性SSR標記，根據特異性標記可以進行RN型細胞質雄性不育“三系”育成的雜交大豆審定品種的種子純度檢驗。通過對雜交大豆品種的隨機群體鑒定，其結果與田間鑒定相一致。本發明方法簡便，操作方便，該方法以篩選的特異分子標記，可快速、準確、可靠地通過實驗手段鑒定RN型細胞質雄性不育“三系”育成的雜交大豆審定品種種子純度，降低大豆雜交種銷售過程中，因種子純度不夠而可能招致減產的風險。
文檔編號C12N15/11GK102329869SQ20111029268
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月5日 優先權日2011年10月5日
發明者張井勇, 張偉, 張偉龍, 張春寶, 彭寶, 王玉民, 趙麗梅, 趙曉明 申請人:吉林省農業科學院