專利名稱：一種cdh1基因突變檢測特異性引物和液相芯片的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體的是涉及一種⑶Hl基因突變檢測特異性引物和液相芯片。
背景技術：
上皮鈣黏蛋白編碼基因(E-Cadherin，⑶HI)是一種腫瘤抑制基因和腫瘤轉移抑制基因，與多種上皮來源的惡性腫瘤的發生、發展、侵襲轉移密切相關。CDHl基因定位于16q22. 1，由1237個腺嘌呤、1177個胞嘧啶、1128個鳥嘌呤和1236個胸腺嘧啶組成，有研究表明，CDHl基因突變與腫瘤的發生相關。目前，對CDHl基因突變進行檢測和分析的方法很少，主要有直接測序法和PCR-RFLP分析法，其中最常用的方法有PCR-RFLP分析法。PCR-RFLP法是基于基因突變造成的限制性內切酶識別位點的改變，如位點丟失或產生新位點，通過PCR擴增某一特定片段，再用限制性內切酶酶切擴增產物，電泳觀察片段的大小，這種方法用于檢測酶切位點改變的基因突變，可直接判斷基因型，但該法不能用于沒有產生新酶切位點的基因突變檢測。再次，以上這些方法都存在著檢測通量的局限性，每次只能檢測一種突變類型，不能滿足實際應用的需要。

發明內容
本發明的目的之一是提供⑶Hl基因突變檢測液相芯片，該液相芯片可用于單獨或并行檢測CDHl基因五種常見基因型的D370H、A634V、R732Q、V82fs*13和T263fs*3野生型和突變型。實現上述目的技術方案如下一種⑶Hl基因突變檢測液相芯片，包括有(A).針對CDHl基因不同突變位點分別設計的野生型和突變型的ASPE引物每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為針對D370H位點的SEQ ID NO. 11及SEQ ID NO. 12 ;針對A634V位點的 SEQ ID NO. 13 及 SEQ ID NO. 14 ;針對 R732Q 位點的 SEQ ID NO. 15 及 SEQ ID NO. 16 ;針對 V82fs*13 位點的 SEQ ID NO. 17 及 SEQ ID NO. 18 ;和 / 或針對 T263fs*3 位點的 SEQ IDNO. 19 及 SEQ ID NO. 20 ;所述 tag 序列選自 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 10 ；(B).有ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID NO. 21 SEQ ID NO. 30，且所述ant1-tag序列能相應地與(A)中所選的tag序列互補配對；(C).用于擴增出需要檢測的、具有相應突變位點的目標序列的引物。優選地，所述擴增引物為針對D370H位 點的SEQ ID NO. 31及SEQ ID NO. 32 ;針對 A634V 位點的 SEQ ID NO. 33 及 SEQ ID NO. 34 ;針對 R732Q 位點的 SEQ ID NO. 35 及 SEQID NO. 36 ;針對 V82fs*13 位點的 SEQ ID NO. 37 及 SEQ ID NO. 38 ;和 / 或針對 T263fs*3 位點的 SEQ ID NO. 39 及 SEQ ID NO. 40。 優選地，所述ASPE弓丨物為針對D370H位點的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 11組成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 12組成的序列；針對A634V位點的由SEQ ID NO. 3和SEQ IDN0. 13組成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 14組成的序列；針對R732Q位點的由SEQ IDN0. 5和SEQ ID NO. 15組成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 16組成的序列；針對V82fs*13位點的由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 17組成的序列及由SEQ IDNO. 8和SEQ IDN0. 18組成的序列；和/或針對T263fs*3位點的由SEQ ID NO. 9和SEQ IDNO. 19組成的序列及由SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 20組成的序列。本發明的另一目的是提供用于CDHl基因突變檢測的特異性引物。實現上述目的技術方案如下所述特異性引物序列為針對D370H位點的SEQ IDNO. 11 及 SEQ ID NO. 12 ;針對 A634V 位點的 SEQ ID NO. 13 及 SEQ ID NO. 14 ;針對 R732Q 位點的 SEQ IDN0. 15 及 SEQ ID NO. 16 ;針對 V82fs*13 位點的 SEQ ID NO. 17 及 SEQ ID NO. 18 ；和 / 或針對 T263fs*3 位點的 SEQ ID NO. 19 及 SEQ ID NO. 20。本發明的主要優點在于1.本發明所提供的CDHl基因突變檢測液相芯片的檢測結果與測序法的吻合率高達100%，且檢測所需要的時間遠遠低于常用的測序技術，特別符合實際應用需要。所制備的CDHl基因突變檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設計的探針以及ant1-tag序列之間基本上不存在交叉反應，tag標簽序列、ant1-tag標簽序列的選取以及tag標簽序列與具體ASPE引物的結合，能夠避免交叉反應，實現多個突變位點的并行檢測。2.本發明通過發明人長期積累的設計經驗和大量的實驗操作，從眾多的特異性引物中選取了最優的組合。本發明設計的ASPE引物特異性引物能夠靈敏特異地識別目標檢測的突變位點，準確區分各種型別的基因型；在同一個反應體系中，不同的特異性引物之間、特異性引物與非目標檢測的PCR擴增產物之間基本上不存在交叉反應，檢測特異性好，交叉反應率低于3% ;除了能夠檢測單個位點突變情況，也能夠同時并行檢測多個突變位點的突變情況，檢測效果一致。3.本發明的檢測方法步驟簡單，五種突變位點檢測可通過一步PCR即可完成五條含有突變位點的目標序列的擴增，避免了反復多次PCR等復雜操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準確率，體現了精確的同時定性、定量分析特征。4.本發明不僅克服了傳統固相芯片敏感性不高，檢測結果的可重復性差的缺陷，同時對現有的液相芯片技術進行改進，使得所制備微球能適用于不同的檢測項目，具有很強的拓展性。檢測的熒光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進一步得到提高，信噪比增強，檢測結果更加準確可靠。
具體實施例方式實施例1本實施例所述的⑶Hl基因突變檢測液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物針對CDHl 基因五種常見基因型的 D370H、A634V、R732Q、V82fs*13 和 T263fs*3 的野生型和突變型，分別設計特異性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特異性引物序列”組成。ASPE引物序列如下表所示表I⑶Hl基因的ASPE引物序列(tag序列+特異性引物序列)
權利要求
1.一種⑶Hl基因突變檢測液相芯片，其特征是，包括有 (A).針對CDHl基因不同突變位點分別設計的野生型和突變型的ASPE引物每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為針對D370H位點的SEQ ID NO. 11及SEQ ID NO. 12 ;針對A634V位點的SEQ IDNO. 13 及 SEQ ID NO. 14 ;針對 R732Q 位點的 SEQ ID NO. 15 及 SEQ ID NO. 16 ;針對 V82fs*13位點的 SEQ ID NO. 17 及 SEQ ID NO. 18 ;和 / 或針對 T263fs*3 位點的 SEQ ID NO. 19 及 SEQID NO. 20 ;所述 tag 序列選自 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 10 ； (B).有ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID NO. 21 SEQ ID NO. 30，且所述ant1-tag序列能相應地與(A)中所選的tag序列互補配對； (C).用于擴增出需要檢測的、具有相應突變位點的目標序列的引物。
2.根據權利要求1所述的CDHl基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述擴增引物為針對D370H位點的 SEQ ID NO. 31 及 SEQ ID NO. 32 ;針對A634V位點的 SEQ ID NO. 33 及 SEQIDNO. 34 ;針對 R732Q 位點的 SEQ ID NO. 35 及 SEQ ID NO. 36 ;針對 V82fs*13 位點的 SEQ IDNO. 37 及 SEQ ID NO. 38 ;和 / 或針對 T263fs*3 位點的 SEQ ID NO. 39 及 SEQ ID NO. 40。
3.根據權利要求1所述的CDHl基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述ASPE引物為針對D370H位點的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 11組成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQID NO. 12組成的序列；針對A634V位點的由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 13組成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 14組成的序列；針對R732Q位點的由SEQ ID NO. 5和SEQ IDNO. 15組成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 16組成的序列；針對V82fs*13位點的由SEQ ID NO. 7和SEQ IDNO. 17組成的序列及由SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 18組成的序列；和/或針對T263fs*3位點的由SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 19組成的序列及由SEQ IDNO. 10和SEQ ID NO. 20組成的序列。
4.根據權利要求1所述的CDHl基因突變檢測液相芯片，其特征是， (A).所述ASPE弓丨物為針對D370H位點的由SEQID NO.1和SEQ ID NO. 11組成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 12組成的序列；針對A634V位點的由SEQ ID NO. 3和SEQ IDNO. 13組成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 14組成的序列；針對R732Q位點的由SEQID NO. 5和SEQ ID NO. 15組成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 16組成的序列；針對V82fs*13位點的由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 17組成的序列及由SEQ ID NO. 8和SEQ IDNO. 18組成的序列；和針對T263fs*3位點的由SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 19組成的序列及由SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 20組成的序列； (B).有ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID NO. 21 SEQ ID NO. 30，且所述ant1-tag序列能相應地與(A)中所選的tag序列互補配對； (C).所述擴增引物為:針對D370H位點的SEQID NO. 31及SEQ ID NO. 32 ;針對A634V位點的 SEQ ID NO. 33及 SEQ ID NO. 34 ;針對R732Q位點的 SEQ ID NO. 35及 SEQ ID NO. 36 ；針對 V82fs*13 位點的 SEQ ID NO. 37 及 SEQ ID NO. 38 ;和針對 T263fs*3 位點的 SEQ IDNO. 39 及 SEQID NO. 40。
5.根據權利要求1-4任一項所述的CDHl基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述間隔臂為5-10個T。
6.用于⑶Hl基因突變檢測的特異性引物，其特征是，針對D370H位點的SEQ ID NO. 11及 SEQID NO. 12 ;針對 A634V 位點的 SEQ ID NO. 13 及 SEQ ID NO. 14 ;針對 R732Q 位點的 SEQIDNO. 15 及 SEQ ID NO. 16 ;針對 V82fs*13 位點的 SEQ ID NO. 17 及 SEQ ID NO. 18 ;和 / 或針對 T263fs*3 位點的 SEQ ID NO. 19 及 SEQ ID NO. 20。
全文摘要
本發明公開了一種CDHl基因檢測特異性引物和液相芯片，該液相芯片主要包括有每種由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成的ASPE引物，所述特異性引物序列為針對D370H位點的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12；針對A634V位點的SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14；針對R732Q位點的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16；針對V82fs*13位點的SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18；和/或針對T263fs*3位點的SEQ IDNO.19及SEQ ID NO.20；有anti-tag序列包被的微球；擴增引物。本發明所提供的檢測液相芯片的檢測結果與測序法的吻合率高達100％，實現多個突變位點的野生型和突變型并行檢測。
文檔編號C12Q1/68GK103031371SQ20111030196
公開日2013年4月10日 申請日期2011年9月30日 優先權日2011年9月30日
發明者許嘉森, 何嘉英, 陳家欣 申請人:廣州益善生物技術有限公司