專利名稱：神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法
技術領域：
本發明涉及利用特定微生物，以食品加工業等的副產物豆渣作為培養基的主原料，制造能夠促進皮膚產生神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的方法。
背景技術：
神經鞘脂類之一的神經酰胺(Ceramide)存在于皮膚角質層中，占角質層中細胞間脂質的50%左右。神經鞘脂類(Sphingolipid)是具有鞘氨醇骨架的復合脂質的總稱。葡萄糖神經酰胺(Glucosylceramide)是在神經酰胺上結合了葡萄糖而成的一種神經鞘脂類。由表皮細胞合成得到的神經酰胺暫時以葡萄糖神經酰胺或者神經鞘磷脂(Sphingomyelin)的形式被儲存起來；之后被排出至細胞外，在葡糖腦苷酯酶(Glucocerebrosidase)和神經磷脂酶(Sphingomyelinase)的作用下,再次成為神經酰胺，從而發揮作為細胞間脂質的功能。一直以來，已知神經酰胺、葡萄糖神經酰胺、半乳糖神經酰胺等神經鞘脂類具有促進角質層的保持水分能力、改善皮膚粗糙等效果(專利文獻I 2)。雖然皮膚具有產生神經酰胺和葡萄糖神經酰胺的能力，但是這種能力并不充分，因而人們也嘗試了從外部補充神經酰胺的方法。但是該方法的長期效果得不到認可，且存在穩定性低等問題。例如，報道了利用熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) JPCCY0004株(NITEP-570)來制造葡萄糖神經酰胺的方法(專利文獻3)。但是，該方法并不是關于神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的方法，而只不過是將培養后的菌體中大量存在的葡萄糖神經酰胺直接提取的方法；而且，通過該方法合成得到的葡萄糖神經酰胺的神經酰胺骨架與人體中存在的神經酰胺類的神經酰胺骨架不同，其在兩處具有碳碳雙鍵且具有支鏈。因而，將這種葡萄糖神經酰胺涂布在人體皮膚上的話，有可能不能與人體皮膚相適應而產生使用安全性方面的問題。

而另一方面，如果能夠增強或促進皮膚本身的神經酰胺或葡萄糖神經酰胺的產生能力，則無需從外部補充神經酰胺或葡萄糖神經酰胺，而能夠通過促進皮膚自身產生神經酰胺或葡萄糖神經酰胺來提高皮膚的屏障功能和保濕功能。這樣，由于是由皮膚自身產生神經酰胺或葡萄糖神經酰胺，因而不存在與皮膚的適應性不好等安全性方面的問題。因此，近年來，關于在皮膚角質層中以促進表皮神經酰胺產生為目的的物質的生產研究相當熱門。作為促進神經酰胺產生的物質，已報道的有以靈芝、蜂花粉(BeePollen)、川芎等的提取物為有效成分的神經酰胺產生促進劑(專利文獻4 6)。然而，由于這些神經酰胺產生促進劑全都是從植物原料提取得到，該提取操作耗費時間長，且由于天然資源的利用可能性有限等原因，其制造成本高。另外，也報道了以含有煙酸和/或煙酰胺的乳酸菌培養物或者酵母菌培養物為有效成分的神經酰胺合成促進劑(專利文獻7)。然而，從專利文獻7的實施例可以看出，不含有煙酸和/或煙酰胺的乳酸菌培養物或者酵母菌培養物(比較例I 4)的神經酰胺產生量較之對照組并無明顯變化，因而該神經酰胺合成促進劑實質上含有煙酸和/或煙酰胺作為有效成分，其神經酰胺合成促進效果還不夠充分，尚有改善的余地。并且，由于使用煙酸或煙酰胺，因而其制造成本較高。另夕卜，已知解脂亞羅酵母(Yarrowia Iipolytica)等亞羅酵母屬(Yarrowia)的微生物，對于多不飽和脂肪酸(PUFA)的生成尤為有用。但是，目前還沒有利用亞羅酵母屬(Yairowia)的微生物來制造神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的報道。專利文獻1:日本特開昭61-260008號公報專利文獻2 :日本特開昭61-271205號公報專利文獻3 :日本特開2010-22217號公報專利文獻4 :日本特開2005-194240號公報專利文獻5 :日本特開2010-70499號公報專利文獻6 :日本特開2010-150237號公報專利文獻7 :日本特開平9-194383號公報

發明內容

針對上述現有技術中存在的技術問題，本發明人進行了悉心研究，結果發現在含有豆渣和糖類的培養基中培養亞羅酵母屬(Yairowia)的微生物，特別是培養解脂亞羅酵母(Yarrowia lipolytica),能夠低成本且高效地獲得神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑，從而完成本發明。本發明涉及提供一種神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法，其中，在含有豆渣和糖類的培養基中培養亞羅酵母屬(Yairowia)的微生物，從其上清液中獲得神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑。本發明還涉及，提供豆渣的亞羅酵母屬(Yairowia)的發酵提取物用于促進神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺的產生的用途。本發明還涉及，提供豆渣的亞羅酵母屬(Yairowia)的發酵提取物作為神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的用途。本發明還涉及，提供豆渣的亞羅酵母屬(Yairowia)的發酵提取物在制造神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑中的用途。發明效果根據本發明的制造方法，能夠利用特定微生物，以食品加工業等的副產物豆渣作為培養基的主原料，低成本且高效地獲得神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑，該促進劑能夠有效提高皮膚所具有的產生神經酰胺/葡萄糖神經酰胺的能力，從而有效提高皮膚的保濕能力。
具體實施例方式(可以用于神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑制造的微生物)作為在本發明中使用的亞羅酵母屬(Yairowia)的微生物，可以列舉出解脂亞羅酵母(Yarrowia lipolytica)或根據通常方法得到的解脂亞羅酵母(Yarrowialipolytica)等微生物的變異株。這些微生物如下所述發揮作用，通過在含有豆渣和糖類的培養基中培養，從而從其上清液中可以得到提高表皮細胞的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生能力的物質。其中，從所獲得的產品具有更高的神經酰胺產生促進效果和葡萄糖神經酰胺產生促進效果的觀點出發，優選解脂亞羅酵母(Yarrowia lipolytica),其同物異名/ 曾用名有解脂假絲酵母(Candida lipolytica)、(Candida paralipolytica)、解脂復膜抱酵母(Saccharomycopsis lipolytica)、解脂擬內抱霉(Endomycopsis lipolytica)、畸形假念珠菌(Pseudomonilia deformans)。本發明所涉及的亞羅酵母屬(Yairowia)的微生物都可以從中國普通微生物保藏管理中心(CGMCC)、中國典型培養物保藏中心(CCTCC)、江南大學工業微生物資源和信息中心(CICM)等商業渠道購買得到。(神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法)本發明的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法通過在含有豆渣和糖類的培養基中，培養上述微生物，并從其上清液中獲得神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑。該方法的具體步驟如下所示。<培養基>在本發明中，優選在液體培養基中培養上述微生物中的I種或2種以上。在本發明中，液體培養基的主要成分是豆渣和糖類。也可以適當添加蛋白胨、酵母粉。由于豆渣和糖類都是容易獲得的物質，因而，本發明的培養基具有成本低的優點。其中，豆渣是指，將大豆浸泡在水中使其充分吸收水分后，再經粉碎、過濾除去水而得到的物質；也可以使用食品產業中壓榨豆漿等的豆制品制造后剩下的豆渣。作為糖類，可以單 獨使用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖等中的任意一種，或者混合使用。從提高發酵生產性和利用性的觀點出發，其中優選葡萄糖。在本發明中，為了提高神經酰胺產生促進效果和/或葡萄糖神經酰胺產生促進效果，本發明的培養基優選由豆渣、葡萄糖和水構成，進一步優選培養基中的豆渣的含量為5 20w/v%、更優選為8 12w/v%，葡萄糖的含量為O. 2 2w/v%、更優選為O. 8 1. 2w/
。下面，將上述這種用于制造神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的培養基稱為“神經酰胺/葡萄糖神經酰胺產生促進劑制造培養基”。<培養條件>將上述微生物的菌體直接接種到神經酰胺/葡萄糖神經酰胺產生促進劑制造培養基中。作為用于制造神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的培養條件，從最優化亞羅酵母屬(Yairowia)的微生物的成長所必需的溫度、時間，以及提高神經酰胺產生促進效果和葡萄糖神經酰胺產生促進效果的觀點出發，優選在20 40°C、更優選在27 35°C的培養溫度下，培養I 7天，優選培養48 96小時，更優選培養68 76小時。<神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的回收、精制>從上述培養獲得的培養液中回收、精制神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進齊U，可以根據需要，適當地組合過濾、離心分離、離子交換或吸附色譜、溶劑提取、結晶化等通常的操作。具體而言，例如，可以通過離心分離從培養液中除去菌體，再超聲波處理，回收離心后的上清液。接著，再將回收后的上清液過濾除去雜質等，真空下干燥處理后得到豆渣發酵提取物作為本發明的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑。如下述實施例所示，通過培養本發明的亞羅酵母屬(Yairowia)的微生物并從培養上清液中得到的豆渣發酵提取物，在正常人體的角化細胞中具有使神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺的量增加的作用。因此，通過培養本發明的亞羅酵母屬(Yairowia)的微生物并從培養上清液中得到的豆渣發酵提取物，可以作為神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑使用，或者用于制造神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑。該神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑可以作為使角質層中的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺增加，并恢復或維持皮膚的屏障功能和保濕功能的醫藥品、準醫藥品、化妝品等使用。另外，該神經酰胺產生促進劑或葡萄糖神經酰胺產生促進劑也可以作為以神經酰胺產生促進或葡萄糖神經酰胺產生促進為概念的、并根據需要標明該概念的準醫藥品、化妝品使用。作為本發明的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的使用形態，可以作為添加到培養細胞中的添加劑，或者制成洗凈劑、化妝品等皮膚外用劑，根據使用方法可以以化妝水、乳液、凝膠、霜、軟膏、粉末、顆粒等形態提供。在配制各種皮膚外用劑時，可以單獨地使用本發明的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑，或適當組合在洗凈劑和化妝品等皮膚外用劑中通常配合的油性成分、保濕劑、粉體、色素、乳化劑、增溶劑、紫外線吸收齊U、增稠劑、藥效成分、香料、防菌防霉劑、植物提取物、醇類等使用。在將本發明的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑添加到培養的表皮細胞中來促進神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺的情況下，作為本發明的豆渣發酵提取物(換算為干燥固體成分)，其添加量優選為0. 0001 10w/v%，更優選為0. 001 5w/v%。當添加量大于0. 0001w/v%時,能得到充分的促進效果；而當添加量小于10w/v%時,對表皮細胞的刺激性更小。在將本發明的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑配合在皮膚外用劑使用時，從有效促進神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺的產生、從而有效提高皮膚的保濕能力、而且不易顯示出培養物的顏色和氣味的觀點出發，作為豆渣發酵提取物的干燥固體成分，其配合量優選為皮膚外用劑總量的O. 01 20w/v%，更優選為O.1 10w/v%。實施例下面，基于實施例對本發明進行更詳細的說明，但本發明并不限定于此。實施例1(神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造)作為從豆渣制造神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的微生物，使用解脂亞羅酵母(Yarrowia lipolytica)(從江南大學購入,并保藏于中國高校工業微生物資源和信息中心CICM，保藏編號CICMY0311)。將在YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)培養基中 30°C下培養后得到的上述菌株接種到含有神經酰胺/葡萄糖神經酰胺產生促進劑制造培養基IOOml的三角燒瓶(容量300ml)中，在30°C下培養72小時。該培養基含有10w/v%豆渣和lw/v%葡萄糖。其中，豆渣的制備通過將大豆放入水中浸泡12小時，使大豆充分吸收水分，然后將吸收了水分的大豆研磨破碎，過濾并除去液體成分后，將剩余殘渣浙干來得到。然后，為了從得到的培養液中回收神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑，以3000rpm離心分離10分鐘除去菌體，回收離心分離后的上清液，在回收后的培養上清液中加入2. 5倍的無水乙醇，接著，再用超聲波處理裝置(Branson公司制造)處理10分鐘，以3000rpm離心分離30分鐘，回收上清液。用濾紙過濾該上清液約70ml，再在40°C以下真空干燥機中干燥該過濾液至恒重，得到豆渣發酵提取物，作為本發明的神經酰胺/葡萄糖神經酰胺產生促進劑。進而，用50V/V%乙醇溶解該豆渣發酵提取物，調整其濃度為1 /ν%后，保存在4°C下，用于之后的神經酰胺/葡萄糖神經酰胺產生促進試驗。(神經酰胺/葡萄糖神經酰胺產生促進試驗)< 角質細胞(Keratinocytes)培養 >首先，取正常人的活化角質化細胞(Cascade Co.，Ltd)作為原代細胞，于75cm2培養瓶中(含有生長因子的培養基2ml)，在37°C、C02濃度為5%的條件下進行細胞培養，直至培養到細胞聚集密度(confluence)為80 90%。再傳代細胞至175cm2方瓶中繼續培養細胞至80 90%濃度。然后以IX IO5個細胞/ml傳代至12孔板(每孔容積為2ml)中，繼續培養細胞至80 90%濃度。然后，更換不含有生長因子的培養基，在上述12孔板中(η = 2)分別以20 μ I/孔的量添加上述實施例1中得到的豆渣發酵提取物的乙醇水溶液。另外，只添加50v/v%乙醇(沒有添加神經酰胺/葡萄糖神經酰胺產生促進劑)作為對照品，相同培養條件下培養72小時。培養72小時后，棄去上清培養液，

用2ml PBS (磷酸鹽緩沖液)清洗細胞兩次，再加入Iml PBS至板孔中，以細胞收集器(細胞鏟)收集細胞至試管中，以備后續神經酰胺/葡萄糖神經酰胺和蛋白質分析。<脂質提取>脂質提取采用Bligh & Dyer法進行。具體而言，首先，在上述回收得到的含細胞的PBS液中加入甲醇氯仿=2. 5ml 1. 25ml的溶劑，振蕩混合20分鐘，進行離心分離(3000rpm, 5分鐘)，從而得到上清液和沉淀。將上清液A轉移至另外試管中用于神經酰胺/葡萄糖神經酰胺量的分析，將沉淀B用于蛋白質含量的分析。〈蛋白質含量分析〉為了表征細胞中的神經酰胺/葡萄糖神經酰胺量，進行蛋白質含量分析。在上述回收的沉淀B中加入900 μ I的SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液并進行混合，在60°C水浴下加熱2小時使蛋白質變性降解，冷卻后在其中添加100 μ I的2N HCl溶液，按照BCAKit (BCA蛋白濃度測定試劑盒)法測定其中蛋白質的量(記為Pro，單位為yg/ml)。<神經酰胺/葡萄糖神經酰胺量分析>在殘留的上清液A中加入PBS :氯仿=1.25ml 1. 25ml的溶劑，振蕩混合20分鐘，3000rpm進行離心分離5分鐘，分離、回收作為下相的氯仿層，并在30°C、氮氣保護下干燥氯仿層40分鐘得到干燥品，加入100 μ I的氯仿甲醇=2. 5ml 1. 25ml的溶劑進行溶解，并用下述薄板層析(TLC)法對神經酰胺和葡萄糖神經酰胺的量(分別記為Cer和GlyCer,單位為μ g/ml)進行定量。采用干燥TLC板，以氯仿甲醇醋酸(190 9 lv/v/v)為展層劑進行薄板層析，待展層劑行至薄板頂端，以吹風機吹干展層劑；重復以上步驟一次。然后以氯仿甲醇丙酮(76 20 4v/v/v)為展層劑進行薄板層析，待展層劑行至距薄板底端2. 5cm處，停止展層，以吹風機吹干。噴以硫酸銅磷酸溶液，吹干，將層析板放置于180°C烘烤板上烘烤7分鐘顯色。掃描顯色TLC板并進行神經酰胺(或葡萄糖神經酰胺)分析。然后，根據下述公式(1)，將所得值分別除以各自的蛋白質含量，得到Cer/Pix)和GlyCer/Pro。以對照品的 Cer/Pro 和 GlyCer/Pro 為 1，求出本發明的 Cer/Pro 和 GlyCer/Pro的相對值。并且，以對照品每孔中的蛋白質的量為100，求出每孔中的神經酰胺和葡萄糖神經酰胺的量(分別記為Cer/Well和GlyCer/Well，相對于對照品的相對量)。一并在表I中表不。公式(I)Cer/Pro =神經酰胺量(μ g/ml) /蛋白質含量(μ g/ml)GlyCer/Pro =葡萄糖神經酰胺量(μ g/ml) /蛋白質含量(μ g/ml)表I
權利要求
1.一種神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法，其中， 在含有豆渣和糖類的培養基中培養亞羅酵母屬(Yairowia)的微生物，從其上清液中獲得神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑。
2.如權利要求1所述的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法，其中， 所述亞羅酵母屬(Yarrowia)的微生物是解脂亞羅酵母(Yarrowia Iipolytica)。
3.如權利要求1所述的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法，其中， 所述糖類是葡萄糖。
4.如權利要求3所述的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法，其中， 所述培養基由豆渣、葡萄糖和水構成。
5.如權利要求4所述的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法，其中， 所述培養基中所述豆洛的含量為8 12w/v%,所述糖類的含量為O. 8 1. 2w/v%。
6.如權利要求1所述的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法，其中， 所述培養溫度為27 35°C。
7.如權利要求1所述的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法，其中， 所述培養時間為I 7天。
8.如權利要求1所述的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法，其中， 將通過所述培養獲得的培養液進行離心，從而得到所述上清液。
9.如權利要求8所述的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法，其中， 在離心后獲得的所述上清液中加入乙醇后，進一步經超聲波處理、離心分離、過濾、真空干燥處理進行精制后，得到神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑。
10.豆渣發酵提取物用于促進神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺的產生的非治療目的的用途， 所述豆渣發酵提取物是在含有豆渣的培養基中培養亞羅酵母屬(Yairowia)的微生物得到的。
11.豆渣發酵提取物作為神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的非治療目的的用途， 所述豆渣發酵提取物是在含有豆渣的培養基中培養亞羅酵母屬(Yairowia)的微生物得到的。
12.豆渣發酵提取物在制造神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑中的用途， 所述豆渣發酵提取物是在含有豆渣的培養基中培養亞羅酵母屬(Yairowia)的微生物得到的。
13.如權利要求10 12中任意一項所述的用途，其中， 所述亞羅酵母屬(Yarrowia)的微生物是解脂亞羅酵母(Yarrowia lipolytica)。
全文摘要
本發明提供一種神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法，其中，在含有豆渣和糖類的培養基中培養亞羅酵母屬(Yarrowia)的微生物，從其上清液中獲得神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑。根據本發明的制造方法，能夠利用特定微生物，以食品加工業等的副產物豆渣作為培養基的主原料，從而低成本且高效地獲得神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑。
文檔編號C12P1/02GK103060385SQ201110317308
公開日2013年4月24日 申請日期2011年10月18日 優先權日2011年10月18日
發明者孔凡旗 申請人:花王株式會社