專利名稱：神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用特定微生物，以食品加工業(yè)等的副產(chǎn)物豆渣作為培養(yǎng)基的主原料，制造能夠促進(jìn)皮膚產(chǎn)生神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)鞘脂類之一的神經(jīng)酰胺(Ceramide)存在于皮膚角質(zhì)層中，占角質(zhì)層中細(xì)胞間脂質(zhì)的50%左右。神經(jīng)鞘脂類(Sphingolipid)是具有鞘氨醇骨架的復(fù)合脂質(zhì)的總稱。葡萄糖神經(jīng)酰胺(Glucosylceramide)是在神經(jīng)酰胺上結(jié)合了葡萄糖而成的一種神經(jīng)鞘脂類。由表皮細(xì)胞合成得到的神經(jīng)酰胺暫時(shí)以葡萄糖神經(jīng)酰胺或者神經(jīng)鞘磷脂(Sphingomyelin)的形式被儲(chǔ)存起來；之后被排出至細(xì)胞外，在葡糖腦苷酯酶(Glucocerebrosidase)和神經(jīng)磷脂酶(Sphingomyelinase)的作用下,再次成為神經(jīng)酰胺，從而發(fā)揮作為細(xì)胞間脂質(zhì)的功能。

一直以來，已知神經(jīng)酰胺、葡萄糖神經(jīng)酰胺、半乳糖神經(jīng)酰胺等神經(jīng)鞘脂類具有促進(jìn)角質(zhì)層的保持水分能力、改善皮膚粗糙等效果(專利文獻(xiàn)I 2)。雖然皮膚具有產(chǎn)生神經(jīng)酰胺和葡萄糖神經(jīng)酰胺的能力，但是這種能力并不充分，因而人們也嘗試了從外部補(bǔ)充神經(jīng)酰胺的方法。但是該方法的長期效果得不到認(rèn)可，且存在穩(wěn)定性低等問題。例如，報(bào)道了利用熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) JPCCY0004株(NITE P-570)來制造葡萄糖神經(jīng)酰胺的方法(專利文獻(xiàn)3)。但是，該方法并不是關(guān)于神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的方法，而只不過是將培養(yǎng)后的菌體中大量存在的葡萄糖神經(jīng)酰胺直接提取的方法；而且，通過該方法合成得到的葡萄糖神經(jīng)酰胺的神經(jīng)酰胺骨架與人體中存在的神經(jīng)酰胺類的神經(jīng)酰胺骨架不同，其在兩處具有碳碳雙鍵且具有支鏈。因而，將這種葡萄糖神經(jīng)酰胺涂布在人體皮膚上的話，有可能不能與人體皮膚相適應(yīng)而產(chǎn)生使用安全性方面的問題。而另一方面，如果能夠增強(qiáng)或促進(jìn)皮膚本身的神經(jīng)酰胺或葡萄糖神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生能力，則無需從外部補(bǔ)充神經(jīng)酰胺或葡萄糖神經(jīng)酰胺，而能夠通過促進(jìn)皮膚自身產(chǎn)生神經(jīng)酰胺或葡萄糖神經(jīng)酰胺來提高皮膚的屏障功能和保濕功能。這樣，由于是由皮膚自身產(chǎn)生神經(jīng)酰胺或葡萄糖神經(jīng)酰胺，因而不存在與皮膚的適應(yīng)性不好等安全性方面的問題。因此，近年來，關(guān)于在皮膚角質(zhì)層中以促進(jìn)表皮神經(jīng)酰胺產(chǎn)生為目的的物質(zhì)的生產(chǎn)研究相當(dāng)熱門。作為促進(jìn)神經(jīng)酰胺產(chǎn)生的物質(zhì)，已報(bào)道的有以靈芝、蜂花粉(BeePollen)、川芎等的提取物為有效成分的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑(專利文獻(xiàn)4 6)。然而，由于這些神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑全都是從植物原料提取得到，該提取操作耗費(fèi)時(shí)間長，且由于天然資源的利用可能性有限等原因，其制造成本高。另外，也報(bào)道了以含有煙酸和/或煙酰胺的乳酸菌培養(yǎng)物或者酵母菌培養(yǎng)物為有效成分的神經(jīng)酰胺合成促進(jìn)劑(專利文獻(xiàn)7)。然而，從專利文獻(xiàn)7的實(shí)施例可以看出，不含有煙酸和/或煙酰胺的乳酸菌培養(yǎng)物或者酵母菌培養(yǎng)物(比較例I 4)的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生量較之對(duì)照組并無明顯變化，因而該神經(jīng)酰胺合成促進(jìn)劑實(shí)質(zhì)上含有煙酸和/或煙酰胺作為有效成分，其神經(jīng)酰胺合成促進(jìn)效果還不夠充分，尚有改善的余地。并且，由于使用煙酸或煙酰胺，因而其制造成本較高。另外，已知擲孢酵母屬(Sporobolomyces)的微生物在菌體內(nèi)蓄積輔酶QlO等產(chǎn)業(yè)上有用。另外，擲孢酵母屬(Sporobolomyces)的微生物還作為類胡蘿卜素類、L-肉堿等有用物質(zhì)的生產(chǎn)菌備受關(guān)注。但是，目前還沒有利用擲孢酵母屬(Sporobolomyces)的微生物來制造神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的報(bào)道。專利文獻(xiàn)1:日本特開昭61-260008號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 :日本特開昭61-271205號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3 :日本特開2010-22217號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4 :日本特開2005-194240號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)5 :日本特開2010-70499號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)6 :日本特開2010-150237號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)7 :日本特開平9-194383號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明人進(jìn)行了悉心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在含有豆洛和糖類的培養(yǎng)基中培養(yǎng)擲孢酵母屬(Sporobolomyces)的微生物,特別是培養(yǎng)粉紅擲孢酵母(Sporobolomy ces roseus),能夠低成本且高效地獲得神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑，從而完成本發(fā)明。本發(fā)明涉及提供一種神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法，其中，在含有豆洛和糖類的培養(yǎng)基中培養(yǎng)擲孢酵母屬(Sporobolomyces)的微生物,從其上清液中獲得神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑。本發(fā)明還涉及，提供豆渣的擲孢酵母屬(SpOTobolomyces)的發(fā)酵提取物用于促進(jìn)神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生的用途。本發(fā)明還涉及，提供豆渣的擲孢酵母屬(SpOTobolomyces)的發(fā)酵提取物作為神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的用途。本發(fā)明還涉及,提供豆洛的擲孢酵母屬(Sporobolomyces)的發(fā)酵提取物在制造神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑中的用途。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明的制造方法，能夠利用特定微生物，以食品加工業(yè)等的副產(chǎn)物豆渣作為培養(yǎng)基的主原料，低成本且高效地獲得神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑，該促進(jìn)劑能夠有效提高皮膚所具有的產(chǎn)生神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺的能力，從而有效提高皮膚的保濕能力。
具體實(shí)施例方式(可以用于神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑制造的微生物)作為在本發(fā)明中使用的擲孢酵母屬(Sporobolomyces)的微生物,可以列舉出從食品領(lǐng)域使用的粉紅擲孢酵母(Sporobolomyces roseus)、赭色擲孢酵母(Sporobolomycessalmonicolor)或深紅擲孢酵母(Sporobolomyces ruber)等中選出的至少I種微生物；還包括根據(jù)通常方法得到的這些微生物的變異株。這些微生物如下所述發(fā)揮作用，通過在含有豆渣和糖類的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從而從其上清液中可以得到提高表皮細(xì)胞的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生能力的物質(zhì)。其中，從所獲得的產(chǎn)品具有更高的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果和葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選粉紅擲孢酵母(Sporobolomycesroseus)。本發(fā)明所涉及的擲孢酵母屬(Sporobolomyces)的微生物都可以從中國普通微生物保藏管理中心(CGMCC)、中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)、江南大學(xué)工業(yè)微生物資源和信息中心(CICM)等商業(yè)渠道購買得到。(神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法)本發(fā)明的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法通過在含有豆渣和糖類的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)上述微生物，并從其上清液中獲得神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑。該方法的具體步驟如下所示。<培養(yǎng)基>在本發(fā)明中，優(yōu)選在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述微生物中的I種或2種以上。在本發(fā)明中，液體培養(yǎng)基的主要成分是豆渣和糖類。也可以適當(dāng)添加蛋白胨、酵母粉。由于豆渣和糖類都是容易獲得的物質(zhì)，因而，本發(fā)明的培養(yǎng)基具有成本低的優(yōu)點(diǎn)。其中，豆渣是指，將大 豆浸泡在水中使其充分吸收水分后，再經(jīng)粉碎、過濾除去水而得到的物質(zhì)；也可以使用食品產(chǎn)業(yè)中壓榨豆?jié){等的豆制品制造后剩下的豆渣。作為糖類，可以單獨(dú)使用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖等中的任意一種，或者混合使用。從提高發(fā)酵生產(chǎn)性和利用性的觀點(diǎn)出發(fā)，其中優(yōu)選葡萄糖。在本發(fā)明中，為了提高神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果，本發(fā)明的培養(yǎng)基優(yōu)選由豆渣、葡萄糖和水構(gòu)成，進(jìn)一步優(yōu)選培養(yǎng)基中的豆渣的含量為5 20w/v%、更優(yōu)選為8 12w/v%，葡萄糖的含量為0. 2 2w/v%、更優(yōu)選為0. 8 1. 2w/
。下面，將上述這種用于制造神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的培養(yǎng)基稱為“神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑制造培養(yǎng)基”。<培養(yǎng)條件>將上述微生物的菌體直接接種到神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑制造培養(yǎng)基中。作為用于制造神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的培養(yǎng)條件，從最優(yōu)化擲孢酵母屬(Sporobolomyces)微生物的成長所必需的溫度、時(shí)間，以及提高神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果和葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)效果的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選在20 40°C、更優(yōu)選在27 350C的培養(yǎng)溫度下，培養(yǎng)I 7天，優(yōu)選培養(yǎng)48 96小時(shí)，更優(yōu)選培養(yǎng)68 76小時(shí)。<神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的回收、精制>從上述培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)液中回收、精制神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)齊U，可以根據(jù)需要，適當(dāng)?shù)亟M合過濾、離心分離、離子交換或吸附色譜、溶劑提取、結(jié)晶化等通常的操作。具體而言，例如，可以通過離心分離從培養(yǎng)液中除去菌體，再超聲波處理，回收離心后的上清液。接著，再將回收后的上清液過濾除去雜質(zhì)等，真空下干燥處理后得到豆渣發(fā)酵提取物作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑。如下述實(shí)施例所示,通過培養(yǎng)本發(fā)明的擲孢酵母屬(Sporobolomyces)微生物并從培養(yǎng)上清液中得到的豆渣發(fā)酵提取物，在正常人體的角化細(xì)胞中具有使神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺的量增加的作用。因此,通過培養(yǎng)本發(fā)明的擲孢酵母屬(Sporobolomyces)微生物并從培養(yǎng)上清液中得到的豆渣發(fā)酵提取物，可以作為神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑使用，或者用于制造神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑。該神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑可以作為使角質(zhì)層中的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺增加，并恢復(fù)或維持皮膚的屏障功能和保濕功能的醫(yī)藥品、準(zhǔn)醫(yī)藥品、化妝品等使用。另外，該神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑也可以作為以神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)為概念的、并根據(jù)需要標(biāo)明該概念的準(zhǔn)醫(yī)藥品、化妝品使用。作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的使用形態(tài)，可以作為添加到培養(yǎng)細(xì)胞中的添加劑，或者制成洗凈劑、化妝品等皮膚外用劑，根據(jù)使用方法可以以化妝水、乳液、凝膠、霜、軟膏、粉末、顆粒等形態(tài)提供。在配制各種皮膚外用劑時(shí)，可以單獨(dú)地使用本發(fā)明的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑，或適當(dāng)組合在洗凈劑和化妝品等皮膚外用劑中通常配合的油性成分、保濕劑、粉體、色素、乳化劑、增溶劑、紫外線吸收齊U、增稠劑、藥效成分、香料、防菌防霉劑、植物提取物、醇類等使用。在將本發(fā)明的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑添加到培養(yǎng)的表皮細(xì)胞中來促進(jìn)神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺的情況下，作為本發(fā)明的豆渣發(fā)酵提取物(換算為干燥固體成分)，其添加量優(yōu)選為0. 0001 10w/v%，更優(yōu)選為0. 001 5w/v%。當(dāng)添加量大于0. 0001 7^%時(shí),能得到充分的促進(jìn)效果；而當(dāng)添加量小于10 7^%時(shí),對(duì)表皮細(xì)胞的刺激性更小。在將本發(fā)明的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑配合在皮膚外用劑使用時(shí)，從有效促進(jìn)神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生、從而有效提高皮膚的保濕能力、而且不易顯示出培養(yǎng)物的顏 色和氣味的觀點(diǎn)出發(fā)，作為豆渣發(fā)酵提取物的干燥固體成分，其配合量優(yōu)選為皮膚外用劑總量的0. 01 20w/v%，更優(yōu)選為0.1 10w/v%。實(shí)施例下面，基于實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不限定于此。實(shí)施例1(神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造)作為從豆渣制造神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的微生物，使用粉紅擲孢酵母(Sporobolomyces roseus)(從江南大學(xué)購入,并保藏于中國高校工業(yè)微生物資源和信息中心CICM，保藏編號(hào)CICM Y0247)。將在YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)培養(yǎng)基中 30°C下培養(yǎng)后得到的上述菌株接種到含有神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑制造培養(yǎng)基IOOml的三角燒瓶(容量300ml)中，在30°C下培養(yǎng)72小時(shí)。該培養(yǎng)基含有10w/v%豆渣和lw/v%葡萄糖。其中，豆渣的制備通過將大豆放入水中浸泡12小時(shí)，使大豆充分吸收水分，然后將吸收了水分的大豆研磨破碎，過濾并除去液體成分后，將剩余殘?jiān)愀蓙淼玫健Ｈ缓螅瑸榱藦牡玫降呐囵B(yǎng)液中回收神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑，以3000rpm離心分離10分鐘除去菌體，回收離心分離后的上清液，在回收后的培養(yǎng)上清液中加入2. 5倍的無水乙醇，得到本發(fā)明的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的粗品(本發(fā)明品A)，保存在4°C下，用于之后的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)試驗(yàn)。實(shí)施例2作為從豆渣制造神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的微生物，使用粉紅擲孢酵母(Sporobolomyces roseus)(從江南大學(xué)購入,并保藏于中國高校工業(yè)微生物資源和信息中心CICM，保藏編號(hào)CICM Y0193)。采用與實(shí)施例1相同的方法得到本發(fā)明的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的粗品，接著，再用超聲波處理裝置(Branson公司制造)處理該粗品10分鐘，以3000rpm離心分離30分鐘，回收上清液。用濾紙過濾該上清液約70ml，再在40°C以下真空干燥機(jī)中干燥該過濾液至恒重，得到作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的豆渣發(fā)酵提取物。進(jìn)而，用50V/V%乙醇溶解該豆渣發(fā)酵提取物，調(diào)整其濃度為0. lw/v% (本發(fā)明品B)后，保存在4°C下，用于之后的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)試驗(yàn)。實(shí)施例3作為從豆渣制造神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的微生物，使用粉紅擲孢酵母(Sporobolomyces roseus)(從江南大學(xué)購入，并保藏于中國高校工業(yè)微生物資源和信息中心CICM，保藏編號(hào)CICM Y0132)。采用與實(shí)施例1相同的方法得到本發(fā)明的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的粗品(本發(fā)明品C)，接著，再用超聲波處理裝置(Branson公司制造)處理該粗品10分鐘，以3000rpm離心分離30分鐘，回收上清液。用濾紙過濾該上清液約70ml，再在40°C以下真空干燥機(jī)中干燥該過濾液至恒重，得到作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的豆渣發(fā)酵提取物。進(jìn)而，用50V/V%乙醇溶解該豆渣發(fā)酵提取物，調(diào)整其濃度為lW/v% (本發(fā)明品D)后，保存在4°C下，用于之后的 神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)試驗(yàn)。(神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)試驗(yàn))< 角質(zhì)細(xì)胞(Keratinocytes)培養(yǎng) >首先，取正常人的活化角質(zhì)化細(xì)胞(Cascade Co.，Ltd)作為原代細(xì)胞，于75cm2培養(yǎng)瓶中(含有生長因子的培養(yǎng)基2ml)，在37°C、C02濃度為5%的條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，直至培養(yǎng)到細(xì)胞聚集密度(confluence)為80 90%。再傳代細(xì)胞至175cm2方瓶中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至80 90%濃度。然后以IX IO5個(gè)細(xì)胞/ml傳代至12孔板(每孔容積為2ml)中，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至80 90%濃度。然后，更換不含有生長因子的培養(yǎng)基，在上述12孔板中(n = 2)分別以20iU/孔的量添加上述實(shí)施例1 3中得到的豆渣發(fā)酵提取物的乙醇水溶液。另外，只添加50v/v%乙醇(沒有添加神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑)作為對(duì)照品，相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)72小時(shí)后，棄去上清培養(yǎng)液，用2ml PBS (磷酸鹽緩沖液)清洗細(xì)胞兩次，再加入Iml PBS至板孔中，以細(xì)胞收集器(細(xì)胞鏟)收集細(xì)胞至試管中，以備后續(xù)神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺和蛋白質(zhì)分析。<脂質(zhì)提取>脂質(zhì)提取采用Bligh & Dyer法進(jìn)行。具體而言，首先，在上述回收得到的含細(xì)胞的PBS液中加入甲醇氯仿=2. 5ml 1. 25ml的溶劑，振蕩混合20分鐘，進(jìn)行離心分離(3000rpm, 5分鐘)，從而得到上清液和沉淀。將上清液A轉(zhuǎn)移至另外試管中用于神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺量的分析，將沉淀B用于蛋白質(zhì)含量的分析。〈蛋白質(zhì)含量分析〉為了表征細(xì)胞中的神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺量，進(jìn)行蛋白質(zhì)含量分析。在上述回收的沉淀B中加入900 u I的SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液并進(jìn)行混合，在60°C水浴下加熱2小時(shí)使蛋白質(zhì)變性降解，冷卻后在其中添加100 ill的2N HCl溶液，按照BCAKit (BCA蛋白濃度測定試劑盒)法測定其中蛋白質(zhì)的量(記為Pro，單位為yg/ml)。<神經(jīng)酰胺/葡萄糖神經(jīng)酰胺量分析>在殘留的 上清液A中加入PBS :氯仿=1.25ml 1. 25ml的溶劑，振蕩混合20分鐘，3000rpm進(jìn)行離心分離5分鐘，分離、回收作為下相的氯仿層，并在30°C、氮?dú)獗Ｗo(hù)下干燥氯仿層40分鐘得到干燥品，加入IOOu I的氯仿甲醇=2. 5ml 1. 25ml的溶劑進(jìn)行溶解，并用下述薄板層析(TLC)法對(duì)神經(jīng)酰胺和葡萄糖神經(jīng)酰胺的量(分別記為Cer和GlyCer,單位為ii g/ml)進(jìn)行定量。采用干燥TLC板，以氯仿甲醇醋酸(190 9 I v/v/v)為展層劑進(jìn)行薄板層析，待展層劑行至薄板頂端，以吹風(fēng)機(jī)吹干展層劑；重復(fù)以上步驟一次。然后以氯仿甲醇丙酮(76 20 4 v/v/v)為展層劑進(jìn)行薄板層析，待展層劑行至距薄板底端2. 5cm處，停止展層，以吹風(fēng)機(jī)吹干。噴以硫酸銅磷酸溶液，吹干，將層析板放置于180°C烘烤板上烘烤7分鐘顯色。掃描顯色TLC板并進(jìn)行神經(jīng)酰胺(或葡萄糖神經(jīng)酰胺)分析。然后，根據(jù)下述公式(1)，將所得值分別除以各自的蛋白質(zhì)含量，得到Cer/Pix)和GlyCer/Pro。以對(duì)照品的 Cer/Pro 和 GlyCer/Pro 為 1，求出本發(fā)明的 Cer/Pro 和 GlyCer/Pro的相對(duì)值。并且，以對(duì)照品每孔中的蛋白質(zhì)的量為100，求出每孔中的神經(jīng)酰胺和葡萄糖神經(jīng)酰胺的量(分別記為Cer/Well和GlyCer/Well，相對(duì)于對(duì)照品的相對(duì)量)。一并在表I中表不。公式(I)Cer/Pro =神經(jīng)酰胺量O g/ml)/蛋白質(zhì)含量O g/ml)GlyCer/Pro =葡萄糖神經(jīng)酰胺量O g/ml) /蛋白質(zhì)含量O g/ml)表I
權(quán)利要求
1.一種神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法，其中， 在含有豆洛和糖類的培養(yǎng)基中培養(yǎng)擲孢酵母屬(Sporobolomyces)的微生物,從其上清液中獲得神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑。
2.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法，其中， 所述擲孢酵母屬(Sporobolomyces)的微生物是粉紅擲孢酵母(Sporobolomycesroseus)。
3.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法，其中， 所述糖類是葡萄糖。
4.如權(quán)利要求3所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法， 其中，所述培養(yǎng)基由豆渣、葡萄糖和水構(gòu)成。
5.如權(quán)利要求4所述的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法，其中， 所述培養(yǎng)基中所述豆洛的含量為8 12w/v%,所述糖類的含量為0. 8 1. 2w/v%。
6.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法，其中， 所述培養(yǎng)溫度為27 35°C。
7.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法，其中， 所述培養(yǎng)時(shí)間為I 7天。
8.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法，其中， 將通過所述培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)液進(jìn)行離心，從而得到所述上清液。
9.如權(quán)利要求8所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法，其中， 在離心后獲得的所述上清液中加入乙醇后將其作為神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的粗品。
10.如權(quán)利要求9所述的神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法， 其中，進(jìn)一步將所述粗品經(jīng)超聲波處理、離心分離、過濾、真空干燥處理進(jìn)行精制后，得到神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑。
11.豆渣發(fā)酵提取物用于促進(jìn)神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生的用途， 所述豆洛發(fā)酵提取物是在含有豆洛的培養(yǎng)基中培養(yǎng)擲孢酵母屬(Sporobolomyces)的微生物得到的。
12.豆渣發(fā)酵提取物作為神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的用途， 所述豆洛發(fā)酵提取物是在含有豆洛的培養(yǎng)基中培養(yǎng)擲孢酵母屬(Sporobolomyces)的微生物得到的。
13.豆渣發(fā)酵提取物在制造神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑中的用途， 所述豆洛發(fā)酵提取物是在含有豆洛的培養(yǎng)基中培養(yǎng)擲孢酵母屬(Sporobolomyces)的微生物得到的。
14.如權(quán)利要求11 13中任意一項(xiàng)所述的用途， 其中，所述擲孢酵母屬(Sporobolomyces)的微生物是粉紅擲孢酵母(Sporobolomycesroseus)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑的制造方法，其中，在含有豆渣和糖類的培養(yǎng)基中培養(yǎng)擲孢酵母屬(Sporobolomyces)的微生物，從其上清液中獲得神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑。根據(jù)本發(fā)明的制造方法，能夠利用特定微生物，以食品加工業(yè)等的副產(chǎn)物豆渣作為培養(yǎng)基的主原料，從而低成本且高效地獲得神經(jīng)酰胺和/或葡萄糖神經(jīng)酰胺產(chǎn)生促進(jìn)劑。
文檔編號(hào)C12P1/02GK103060383SQ20111031648
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2011年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月18日
發(fā)明者孔凡旗 申請(qǐng)人:花王株式會(huì)社