專利名稱：活性提高的l-天冬酰胺酶變體的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫藥生物工程技術領域。具體涉及活性提高的L-天冬酰胺酶變體以及這些變體在腫瘤治療中的用途。
背景技術：
白血病是當今世界上嚴重危及人類生命的一種惡性疾病，占腫瘤發病率的第六位，占青少年惡性腫瘤發病率的第一位[I]。這其中，急性淋巴細胞白血病(acutelymphocytic leukaemia,ALL)是發病率較高的血液系統惡性腫瘤,特別在青少年和兒童中比較普遍，其發病率占所有青少年癌癥發病率的約25 %以及白血病發病率的約80 % [2]。由于惡性細胞的急劇增加和擴散，在不治療的情況下病人在數月甚至數周內死亡。在各種治療方法中，L-天冬酰胺酶(L-asparaginase，L-ASP，EC 3. 5.1.1)是一種重要的白血病化療藥物，是幾乎所有的ALL聯合化療的重要組成部分。它的作用機理是分解血液循環中的L-天冬酰胺，腫瘤細胞由于不能自身合成L-天冬酰胺，當失去外源L-天冬酰胺后導致死亡；而正常細胞由于還具有L-天冬酰胺的第二合成途徑，因此不受影響。應用以L-ASP為主的聯合化療，使預后有了明顯改觀，完全緩解(CR)率達80%以上，5年以上無病生存率大于40% [3] ο已上市的L-ASP作為白血病化療藥物仍然具有局限性。目前臨床上應用的L-ASP酶活性低，體內半衰期短 (< 5小時)，因而用藥劑量很大(30-50mg)，需要頻繁注射(每周3次)，常引起患者過敏反應、熱原反應及其它副作用[4]。PEG化修飾的L-ASP雖然有明顯延長的半衰期，過敏反應總體發生率較天然提取產物降低，但PEG修飾造成酶活性降低30%，而且對天然L-ASP不過敏的患者有11%對PEG化產品過敏(數據來源為Enzon公司PEG化L-ASP Oncaspar的產品說明書)。加之PEG化修飾的L-ASP價格昂貴，其加重了患者的經濟負擔，因而目前的治療仍然主要采用從大腸桿菌提取的天然產物。上述不足使得L-ASP的應用受到限制。蛋白質體外定向進化技術能夠用來對各種酶進行改造，如Moon-soo Kim等人通過易錯PCR技術增強了來源于大腸桿菌肌醇六磷酸酶AppA2的熱穩定性；AnYF等人將易錯PCR與StEP重組技術結合提高了S-腺苷基蛋氨酸合成酶Saml的酶活性，使體內合成S-腺苷基蛋氨酸累積量增加了 56%。曾有研究報道利用蛋白質體外定向進化技術對來源于歐文氏菌(Erwmiachrysanthemi)的L-ASP進行改造，獲得熱穩定性提高的變體L-ASP (D133V)，其體外半失活溫度(Tm)較野生型L-ASP提高9. 4°C [10]。本領域仍需要能夠降低蛋白劑量，延長給藥間隔，大幅降低副反應，降低生產成本和治療費用的具有較高酶活性和熱穩定性的L-ASP。本發明使用蛋白質體外定向進化技術獲得了這樣的L-ASP。發明概述本發明通過體外定向進化-易錯PCR技術對大腸桿菌(Escherichia coli)野生型L-天冬酰胺酶(L-ansB)進行改造，獲得活性提高和熱穩定性提高的L-天冬酰胺酶變體。因此，在一個方面，本發明提供了 L-天冬酰胺酶的變體，其是如SEQ IDNO :3所示的大腸桿菌野生型L-天冬酰胺酶的變體，所述L-天冬酰胺酶變體包含在對應于SEQ IDNO 3的第48、49、152和283位上具有一或多個氨基酸取代的氨基酸序列。本發明的L-天冬酰胺酶變體與野生型酶相比具有提高的活性和熱穩定性。另一方面，本發明提供了包含編碼本發明的L-天冬酰胺酶變體的核苷酸序列的分離的核酸、包含所述核酸的表達構建體以及包含所述表達構建體的宿主細胞。另外，本發明還提供了產生本發明的L-天冬酰胺酶變體的方法。最后，本發明還提供了包含本發明的L-天冬酰胺酶變體的用于治療腫瘤的藥物組合物。


圖1. L-天冬酰胺酶分解L-天冬酰胺反應示意圖。圖2.示出純化的L-天冬酰胺酶變體蛋白電泳圖。泳道I為發酵液；泳道2為穿透液；泳道3為平衡漂洗液；泳道4為用含O. 2M NaCl的20mMPB (pH8. O)洗脫的洗脫液(L-天冬酰胺酶變體蛋白)；泳道5、6為用含有O. 5M和IM NaCl的20mM PB(pH8. O)洗脫的洗脫液；泳道7為蛋白標記物。圖3. L-天冬酰胺酶變體與野生型酶純化后的蛋白電泳圖。泳道I為蛋白標記物，泳道2為野生型酶，泳道3為變體M1，泳道4為變體M13。圖4. L-天冬酰胺酶變體Ml與野生型酶體外半失活溫度測定比較圖。圖5. L-天冬酰胺酶變體Ml與野生型酶熱穩定性比較圖。發明詳述通過體外定向進化-易錯PCR技術對大腸桿菌野生型L-天冬酰胺酶(L-ansB)進行改造，令人驚奇地，本發明人獲得了具有提高的活性和熱穩定性的L-天冬酰胺酶變體。在第一個方面，本發明提供了 L-天冬酰胺酶的變體，其是如SEQ IDNO :3所示的大腸桿菌野生型L-天冬酰胺酶的變體，所述L-天冬酰胺酶變體包含在對應于SEQ ID N03的第48、49、152和283位上具有一或多個氨基酸取代的氨基酸序列，任選地，所述氨基酸序列不含有信號肽SEQ IDNO 15 0在一個優選的實施方案中，本發明的L-天冬酰胺酶變體包含選自SEQID NO :4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7 和 SEQ ID NO :8 的氨基酸序列，優選包含 SEQ IDNO :4或SEQ ID NO :8的氨基酸序列，最優選包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列，以及任選地，所述氨基酸序列不含有信號肽SEQ ID NO 150“包含”一詞在本文中用于描述蛋白質或核酸的序列時，所述蛋白質或核酸可以是由所述序列組成，或者在所述蛋白質或核酸的一端或兩端可以具有額外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本發明所述的活性。在一些實施方案中，本發明的L-天冬酰胺酶變體可以包含額外的接頭或者與其它標簽蛋白融合。這些接頭和/或標簽可以有利于本發明的L-天冬酰胺酶變體在目標宿主細胞中的產生，增加表達量或增加可溶性表達，有利于所述變體的分離和純化，但基本上不會影響變體的活性。本領域已知許多這樣的接頭和/或標簽。合適的接頭和/或標簽包括例如6 XHis、GST (谷胱甘肽轉移酶)、MBP (麥芽糖結合蛋白)等等。合適的接頭和/或標簽通常可以通過選擇合適的商品化表達載體而獲得。在第二個方面，本發明還提供了分離的核酸，其包含本發明的L-天冬酰胺酶變體的核苷酸序列，任選地，所述核苷酸序列不含有信號肽SEQ IDNO 15的編碼序列。編碼本發明的L-天冬酰胺酶變體的核苷酸序列可以由本發明的L-天冬酰胺酶變體的氨基酸序列根據標準密碼子表推導得出。本領域技術人員應當了解可以針對所選擇的不同表達系統對編碼本發明的L-天冬酰胺酶變體的核苷酸序列進行密碼子優化以獲得表達的最大化。例如在大腸桿菌表達系統中，可以選擇大腸桿菌偏好的密碼子來編碼本發明的L-天冬酰胺酶變體。在一個實施方案中，本發明分離的核酸包含選自SEQ ID NO 10,SEQID NO =IUSEQID NO :12、SEQ ID NO 13 和 SEQ ID NO 14 的核苷酸序列，優選包含 SEQ ID NO : 10 或 SEQID NO 14的核苷酸序列，最優選包含SEQID NO 10的核酸序列，以及任選地，所述核苷酸序列不含有信號肽SEQ IDNO 15的編碼序列。在第三個方面，本發明提供了包含本發明的核酸的重組表達構建體，其中所述核苷酸序列可操縱地連接至表達載體上的一或多個調控序列。在本領域中已知有適用于各 種宿主細胞的大量的各種調控序列。例如，存在于表達載體中的“調控序列”可包括增強子，啟動子，剪接供體/受體信號，Kozak序列，終止子及聚腺苷酸化序列，其如本領域所熟知的那樣促進可操縱地連接于其上的核苷酸序列的表達，或促進被編碼的蛋白質的表達。對于啟動子，可以使用例如在大腸桿菌或其他類似微生物中表達本發明的L-天冬酰胺酶變體的T71ac、CAT、Trp或T5啟動子。這些調控序列是本領域已知的并在合適和已知條件下使用。可用于構建本發明的重組表達構建體的表達載體包括質粒載體、酵母穿梭載體、桿狀病毒、復制缺陷的腺病毒等。本領域中已知大量可獲得的適于表達本發明的L-天冬酰胺酶變體的表達載體。在一個優選的實施方案中，用于表達本發明的L-天冬酰胺酶變體的表達載體是PBV220質粒載體(上海閃晶分子生物科技有限公司)。在第四個方面，本發明提供了用于產生本發明的L-天冬酰胺酶變體的重組宿主細胞，其包含本發明的重組表達構建體。用于表達本發明的L-天冬酰胺酶變體的宿主細胞包括原核生物、酵母和高等真核細胞。示例性的原核宿主包括埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、沙門氏菌屬(Salmonella)以及假單胞菌屬(Pseudomonas)和鏈霉菌屬(Streptomyces)的細菌。在優選的實施方案中，宿主細胞是埃希氏菌屬的，優選是大腸桿菌。在本發明的一個實施方案中，所使用的宿主細胞為大腸桿菌ToplO菌株細胞。可以通過許多已熟知的任一技術將本發明的重組表達構建體導入宿主細胞，這樣的技術包括但不限于熱激轉化，電穿孔，DEAE-葡聚糖轉染，顯微注射，脂質體接介導的轉染，磷酸鈣沉淀，原生質融合，微粒轟擊，病毒轉化及類似技術。本發明的L-天冬酰胺酶變體可以通過本領域已知的各種產生蛋白質的方法獲得。例如化學合成，包括固相或液相合成。然而，出于生產成本的原因，優選使用遺傳工程的方法。
因此，在第五個方面，本發明提供了產生本發明的L-天冬酰胺酶變體的方法，其包括a)在適合本發明的L-天冬酰胺酶變體表達的條件下培養本發明的重組宿主細胞；和b)從培養物中回收產生的L-天冬酰胺酶變體。在最后一個方面，本發明還提供了包含本發明的L-天冬酰胺酶變體的用于治療腫瘤的藥物組合物。優選地，所述腫瘤是血液系統腫瘤，更優選是急性淋巴細胞白血病或淋巴瘤。適當地，所述藥物組合物進一步包含藥物學上可接受的載體，稀釋劑或賦形劑。“藥物學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑”是指可以安全地進行系統性施用的固體或液體填充物、稀釋劑或做成膠囊的物質等。依照施用時的特殊途徑，可以使用本領域中所熟知的各種不同的載體。這些載體可以選自包括糖類，淀粉，纖維素及其衍生物，麥芽糖，明膠，滑石，硫酸鈣，植物油，合成油，多元醇，藻酸，磷酸緩沖液，乳化劑，等張鹽水與鹽類，鹽類是如同包括了氯化氫的礦物酸鹽，溴化物與硫化物，有機酸如醋酸鹽，丙酸鹽與丙二酸鹽以及無熱原水。可用任何安全途徑為患者提供本發明的藥物組合物。可使用例如經口，直腸，腸外注射，舌下，口腔，靜脈內，關節內，肌肉內，真皮內與皮下的注射，或經吸入，眼球內，腹膜內，腦室內或經透皮膚等 及其類似途徑。優選靜脈注射。可用與藥劑設計兼容的方法來以藥物有效量施用本發明的藥物組合物。對患者施用的劑量應當足以在一段適當時間后在患者身上產生有利的應答。施用劑量應由醫師判斷，視施用對象的各種因素而定，如年齡、性別、體重及其一般健康狀況等。
實施例下面將通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所描述的實施例范圍中。實施例1 :大腸桿菌L-ansB基因的克隆根據NCBI公布的L-ansB核苷酸序列設計上游引物mansB-OOlC -CGGAATTCATGGAGTITTTCAAMAGACG-3' ) (SEQ ID NO :1)和下游引物mansB-002 (5' -CGGGATCCTTAGTACTGATTGAAGATCTG-3' ) (SEQ ID NO :2)，其中下劃線示出分別額外添加的EcoRI和BamHI酶切位點，引物5’末端還額外添加兩個保護堿基。以E. coli DH5 α基因組為模板進行PCR反應。反應條件為95°C預變性5min，再按如下參數循環反應30次95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸90s ;最后72°C延伸IOmin0PCR產物經I %低融點瓊脂糖凝膠電泳后，切出含目的片段的膠塊并放入1. 5mLEppendorf 管中，使用 Ε· Ζ· N. A Gel Extraction Kit 試劑盒(Omega Bio-Tek 公司)進行回收，取50 μ L預熱至55°C的無菌水進行洗脫，取3 μ L進行電泳檢測，_20°C保存備用。純化后的PCR產物片段和T載體pMD18T (寶生物工程(大連)有限公司)按以下體系使用NEB公司的T4連接酶進行連接反應T 載體 pMD18T
PCR產物片段4pL
10XT4連接酶緩沖液IpL T4連接酶IgL
加雙蒸水至IOpL
將混勻后的連接反應液，放置于25°C反應30min，4°C備用或直接用于轉化反應。將10 μ L連接反應液加入100 μ L大腸桿菌DH5 α感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴30min，42°C水浴熱激90s，再冰浴3min，加LB培養基至lmL，置于37°C、170rpm搖床中振蕩培養lh，取200 μ L上述培養物涂布于含100mg/mL氨芐青霉素的LB平板，經37°C恒溫培養過夜。挑取菌落擴大培養后使用E. Z. N. A Plasmid Mini Kit試劑盒(Omega Bio-Tek公司)提取質粒，經EcoRI和BamHI酶切電泳鑒定，將正確克隆送往測序，核苷酸測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成，經核對與NCBI公布L-ansB核苷酸序列一致，將該測序構建體命名為pMD18T-ansB。實施例2 :重組表達構建體pBV-ansB的構建對實施例1中測序構建體pMD18T_ansB進行EcoRI和BamHI (寶生物工程(大連)有限公司)雙酶切反應以回收L-ansB目的基因片段
質粒 pMD18T-ansB20μL
IOxK緩沖液5μ
EcoRII pL
BamHII pL
無菌水補至50pL混勻完畢后的酶切反應液，放置于37°C保溫過夜后，用實施例1中的方法純化回收。PBV220表達載體以同樣的方式進行EcoRI和BamHI雙酶切反應，純化回收線性pBV220表達載體片段。純化后的L-ansB目的基因片段和線性pBV220表達載體片段按以下體系進行連接
反應
pBV220 片段IpL
L-ansB 片段4pL 10 X T4連接酶緩沖液IpL
T4連接酶IpL
加雙蒸水至IOpL將混勻后的連接反應液，放置于25°C反應30min，4°C備用或直接用于轉化反應。
將10 μ L連接反應液加入100 μ L Ε. coli ToplO感受態細胞(天根生化科技(北京)有限公司，目錄號CB104)中，輕輕混勻，冰浴30min，42°C水浴熱激90s，再冰浴3min，力口SOC培養基至lmL，置于32°C、170rpm搖床中振蕩培養lh，取200 μ L菌液涂布于含IOOmg/mL氨芐青霉素的LB平板，32°C溫育過夜。挑取菌落擴大培養后使用Ε.Ζ. N. A Plasmid MiniKit試劑盒(Omega Bio-Tek公司)提取質粒，經EcoRI和BamHI酶切電泳鑒定，將正確克隆送往測序，核苷酸測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成，經核對與NCBI公布L-ansB核苷酸序列一致，將獲得的構建體命名為pBV_ansB。實施例3 :易錯PCR隨機突變L-ansB基因按如下體系配制易錯PCR反應溶液· 10 X PCR 緩沖液IOyL· 50 X dNTPs 混合物 2 μ L· IOmM dCTP2 μ L· IOmM dTTP2 μ L· IOXMgCl210 μ L· MnCl25 μ L 上游引物 mansB-001 2μ L 下游引物 mansB-002 2μ L·模板 pBV-ansB10 IOOng· rTaq DNA 聚合酶I μ L (5U)·加雙蒸水至100 μ L其中10XPCR 緩沖液20mM MgC12,200mM KCl,50mM Tris-HCl, ρΗ8· 3 ；50 X dNTPs 混合物含有 dATP、dGTP、dTTP、dCTP 各 IOmM ；IOXMgCl2溶液70mM，溶于滅菌水；MnCl2溶液ImM,溶于滅菌水；rTaq DNA聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司，目錄號DROOI。易錯PCR反應條件為95°C預變性5min，再按如下參數循環反應20次95°C變性30s, 55°C退火 30s, 72°C延伸 90s ;最后 72°C延伸 IOminPCR產物經I %低融點瓊脂糖凝膠電泳后，切出含目的片段的膠塊并放入1. 5mLEppendorf 管中，使用 Ε· Ζ· N. A Gel Extraction Kit 試劑盒(Omega Bio-Tek 公司)進行回收，取50 μ L預熱至55°C的無菌水進行洗脫，取3 μ L進行電泳檢測，_20°C保存備用。實施例4 L-ansB變體庫的構建取實施例3中純化后的易錯PCR產物片段按以下體系進行EcoRI和BamHI雙酶切
反應易錯PCR產物片段40μLIOxK緩沖液5pLEcoRII pLBamHII μL無菌水補至50μL混勻完畢后的酶切反應液，放置于37°C溫育3h后，使用E.Z.N.A Cycle Pure Kit試劑盒(Omega Bio-Tek公司)對酶切片段進行直接回收，取50 μ L預熱至55°C的無菌水進行洗脫，取3μ L進行電泳檢測，-20°C保存備用或直接用于連接反應。pBV220表達載體以同樣的方式進行EcoRI和BamHI雙酶切反應，純化回收線性pBV220表達載體片段。純化后的易錯PCR產物片段和線性pBV220表達載體片段按以下體系進行連接反
應
pBV220 片段IpL 易錯PCR產物片段4pL 10XT4連接酶緩沖液IpL T4連接酶IpL 加雙蒸水至ΙΟμL將混勻后的連接反應液，放置于25°C反應30min，4°C備用或直接用于轉化反應。將10 μ L連接反應液加入IOOyL Ε. coli ToplO感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴30min，42°C水浴熱激90s，再冰浴3min，加SOC培養基至lmL，置于32°C、170rpm搖床中振蕩培養lh，離心上述培養物，剩余200 μ L上清并吹吸混勻后涂布于含lOOmg/mL氨芐青霉素的LB平板，32 °C恒溫培養過夜。實施例5 L-天冬酰胺酶變體的篩選原理L-天冬酰胺酶的高通量篩選是基于比色法而建立的，由于L-天冬酰胺酶的特異性底物L-天冬酰胺可以被水解生成氨(見圖1)，而生成的氨可以與奈氏試劑發生特異性化學反應生成紅棕色絡合物碘化雙汞胺，在460nm處有最大吸收值，通過比色可以篩選出具有增加的活性的L-天冬酰胺酶變體。試劑L-天冬酰胺溶液精密稱取0. 15g L-天冬酰胺，溶于25mL的0.1M PB緩沖液(磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液)，PH8. O (新鮮配制)。細胞裂解液0.2mg/mL 溶菌酶，50mM PB, pH8. O。25%三氯乙酸(TCA)溶液精密稱取34g TCA溶于60mL去離子水(室溫避光保存)。奈氏試劑取碘化汞11. 5g，碘化鉀8g，溶于50mL去離子水中，充分混勻，放置過夜得到碘化汞鉀溶液，臨用時取等體積與20%氫氧化鈉溶液混合使用(室溫避光保存)。初級篩選
I)吸取300 μ L含有氨芐抗性LB液體培養基加至96深孔板，并用滅菌牙簽挑取實施例4所得單菌落至各個孔中輕微晃動(分別在94、95、96號孔中挑入含有表達野生型L-天門冬酰胺酶的單菌落作為篩選對照)，再在已畫有方格并標有序號的新鮮LB平板上進行保種，平板置于32°C培養過夜。2)將96深孔板固定于32°C搖床中，170rpm振蕩24h。3)培養結束后,再向各孔中加入300 μ L含有氨節抗性LB液體培養基,再固定于42°C搖床中，170rpm振蕩誘導培養5h。4)誘導培養結束后，取出96深孔板。吸取100 μ L誘導后的菌液至另一深孔板中，2500g離心lOmin，棄去培養基上清，加蓋置于-80°C放置15min。5)再加入200μ L預冷的細胞裂解液，加蓋放置于4°C冰箱中lOmin，再固定于微孔板振蕩器上，室溫200rpm振蕩lOmin，充分裂解菌體。6)充分裂解后，向各孔中加入200 μ L已預熱的O. 04Μ L-天冬酰胺溶液，放置于37°C培養箱中振蕩反應15min。準確反應15min后，立即加入50 μ L 25%三氯乙酸(TCA)終止反應，輕微振蕩數十秒。7)250(^離心1011^11，吸取1(^1^上清至含有9(^1^ PB的96孔板中，再加入40 μ L奈氏試劑進行顯色，反應IOmin后在主波長450nm，副波長630nm處進行測定，吸光值A =A450-A630。次級篩選I)初級篩選獲得的 酶活性提高的初級變體單菌落接種入含有20mL LB培養基的小搖瓶中，32 0C、170rpm振蕩培養。2)當0D600至O. 6左右時，將溫度調至42°C進行誘導培養5h。3)誘導培養結束后，取ImL菌液進行5000rpm離心5min，棄去上清液，置于_80°C方文置15min。4)再加入ImL預冷的細菌裂解液，室溫振蕩5min，充分裂解菌體，然后5000rpm離心 5min。5)取100 μ L裂解上清液與200 μ L已預熱的O. 04M L-天冬酰胺溶液，放置于37°C培養箱中振蕩反應15min。準確反應15min后，立即加入50yL 25%三氯乙酸(TCA)終止反應，輕微振蕩數十秒。6) 5000rpm離心5min,向上述反應液中加入100 μ L奈氏試劑進行顯色,反應IOmin后在主波長450nm，副波長630nm處進行測定，吸光值A = A450-A630。7)將吸收值與初級篩選吸收值進行核對比較，獲得較野生型酶活性提高的L-天冬酰胺酶變體。將活性提高的L-天冬酰胺酶變體的編碼基因進行DNA序列測定，證實獲得了三種具有提高的活性的L-天冬酰胺酶變體，總結于下表1:表I
權利要求
1.L-天冬酰胺酶變體，其是如SEQ ID NO :3所示的大腸桿菌野生型L-天冬酰胺酶的變體，所述L-天冬酰胺酶變體包含在對應于SEQ ID NO 3的第48、49、152和283位上具有一或多個氨基酸取代的氨基酸序列，任選地，所述氨基酸序列不含有如SEQ ID N0:15所示的信號肽序列。
2.權利要求1的L-天冬酰胺酶變體，其包含選自SEQID NO :4、SEQ IDNO :5、SEQ IDNO :6、SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8的氨基酸序列，任選地，所述氨基酸序列不含有如SEQID NO 15所不的信號肽序列。
3.分離的核酸，其包含編碼權利要求1或2的L-天冬酰胺酶變體的核苷酸序列，任選地，所述核苷酸序列不含有如SEQ ID NO :15所示的信號肽序列的編碼序列。
4.權利要求3的分離的核酸，其包含選自SEQID NO :10、SEQ IDNO :11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14的核苷酸序列，任選地，所述核苷酸序列不含有如SEQID NO :15所示的信號肽序列的編碼序列。
5.重組表達構建體，其包含權利要求3或4的核酸，其中所述核苷酸序列可操縱地連接至表達載體上的一或多個調控序列。
6.重組宿主細胞,其包含權利要求5的重組表達構建體。
7.產生權利要求1或2的L-天冬酰胺酶變體的方法，其包括 a)在適合所述變體表達的條件下培養權利要求6的重組宿主細胞；和 b)從培養物中回收產生的L-天冬酰胺酶變體。
8.用于治療腫瘤的藥物組合物，其包含權利要求1或2的L-天冬酰胺酶變體。
9.權利要求8的藥物組合物，其還包含藥物學上可接受的載體，稀釋劑或賦形劑。
10.權利要求8或9的藥物組合物，其中所述腫瘤是血液系統腫瘤。
11.權利要求10的藥物組合物，其中所述血液系統腫瘤選自急性淋巴細胞白血病和淋巴瘤。
全文摘要
本發明涉及活性提高的L-天冬酰胺酶變體，其是如SEQ ID NO3所示的大腸桿菌野生型L-天冬酰胺酶的變體，并且包含在對應于SEQ ID NO3的第48、49、152和283位上具有一或多個氨基酸取代的氨基酸序列。本發明還提供包含編碼本發明的L-天冬酰胺酶變體的核苷酸序列的分離的核酸、包含所述核酸的重組表達構建體以及包含所述表達構建體的重組宿主細胞。另外，本發明還提供產生本發明的L-天冬酰胺酶變體的方法。最后，本發明還提供包含本發明的L-天冬酰胺酶變體的用于治療腫瘤的藥物組合物。
文檔編號C12N9/82GK103060299SQ201110318250
公開日2013年4月24日 申請日期2011年10月19日 優先權日2011年10月19日
發明者沈林, 李鼎鋒, 孫志丹, 陳星梅, 劉勇 申請人:北京安百勝生物科技有限公司