專利名稱：一種全自動腸道菌群體外模擬模型裝置的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物學技術領域，具體涉及一種全自動腸道菌群體外模擬模型裝置。
背景技術：
自2006年Peter等在Nature雜志上報道腸道微生物的菌群結構與肥胖相關以來，腸道微生物的研究已經成為全球科學家關注的研究熱點之一。相關的報道也屢見不鮮， 已有研究報道腸道微生物對宿主的健康和生理具有很多非常重要的功能，如參與宿主的代謝、刺激宿主免疫系統的發育等等。當然，如果腸道微生物的正常平衡遭到破壞，其菌群結構的變化也與很多疾病的發生發展相關，如肥胖、糖尿病、炎癥性腸炎等。所以研究腸道微生態的菌群結構，了解宿主與腸道微生物之間的關系、認清正常菌群與病原菌之間的相互作用關系已成為全球科學家關注的熱點之一。人體及動物的腸道中悉生著大量的微生物，人的胃腸道中含有10 100萬億個微生物，其細胞數量比人體細胞總數的10倍還多，其密度也非常高，在大腸的每克內容物中就含有IO11 IO12個微生物。而且其種類也非常豐富，達到500 1000種。由于科學技術的限制，到目前為止大于80%的腸道細菌都還未能在體外進行純培養。所以到目前為止人們對腸道微生物的認識其實還非常有限。目前用于體外腸道菌群模擬的模型主要有由Macfarlane等研發的單相和三相連續發酵系統，這些系統已經廣泛用于細菌與抗菌素之間的相互作用、細菌與細菌之間的相互作用及微生物對營養物質的代謝等的研究。但該模型工藝相對簡單，發酵參數如溫度、 PH、流加速度等控制不夠準確，容易影響試驗結果。另外，由于當時技術的限制，Macfarlane 等研發的模型的模擬效果并沒有進行很好的評估。而且由于當時的知識有限，他們也并沒有考慮腸道中未培養菌的富集培養問題。對現有技術的文獻檢索發現，目前與本發明密切相關的專利有兩篇，一個是專利 “一種腸道菌群離體培養裝置”(申請號200710(^8346. 2)，另一個是“一種人腸道菌群連續培養的系統及方法”(申請號200810048065. 8)。前者著重介紹了一種能模擬腸道的、連續流動的腸道菌群離體培養裝置，且菌群相似性達到80%以上。后者在前者的基礎上做了一定的改進，給出了具體的培養方法，以實例分析了培養前后優勢菌群和代謝產物(主要是短鏈脂肪酸)的變化。但從公開的說明書和權利要求書來看，其工藝還比較粗糙、操作不夠簡單、發酵參數也不能控制的很精準，達不到數字化控制的要求。盡管其也對發酵前后的菌群結構進行了分析，但由于技術方法的限制，當時的發明者只是采用傳統細菌培養計數的方法對腸道中有限的幾種可培養的優勢菌進行了比較，而腸道中大于80%的菌到目前為止還是不能在體外進行純培養的，這在一定程度上影響了其結果的可靠性。同時，已發明的這兩項專利都只是對某一個樣品進行了研究，其代表性、重復性和廣泛適用性可能還有待進一步考究。另外，可能由于當時生物技術和實驗條件的限制，發明者對未培養菌的關注比較少，所以在進行模擬效果評估的時候并沒有考慮未培養菌的模擬和富集情況。
發明內容
本發明針對目前對腸道菌群體外培養技術的局限性，提供一種操作簡單、穩定有效、使用廣泛的全自動腸道菌群體外模擬模型?！N全自動腸道菌群體外模擬模型裝置，所述的裝置包括腸道菌群體外連續培養系統，其特征在于所述的腸道菌群體外連續培養系統包括氣路系統、發酵系統、控制系統， 所述的氣路系統包括氮氣瓶，所述氮氣瓶通過膠管與所述的發酵系統連通；所述的發酵系統包括發酵單元結構，所述的發酵單元結構包括所帶有攪拌裝置的培養基瓶和帶有攪拌裝置的生物反應器，所述的生物反應器通過營養液蠕動泵與培養基瓶連通，所述的培養基瓶包括培養基瓶體和培養基瓶蓋，所述的培養基瓶蓋上設有進氣口 A 和排氣口 A，所述進氣口 A通過空氣過濾器與氮氣瓶相接，所述排氣口 A通過空氣過濾器與大氣相通；所述的生物反應器包括反應器瓶體和反應器瓶蓋，所述的反應器瓶蓋設有進氣口 B、排氣口 B和pH探針口及可深入反應器液面的pH探針，所述的反應器瓶體為夾套模式， 所述的夾套里層為反應器，夾套層設有受溫度控制系統控制的并與加溫水源相連的循環進口和循環出口，所述的溫度控制系統包括冷卻系統和加熱系統，所述夾套層安裝有溫度感應器，所述的溫度感應器與溫度控制系統連接；所述反應器瓶蓋設有可通入軟管的進料口， 所述的進料口通過軟管與營養液蠕動泵相連，通常將軟管伸入反應器瓶的瓶底，所述反應器的側面設有預定水位高度不同的發酵液出料口 1-5個，優選2-3個，更優選3個，所述出料口與接收盤連通；所述進氣口 B通過空氣過濾器與氮氣瓶相接，所述排氣口 B通過空氣過濾器與大氣相通；所述控制系統包括顯示屏、中央處理器，所述的控制系統還包括與發酵單元結構相匹配的PH控制儀、溫度控制系統、體積控制系統和分別通過軟管與生物反應器進料口連接的營養液蠕動泵、酸液蠕動泵、堿液蠕動泵，所述的中央處理器接受并處理溫度控制系統和體積控制系統與PH控制儀的信號，對營養液蠕動泵、酸液蠕動泵、堿液蠕動泵、冷卻系統或加熱系統發出工作指令，所述的酸液蠕動泵與調PH值的酸液連接、堿液蠕動泵與調pH值的堿液連接；所述的體積控制系統根據設定值控制營養液蠕動泵內流體的速度；所述的PH 控制儀通過導線與所述的PH探針相連，所述的pH探針將實時采集的pH數據經過可將外部世界模擬信號和計算機連接的A/D轉換后，傳輸到計算機和數字系統，經過比較判斷算法與PH設定值進行比較后將模擬信號轉換為可識別的數字信號，并通過命令識別控制程序傳輸到中央處理器，所述的中央處理器發出命令數據控制酸液蠕動泵或堿液蠕動泵工作； 所述的溫度控制系統與溫度感應器連接，所述的溫度感應器將實時采集的溫度數據經過可將外部世界模擬信號和計算機連接的A/D轉換后，傳輸到計算機和數字系統，經過采用比較判斷算法與溫度設定值進行比較后將模擬信號轉換為可識別的數字信號，并通過命令識別控制程序傳輸到中央處理器，所述的中央處理器發出命令數據控制冷卻系統或加熱系統工作，從而改變加溫水源的溫度。所述帶有攪拌裝置的培養基瓶和帶有攪拌裝置的生物反應器中的攪拌裝置為位于培養基瓶或生物反應器下方的磁力攪拌器。所述的發酵系統包括1 4個發酵單元結構串聯組成，所述的每個發酵單元結構設有與自身匹配的PH控制儀、溫度控制系統、體積控制系統、分別通過軟管與生物反應器進料口的酸液蠕動泵、堿液蠕動泵、營養液蠕動泵連接，所述的每個發酵單元結構的控制系統均與中央處理器連接，所述的前一個發酵單元結構的出料口與下一個發酵單元結構的進料口連接，最后一個發酵單元結構的出料口與所述的接收盤連接。具體的，將轉子放入培養基瓶底部，置于磁力攪拌器上，不停的攪拌以保證培養基的充分混勻，連續通入氮氣以保證培養基的厭氧環境，同時通過空氣過濾器與外界相通以保持系統的平衡，并將蠕動泵與反應器相連，通過調控蠕動泵的蠕動速度可以調控培養基的流加速度，使培養基瓶中的新鮮培養基按一定的速度連續的流入生物反應器中。生物反應器通過調整發酵液流出口的高低調節生物反應器的發酵體積；另外，生物反應器通過插入其中的PH導線與pH控制器相連，將pH探針采集的數據經過A/D轉換后，采用比較判斷算法與pH設定值進行比較，將命令識別控制程序傳輸到中央處理器發出命令數據，控制加酸或加堿蠕動泵工作來控制生物反應器中的PH值；生物反應器也可通過夾套層設置的溫度感應器與溫度控制儀相連，將溫度感應器采集的數據經過A/D轉換后，采用比較判斷算法與溫度設定值進行比較，將命令識別控制程序傳輸到中央處理器發出命令數據，控制冷卻或加熱系統工作將加溫水源不斷泵入夾套層，實現發酵系統的恒溫。本發明的有益效果是提供一種操作簡單、使用方便、體系穩定、應用廣泛的全自動腸道菌群體外模擬模型。


圖1是全自動腸道菌群體外模擬模型的正視2是全自動腸道菌群體外模擬模型的側視3是全自動腸道菌群體外模擬模型的效果4是全自動腸道菌群體外模擬模型pH控制儀原理5是全自動腸道菌群體外模擬模型溫度控制系統原理6是原始菌群和實施例2收集的發酵產物中的細菌的16S基因的PCR-DGGE電泳圖比較(采用PCR-DGG的方法對發酵后樣品和原始樣品中的細菌菌群結構進行分析，結果表明發酵培養后的菌群結構與原始樣品的菌群結構很相似，有很好的模擬效果。圖7是原始腸道內容物和實施例2收集的發酵產物中的細菌的成分圖，采用妨4 測序的方法對發酵后樣品和原始樣品中的細菌菌群結構進行分析，結果表明發酵培養后的菌群結構與原始樣品的菌群結構很相似，有很好的模擬效果。圖8是對實施例2和實施例3采集的人糞便菌經VI培養基和VL培養基培養的重復性測定，采用PCR-DGG的方法對不同批次的發酵樣品和原始樣品進行菌群結構分析，結果表明本發明的系統有很好的穩定性和可重復性)圖9是實施例4收集的發酵產物中的細菌中的未培養菌和原始樣品中的未培養菌的百分比組成的柱狀圖，結果表明，與原始腸道樣品相比，未培養菌占總菌的比例在發酵后有所提高。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此
實施例1 全自動腸道菌群體外模擬模型的建立一種全自動腸道菌群體外模擬模型裝置，所述的裝置包括腸道菌群體外連續培養系統，所述的腸道菌群體外連續培養系統包括氣路系統1、發酵系統2、控制系統3，所述的氣路系統1包括氮氣瓶11，所述氮氣瓶11通過膠管與所述的發酵系統2連通；所述的發酵系統2包括發酵單元結構，所述的發酵單元結構包括所帶有攪拌裝置的培養基瓶21和帶有攪拌裝置的生物反應器22，所述的生物反應器21通過營養液蠕動泵與培養基瓶21連通，所述的培養基瓶21包括培養基瓶體211和培養基瓶蓋212，所述的培養基瓶蓋212上設有進氣口 A和排氣口 A，所述進氣口 A通過空氣過濾器與氮氣瓶11相接， 所述排氣口 A通過空氣過濾器與大氣相通；所述的生物反應器22包括反應器瓶體221和反應器瓶蓋222，所述的反應器瓶蓋222設有進氣口 B、排氣口 B和pH探針口及可深入反應器液面的pH探針，所述的進氣口 B通過空氣過濾器與氮氣瓶相連，排氣口 B通過空氣過濾器與大氣相通，所述的反應器瓶體221為夾套模式，所述的夾套模式里層為反應器，夾套層設有受溫度控制系統控制的并與加溫水源相連的循環進口和循環出口，所述的溫度控制系統包括冷卻系統和加熱系統，所述夾套層安裝有溫度感應器，所述的溫度感應器與溫度控制系統連接；所述反應器瓶蓋222設有可伸入軟管的進料口，所述的進料口通過軟管與營養液蠕動泵相連，通常將軟管另一頭伸入反應器瓶的瓶底，以確保反應器內原料混合均勻，所述反應器的側面設有預定水位高度不同的發酵液出料口 3個，所述出料口 2211與接收盤連通，所述的進料口通過膠管與營養液蠕動泵連通；所述進氣口 B通過空氣過濾器與氮氣瓶相接，所述排氣口 B通過空氣過濾器與大氣相通；所述控制系統3包括觸摸顯示屏31、中央處理器，所述的控制系統還包括與發酵單元結構相匹配的PH控制儀32、溫度控制系統33、體積控制系統34和分別通過膠管與生物反應器22進料口連接的營養液蠕動泵、酸液蠕動泵、堿液蠕動泵，所述的中央處理器接受并處理溫度控制系統33和體積控制系統34與pH控制儀32的信號，對營養液蠕動泵、酸液蠕動泵、堿液蠕動泵、冷卻系統或加熱系統發出工作指令，所述的酸液蠕動泵與調PH值的酸液連接、堿液蠕動泵與調PH值的堿液連接；所述的體積控制系統34根據設定值控制營養液蠕動泵內流體的速度；所述的PH控制儀32通過導線與所述的pH探針相連，所述的pH 探針將實時采集的PH數據經過可將外部世界模擬信號和計算機連接的A/D轉換后，傳輸到計算機和數字系統，經過比較判斷算法與PH設定值進行比較后將模擬信號轉換為可識別的數字信號，并通過命令識別控制程序傳輸到中央處理器，所述的中央處理器發出命令數據控制酸液蠕動泵或堿液蠕動泵工作；所述的溫度控制系統33與溫度感應器連接，所述的溫度感應器將實時采集的溫度數據經過可將外部世界模擬信號和計算機連接的A/D轉換后，傳輸到計算機和數字系統，經過比較判斷算法與溫度設定值進行比較將模擬信號轉換為可識別的數字信號，并通過命令識別控制程序傳輸到中央處理器，所述的中央處理器發出命令數據控制冷卻系統或加熱系統工作，從而改變加溫水源的溫度。所述帶有攪拌裝置的培養基瓶21和帶有攪拌裝置的生物反應器22中的攪拌裝置為位于培養基瓶21或生物反應器22下方的磁力攪拌器23。所述的發酵系統2包括1 4個發酵單元結構串聯組成，所述的每個發酵單元結構設有與自身匹配的PH控制儀32、溫度控制系統33、體積控制系統34，分別通過膠管與生物反應器22進料口的酸液蠕動泵、堿液蠕動泵、營養液蠕動泵連接，所述的每個發酵單元結構的控制系統均與中央處理器連接，所述的前一個發酵單元結構的出料口與下一個發酵單元結構的進料口連接，最后一個發酵單元結構的出料口與所述的接收盤連接。實施例2 全自動腸道菌群體外模擬模型的模擬效果評估本發明通過對人和雞腸道菌群連續培養，評估全自動腸道菌群體外模擬模型的模擬效果。人和雞腸道菌群連續培養，主要包括以下步驟1.制備健康人糞便或雞肓腸內容物菌群懸液稱取適量的健康人糞便或雞肓腸內容物，用滅菌和厭氧處理后的PBS稀釋成10% (IOg糞便加入100ml PBS)的懸液，用玻璃棒在厭氧環境下充分攪拌均勻后，用孔徑為2毫米的篩子過濾3次，將食物殘渣等大顆粒去除，然后收集濾液用于接種。2.發酵用培養基準備將四套發酵系統分別單獨使用，用來連續培養人和雞的腸道菌群，其中兩套發酵系統分別使用VL培養基和VI培養基來發酵培養人糞便菌群，另外兩套發酵系統分別使用 VL培養基和VI培養基來發酵培養雞肓腸內容物菌群。生物反應器的發酵體積都控制在 330ml，流加速度也控制在330ml/每天。VI培養基配方(g/L)淀粉8. 0 ；蛋白胨3. 0 ；胰蛋白胨3. 0 ；酵母提取物4. 5 ；粘液素0. 5 ;3號膽鹽0. 4 ;L-半胱氨酸鹽酸鹽0. 8 ；血紅素0. 05 ；吐溫801. 0 ；氯化鈉4. 5 ；氯化鉀2. 5 ；六水氯化鎂4. 5 ；六水氯化鈣0. 2 ；磷酸二氫鉀0. 4 ；七水硫酸鎂3. 0 ；二水氯化鈣 0. 1 ；四水氯化錳0. 32 ；七水硫酸亞鐵0. 1 ；七水硫酸鈷0. 18 ；七水硫酸鋅0. 18 ；五水硫酸銅 0. 01 ；六水氯化鎳0. 092，溶劑為水。VL培養基配方(g/L)胰蛋白胨10;牛肉浸膏2.4 ;L_半胱氨酸鹽酸鹽0.8;葡萄糖2. 5 ；酵母提取物5. 0 ；氯化鈉5. 0，溶劑為水。3.向生物反應器接種制備好的健康人糞便或雞肓腸內容物菌群懸液接種前先將培養基裝入上述實施例1所述的模型的反應器中，待高壓冷卻后再向生物反應器中接入菌群懸液，接種量為發酵液體積的10 %。4.連續發酵培養至穩定期，收集發酵液用于模擬效果的評價。將發酵液收集后，差異離心獲得細菌沉淀后，用于細菌DNA的提取和PCR-DGGE分析，結果表明連續發酵7天后，反應器進入穩定狀態，其中的菌群結構基本上不會再發生改變。這時可以收集穩定期后的發酵液用于模擬效果的評估，評估方法主要包括PCR-DGGE、 4M測序及發酵液中短鏈脂肪酸濃度的測定。從圖6和圖7可以看出，人糞便菌群用VI培養基發酵后模擬效果好，而雞肓腸內容物菌群用VL培養基發酵后模擬效果好。表1中的相關系數也表明，無論是PCR-DGGE法還是測序法，VI培養基對人糞便菌群有較好的模擬作用，而VL培養基對雞肓腸內容物菌群有較好的模擬效果。同時從表2發酵液短鏈脂肪酸的濃度也可以看出VI培養基對人糞便菌群有較好的模擬作用，而VL培養基對雞肓腸內容物菌群有較好的模擬效果。表1PCR-DGGE和測序評估原始菌群與發酵后菌群之間的相關系數
權利要求
1.一種全自動腸道菌群體外模擬模型裝置，所述的裝置包括腸道菌群體外連續培養系統，其特征在于所述的腸道菌群體外連續培養系統包括氣路系統、發酵系統、控制系統，所述的氣路系統包括氮氣瓶，所述氮氣瓶通過膠管與所述的發酵系統連通；所述的發酵系統包括發酵單元結構，所述的發酵單元結構包括帶有攪拌裝置的培養基瓶和帶有攪拌裝置的生物反應器，所述的生物反應器通過營養液蠕動泵與培養基瓶連通， 所述的培養基瓶包括培養基瓶體和培養基瓶蓋，所述的培養基瓶蓋上設有進氣口 A和排氣口 A，所述進氣口 A通過空氣過濾器與氮氣瓶相連，排氣口 A通過空氣過濾器與大氣相通； 所述的生物反應器包括反應器瓶體和反應器瓶蓋，所述的反應器瓶蓋設有進氣口 B、排氣口 B和pH探針口及可深入反應器液面的pH探針，所述的反應器瓶體為夾套模式，所述的夾套里層為反應器，夾套層設有受溫度控制系統控制的并與加溫水源相連的循環進口和循環出口，所述的溫度控制系統包括冷卻系統和加熱系統，所述夾套層裝有溫度感應器，所述的溫度感應器與溫度控制系統連接；所述反應器瓶蓋設有可通入軟管的進料口，所述的進料口通過軟管與營養液蠕動泵相連，所述反應器的側面設有預定水位高度不同的發酵液出料口 1-5個，所述出料口與接收盤連通；所述進氣口 B通過空氣過濾器與氮氣瓶相連，出氣口 B 通過空氣過濾器與大氣相通；所述控制系統包括顯示屏、中央處理器，所述的控制系統還包括與發酵單元結構相匹配的PH控制儀、溫度控制系統、體積控制系統和分別通過軟管與生物反應器進料口連接的營養液蠕動泵、酸液蠕動泵、堿液蠕動泵，所述的中央處理器接受并處理溫度控制系統和體積控制系統與PH控制儀的信號，對營養液蠕動泵、酸液蠕動泵、堿液蠕動泵、冷卻系統或加熱系統發出工作指令，所述的酸液蠕動泵與調PH值的酸液連接、堿液蠕動泵與調pH值的堿液連接；所述的體積控制系統根據設定值控制營養液蠕動泵內流體的速度；所述的PH控制儀通過導線與所述的PH探針相連，所述的pH探針將實時采集的pH數據經過可將外部世界模擬信號和計算機連接的A/D轉換后，傳輸到計算機和數字系統，經過比較判斷算法與pH 設定值進行比較后將模擬信號轉換為可識別的數字信號，并通過命令識別控制程序傳輸到中央處理器，所述的中央處理器發出命令數據控制酸液蠕動泵或堿液蠕動泵工作；所述的溫度控制系統與溫度感應器連接，所述的溫度感應器將實時采集的溫度數據經過可將外部世界模擬信號和計算機連接的A/D轉換后，傳輸到計算機和數字系統，經過比較判斷算法與溫度設定值進行比較將模擬信號轉換為可識別的數字信號，并通過命令識別控制程序傳輸到中央處理器，所述的中央處理器發出命令數據控制冷卻系統或加熱系統工作，從而改變加溫水源的溫度。
2.如權利要求1所述的全自動腸道菌群體外模擬模型，其特征在于所述帶有攪拌裝置的培養基瓶和帶有攪拌裝置的生物反應器中的攪拌裝置為位于培養基瓶或生物反應器下方的磁力攪拌器。
3.如權利要求1所述的全自動腸道菌群體外模擬模型，其特征在于所述反應器的側面設有預定水位高度不同的發酵液出料口 2 3個。
4.如權利要求3所述的全自動腸道菌群體外模擬模型，其特征在于所述反應器的側面設有預定水位高度不同的發酵液出料口 3個。
5.如權利要求1所述的全自動腸道菌群體外模擬模型，其特征在于所述的發酵系統包括1 4個發酵單元結構串聯組成，所述的每個發酵單元結構設有與自身匹配的pH控制結構的控制系統均與中央處理器連接，所述的前一個發酵單元結構的出料口與下一個發酵單元結構的進料口連接，最后一個發酵單元結構的出料口與所述的接收盤連接。
全文摘要
一種全自動腸道菌群體外模擬模型裝置，所述裝置包括腸道菌群體外連續培養系統，所述腸道菌群體外連續培養系統包括氣路系統、發酵系統、控制系統；所述發酵系統包括發酵單元結構，所述的發酵單元結構包括帶有攪拌裝置的培養基瓶和帶有攪拌裝置的生物反應器；所述控制系統包括顯示屏、中央處理器，所述控制系統還包括與發酵單元結構相匹配的pH控制儀、溫度控制系統、體積控制系統和分別通過膠管與生物反應器進料口連接的營養液蠕動泵、酸液蠕動泵、堿液蠕動泵，所述的中央處理器接受并處理控制系統的信號并發出工作指令，調節反應溫度、pH值和反應體積。本發明有益效果是提供一種操作簡單、體系穩定、應用廣泛的全自動腸道菌群體外模擬模型裝置。
文檔編號C12M1/02GK102399692SQ201110318448
公開日2012年4月4日 申請日期2011年10月19日 優先權日2011年10月19日
發明者尹業師, 朱立穎, 王欣, 雷芳 申請人:浙江省農業科學院