專利名稱：熒光假單胞菌lamp檢測(cè)試劑及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及熒光假單胞菌的檢測(cè)技術(shù)，具體涉及熒光假單胞菌LAMP檢測(cè)試劑及
試齊U盒。
背景技術(shù)：
熒光假單胞菌O^ei/i/offloftas fluorescens Migula)系假單胞菌屬，4°C時(shí)繁殖速度快，是水產(chǎn)品生產(chǎn)、貯藏和銷售過(guò)程中最易污染而引起腐敗甚至人類疾病的微生物之一， 也是3月份、5月份海洋陸源排污口的優(yōu)勢(shì)菌。假單胞菌的檢測(cè)方法主要包括血清學(xué)檢測(cè) (DAS-ELISA)、逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)。如公告號(hào)為CN101403001的發(fā)明專利，就公開(kāi)了由反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶、穩(wěn)定液、樣品預(yù)處理液、顯色液和陽(yáng)性對(duì)照液組成的試劑盒，用LAMP方法檢測(cè)銅綠假單胞菌，其中反應(yīng)液含有外引物和內(nèi)引物的2對(duì)引物，其依賴于能夠識(shí)別靶序列上6個(gè)特異區(qū)域的2對(duì)引物和一種具解旋功能且呈瀑布式擴(kuò)增的Bst DNA聚合酶，在等溫條件下可高效、快速和特異的擴(kuò)增靶序列。由于LAMP呈瀑布式擴(kuò)增，因此其擴(kuò)增效率非常高；同時(shí)，LAMP識(shí)別靶序列上6 8 個(gè)特異性位點(diǎn)，其特異性也很強(qiáng)；LAMP只在60°C 65°C進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，只要水浴鍋即可，無(wú)需特殊的儀器，操作非常簡(jiǎn)單；而且LAMP的整個(gè)檢測(cè)反應(yīng)只需1.5 h 2.5 h，檢測(cè)周期非常短。目前還沒(méi)有研究建立特異、靈敏以及操作簡(jiǎn)單的熒光假單胞菌LAMP檢測(cè)試劑及試劑
品.ο

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種對(duì)熒光假單胞菌具有特異性高、檢測(cè)周期短、成本低廉和操作簡(jiǎn)單的RT-LAMP檢測(cè)試劑及及試劑盒。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為熒光假單胞菌LAMP檢測(cè)試劑， 包括特異性引物溶液，特異性引物溶液為F3 / B3引物溶液、FIP / BIP引物溶液
和Y-LB引物溶液，所述F3 / B3引物溶液含有序列為F3 :5' -GCGCGAATAC TTCAAGTCCA -3'、B3:5' -GTACAGCTGC GAAGTCTGC - 3'的特異性引物；所述 FIP / BIP 引物溶液含有序列為 FIP:5' -AGGTGGGGTT GCTGCTGTAG AGGTCAACCT GCTGTATGTG A - 3'、BIP 5' -TGCCCAAGAC CATCCTTTCC AAACAGTTCG TTGGTGTCCG - 3'的特異性引物；所述 Y-LB 引物溶液含有序列為5' -TCAACCACGG GGAGCAT- 3'的特異性引物。上述引物系選擇熒光假單胞菌的cDNA序列為靶目標(biāo)，應(yīng)用raiMEREXPLORER V4 (http//primerexplorer. jp/eLAMP4. 0. 0/index. htmL)軟件設(shè)計(jì)合成，將設(shè)計(jì)的多對(duì)引物進(jìn)行反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，得到最合適的反應(yīng)條件。該熒光假單胞菌的cDNA 序列的的核苷酸序列為
ATGTCAAAAG TAAAAGACAA AGCTGGAAGC GGCGAAATAC CAGCGACTTT AAGGATCGTC CTATCCCGGA TTAAGGAGGG TTTATTTAGA GTGGGTCCAT GAGATTAAGG ACCTACCTTC ATCAGATCAG TCCCGTATTT TCCAGTCCTG AAGCCGCCAG CAGGTTGCTG CGTCTGTTCG CGCTCATTCT TTTGGTTGGTATCCTCGGAG CCGTCTACAA CTTCCTCAAC TCCACCCTCA GCAACGACAT TTCCCGGCGC CGCGGCTACA TGAGCAGCGC CATCGCCGAA GCCCAGACCT TCTTCACCAG CCGCGAGGCC TTGCTGGAAA GCCTCAGCCT GTCCGCGGTA CGCCGCTCCA AGCAGGCCCA GGCCCTGGTG TACCTGCCCT CCACCGAAGA ACTGCACCTG CAACTGGGCG ACCTCGATGA CCCGTGGAGC ATCTGGCTAA GTGTACGCAT GCGCGAATAC TTCAAGTCCA AGCAGGTCAA CCTGCTGTAT GTGAGCCCCG GTCCCGAGGC CCGGGTCATG CGCCTCTACA GCAGCAACCC CACCTCCCCC AACCTGCCCA AGACCATCCT TTCCAAGCTT GAGGCGCTCA ACCACGGGGA GCATCCGGAC ACCAACGAAC TGTGGCTCAC CGACCCGTCC ACGCAGACTT CGCAGCTGTA CATTTTCACC CGGCTCGACG AGCGCACCGA TGACTCCGGC TGGCTGGGCC TGGAAATGGA TGGGCGGGAA GTGCTCAAGG CCCTCAGCGA CCAGAGCGCC GGCGAGTTCA TGATGTTCAA CTCCGAAGGC GCGCTGCTGT TCACCAACAC CCCGGCCGGG CGCCTAGGGC AGGCCCTGCA ACAACTGCAA GGCAGCAACT TCTTCGGTTT CGTCGGCAGC CGCTGGTGGC CCGATCACCT GGTGATCCGC AAGCAACTGA TGACCTCCGA CTGGCAACTG GTCTACTCCT TCAGCCTGCA GTCGCTGCTG ATCGCGCTCT GGCCCCAGCT GGCCGGCGCG CTGGTGTTCT GCCTGTTCAG CATCAGCCTG ATCTGCCTGC TGACCCGCCG CATCGAGCAC CGCTTCATCA CTCCTGCGCT GAGCCGTATC CAGGCGCTGG TCGAGAGCGA GCTGTTCAGC CGCGACGTGA TCCAGACCGC GCCCGTAGCC TTGTGCGTGC TGCGGCGTAC CGATGGCCAG GTGGTCCTGG AAAACACCCT GGCGCAGCAG TGGCTGGGCG ACGGCATCGA ACGGGAAATA CTCTGCGCCG GCTGGATCCA GCAAGCCTTC AAGAGCCACG AGCCGAACCG TTTCGACTAC TTCGAGACCG CCGACGGGCG TCACCTTTAT CTGAGCTCCG TGCCCACCCG CTACAAGGGT GAAGACGTGT TGTTCTGCGC CTTCAGTGAC ATCGTAACCT GA 1412。所述F3 / B3引物溶液中F3引物和B3引物的濃度都為5 y M ；所述FIP / BIP弓丨 物溶液中FIP引物和BIP引物的濃度都為IOiiM ；所述Y-LB引物溶液中Y-LB引物的濃度 為 IOii M。由所述的熒光假單胞菌LAMP檢測(cè)試劑組成的試劑盒，由下述組份組成陽(yáng)性對(duì)照 液、陰性對(duì)照液、10 X ThermoPol反應(yīng)緩沖液、濃度為25 mM的MgC12溶液、濃度為10 mM的 dNTP液、濃度為8 U /uL的Bst DNA聚合酶液、引物濃度都為5 y M的F3 / B3引物溶液、 引物濃度都為10 ii M的FIP / BIP引物溶液、引物濃度為10 P M的Y-LB引物溶液和雙蒸水。上述熒光假單胞菌LAMP檢測(cè)試劑組成的試劑盒中，所述的10XThermoPol反應(yīng) 緩沖液為250 u L，所述的MgC12溶液為200 u L，所述的dNTP液為200 u L，所述的Bst DNA 聚合酶液為10(^し所述的ド3 / B3引物溶液為80yL，所述的FIP / BIP引物溶液為 160ii L，所述的Y-LB引物溶液為80 ii L，所述的雙蒸水為1. 5mL。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明的熒光假單胞菌LAMP檢測(cè)試劑是構(gòu) 建出上述擴(kuò)增效率和特異性好的5條F3、B3、Y-LB、FIP、BIP引物，克服了常規(guī)PCR費(fèi)時(shí)，對(duì) 設(shè)備要求高等缺點(diǎn)，由該5條特異性引物組成的試劑及試劑盒可對(duì)樣品中的熒光假單胞菌 進(jìn)行快速準(zhǔn)確的定性檢測(cè)，具有特異性好、簡(jiǎn)單易操作、結(jié)果直觀和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。具體 優(yōu)點(diǎn)如下
1、本發(fā)明與常規(guī)PCR的檢測(cè)試劑相比，具有特異、敏感的優(yōu)點(diǎn)；LAMP技術(shù)的關(guān)鍵是針 對(duì)靶基因的6 8個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)5條特異引物，當(dāng)引物完全識(shí)別靶序列結(jié)合區(qū)并匹配的情況 下才能順利進(jìn)行，這一點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了該技術(shù)的高度特異性。2、本發(fā)明與常規(guī)PCR的檢測(cè)試劑相比，操作簡(jiǎn)單，無(wú)需昂貴設(shè)備。LAMP反應(yīng)只需要 一個(gè)簡(jiǎn)單的恒溫水浴鍋，不需要昂貴的PCR儀，操作簡(jiǎn)單，成本低廉，易于在現(xiàn)場(chǎng)操作或基層推廣應(yīng)用。3、本發(fā)明與常規(guī)PCR的檢測(cè)試劑相比，具有檢測(cè)周期短的優(yōu)點(diǎn)。該方法采用一種具有解旋功能且呈瀑布式擴(kuò)增的Bst DNA聚合酶，呈恒溫?cái)U(kuò)增，不需要PCR儀升降溫的時(shí)間，也無(wú)需DNA凝膠電泳觀察，所以檢測(cè)時(shí)間非常短，擴(kuò)增效率非常高。常規(guī)PCR的樣品檢測(cè)時(shí)間一般4小時(shí)以上，而本發(fā)明的檢測(cè)時(shí)間在1. 5 h 2. 5 h左右。4、本發(fā)明與常規(guī)PCR的檢測(cè)試劑相比，結(jié)果無(wú)需PCR電泳等復(fù)雜的后處理程序，根據(jù)反應(yīng)體系是否出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象，用肉眼就可以快速定性判斷LAMP結(jié)果，具有結(jié)果直觀、判定難度小的優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。1、設(shè)計(jì)引物選擇熒光假單胞菌的cDNA為靶目標(biāo)，應(yīng)用raiMEREXPLORER V4軟件， 設(shè)計(jì)引物(包括所述5條F3、B3、Y-LB、FIP、BIP)，引物的合成由上海生工生物工程有限公司完成。將引物與靶目標(biāo)比對(duì)，常規(guī)篩選試驗(yàn)和分析，得到特異、敏感、穩(wěn)定的上述F3、B3、 Y-LB、FIP、BIP的5條引物；將設(shè)計(jì)合成的5條引物進(jìn)行反應(yīng)時(shí)間和溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)后，確定擴(kuò)增效率和特異性最好的反應(yīng)條件。2、反應(yīng)溫度優(yōu)化設(shè)計(jì)梯度LAMP反應(yīng)程序，反應(yīng)溫度依次為61°C，63°C，65°C，在這幾個(gè)溫度中優(yōu)化出63°C為最佳反應(yīng)溫度。3、適宜Mg2+濃度選擇反應(yīng)體系中的Mg2+(2. 5 mM)的添加量依次為0μ L，2. 0μ L， 4. 0 μ L，6. 0 μ L，在這幾個(gè)梯度濃度中優(yōu)化出Mg2+添加量為2. 0 μ L。4、時(shí)間梯度設(shè)計(jì)反應(yīng)時(shí)間梯度LAMP反應(yīng)程序，每管按照上述優(yōu)化體系加入LAMP 體系，反應(yīng)時(shí)間分別取30 min，45 min,60 min，75 min，優(yōu)化出最佳反應(yīng)時(shí)間60min。5、反應(yīng)體積梯度設(shè)計(jì)反應(yīng)體積梯度LAMP反應(yīng)程序，依次為12. 5 μ L，15. OyL, 17. 5 μ L，20. 0 μ L，22. 5 μ L，25 μ L，在這幾個(gè)梯度體積中優(yōu)化出25 μ L反應(yīng)體積。、特異性檢測(cè)選取熒光假單胞菌，短小芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌， 蘇云金芽孢桿菌，威爾氏李斯特菌等其他6種常見(jiàn)腐敗細(xì)菌用于LAMP特異性驗(yàn)證，反應(yīng)體系和條件同上，結(jié)果只有熒光假單胞菌為陽(yáng)性，空白對(duì)照及其余5株均是陰性。、靈敏度試驗(yàn)將熒光假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株GIM1. 209和含有該菌特異片段的質(zhì)粒 10倍倍比稀釋，取各稀釋度進(jìn)行LAMP和PCR擴(kuò)增反應(yīng)，2%的瓊脂糖凝膠電泳，LAMP方法的檢測(cè)限為3. 47拷貝/反應(yīng)，PCR方法的檢測(cè)限為3. 47 X IO2拷貝/反應(yīng)。細(xì)菌LAMP方法的檢測(cè)限為4. 3個(gè)菌/反應(yīng)，PCR方法的檢測(cè)限為4. 3 X IO2個(gè)菌/反應(yīng)。8、穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)在評(píng)估LAMP檢測(cè)熒光假單胞菌方法中的組內(nèi)和組間試驗(yàn)的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性時(shí)，用陽(yáng)性樣品和陰性樣品，在同樣反應(yīng)條件下，反復(fù)進(jìn)行LAMP檢測(cè)， 每次試驗(yàn)的每個(gè)樣品做6個(gè)平行的反應(yīng)管，重復(fù)12次，結(jié)果上述5條引物的擴(kuò)增樣品平行試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好。9、對(duì)樣品的檢測(cè)、對(duì)比試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)對(duì)無(wú)菌大黃魚(yú)樣品、感染熒光假單胞菌的大黃魚(yú)樣品以及感染腐敗希瓦氏菌，短小芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌的魚(yú)類樣品，提取DNA模板(具體常規(guī)提取方法在此不作敘述)進(jìn)行LAMP檢測(cè)，結(jié)果表明，感染熒光假單胞菌的大黃魚(yú)樣品呈陽(yáng)性。CN 102382879 A
說(shuō)明書(shū)
4/5頁(yè) 10、熒光假單胞菌LAMP標(biāo)準(zhǔn)化試劑和檢測(cè)程序 10. 1標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)試劑盒組份
權(quán)利要求
1.熒光假單胞菌LAMP檢測(cè)試劑，包括特異性引物溶液，所述特異性引物溶液為F3/ B3引物溶液、FIP / BIP引物溶液和Y-LB引物溶液，其特征在于所述的F3/ B3引物溶液含有序列為 F3 :GCGCGAATAC TTCAAGTCCA、B3 :GTACAGCTGC GAAGTCTGC 的特異性引物；FIP / BIP 引物溶液含有序列為 FIP :AGGTGGGGTT GCTGCTGTAG AGGTCAACCT GCTGTATGTG A、BIP TGCCCAAGAC CATCCTTTCC AAACAGTTCG TTGGTGTCCG的特異性引物；Y-LB引物溶液含有序列為T(mén)CAACCACGG GGAGCAT的特異性引物。
2.如權(quán)利要求1所述的熒光假單胞菌LAMP檢測(cè)試劑，其特征在于所述F3/B3引物溶液中F3引物和B3引物的濃度都為5μΜ ；所述FIP/BIP引物溶液中FIP引物和BIP引物的濃度都為10 μ M ；所述Y-LB引物溶液中Y-LB引物的濃度為10 μ Μ。
3.由權(quán)利要求1所述的熒光假單胞菌LAMP檢測(cè)試劑組成的試劑盒，其特征在于由下述組份組成陽(yáng)性對(duì)照液、陰性對(duì)照液、10 X ThermoPol反應(yīng)緩沖液、濃度為25mM的MgC12 溶液、濃度為IOmM的dNTP液、濃度為8U/yL的Bst DNA聚合酶液、引物濃度都為5 μ M的 F3 / Β3引物溶液、引物濃度都為IOyMWFIP / BIP引物溶液、引物濃度為10 μ M的Y-LB 引物溶液和雙蒸水。
4.如權(quán)利要求3所述的熒光假單胞菌LAMP檢測(cè)試劑組成的試劑盒，其特征在于所述的IOXThermoPol反應(yīng)緩沖液為250 μ L，所述的MgC12溶液為200 μ L，所述的dNTP液為 200 μ L，所述的Bst DNA聚合酶液為100 μ L，所述的F3 / Β3引物溶液為80 μ L，所述的FIP / BIP引物溶液為160 μ L，所述的Y-LB引物溶液為80 μ L，所述的雙蒸水為1. 5mL。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了熒光假單胞菌LAMP檢測(cè)試劑及試劑盒，該熒光假單胞菌LAMP檢測(cè)試劑是構(gòu)建出擴(kuò)增效率和特異性好的5條引物F3GCGCGAATACTTCAAGTCCA、B3GTACAGCTGCGAAGTCTGC、Y-LBTCAACCACGGGGAGCAT、FIPAGGTGGGGTTGCTGCTGTAGAGGTCAACCTGCTGTATGTGA、BIPTGCCCAAGACCATCCTTTCCAAACAGTTCGTTGGTGTCCG，該熒光假單胞菌LAMP檢測(cè)試劑及試劑盒克服了常規(guī)PCR費(fèi)時(shí)，對(duì)設(shè)備要求高等缺點(diǎn)，由該5條特異性引物組成的試劑及試劑盒可對(duì)樣品中的熒光假單胞菌進(jìn)行快速準(zhǔn)確的定性檢測(cè)，具有特異性好、簡(jiǎn)單易操作、結(jié)果直觀和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102382879SQ201110321179
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月21日
發(fā)明者周君, 應(yīng)琪, 張春丹, 李成華, 李曄, 蘇秀榕 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)