專利名稱：短小芽孢桿菌rt-lamp檢測試劑及檢測方法
技術領域：
本發明涉及檢測短小芽孢桿菌的檢測技術，具體涉及短小芽孢桿菌RT-LAMP檢測試劑及檢測方法。
背景技術：
短小芽孢桿菌(^aciBw1SjOTffliAz1S Meyer and Gottheil 1901)系芽孢桿菌屬，是一種能引發食源性疾病的腐敗菌，會引起頑固性甲溝炎、嬰幼兒敗血癥、產生毒素等；最近在生食水產品中也發現了大量的短小芽孢桿菌。芽孢桿菌的檢測方法主要包括血清學檢測(DAS-ELISA)、逆轉錄一聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術和環介導等溫擴增技術(LAMP)。血清學方法以雙抗體夾心酶聯檢測假單胞菌的技術，適用于多樣本的初篩，具有操作簡單的優點，但其檢測靈敏度較低，且常常由于抗體制備的質量問題而出現非特異性反應。PCR方法如公布號為CN10204U98的發明專利申請，就公開了檢測凝結芽孢桿菌的病毒核酸的技術，具有較好的敏感性和特異性，但需要進行DNA電泳等PCR后處理，操作復雜，檢測成本較高，檢測時間周期較長，需近一天， 還接觸有毒試劑溴化乙錠，易發生交叉污染而造成假陽性結果。LAMP技術由反應緩沖液、 dNTP , Bst DNA聚合酶和引物等組成，Bst DNA聚合酶可使LAMP技術呈瀑布式擴增，因此其擴增效率非常高；多對引物可使LAMP識別靶序列上的6 8個特異性位點，其特異性也很強；另外LAMP只在60°C 65°C進行恒溫擴增，只要水浴鍋即可，無需特殊的儀器，操作非常簡單；而且LAMP的整個檢測反應只需1.5 h 2.5 h，檢測周期非常短，成本低，但該技術不能檢測活的細菌。反轉錄環介導等溫擴增技術(Reverse transcript loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)，可快速檢測活菌，但原核生物的RNA分子半衰期很短(3-5 min)，具快速降解性，僅存在于活的、有代謝活性的菌體中，純化方法難度大，使得采用RT-LAMP用于活細菌檢測遇到了挑戰，目前還沒有研究建立特異、靈敏以及操作簡單的短小芽孢桿菌RT-LAMP檢測試劑及檢測方法。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種對短小芽孢桿菌具有特異性高、檢測周期短、成本低廉和操作簡單活體菌的RT-LAMP檢測試劑。本發明還公開了用該檢測試劑檢測短小芽孢桿菌的方法。本發明系選擇短小芽孢桿菌的xynA為靶序列(GenBank登錄號AY526092. 1等)， 應用 PRIMEREXPLORER V4 (http//primerexplorer. jp/eLAMP4. 0. 0/index. htmL)軟件，設計合成引物；將設計的多對引物進行反應時間和反應溫度進行優化試驗，得到最合適的反應條件。該短小芽孢桿菌的xynA的特異且保守的靶序列長度為687bp，該靶序列的核苷酸序列為
atgaatttga gaaaattaag actgttgttt gtgatgtgta ttggactgac gcttatactg 60 acggctgtac cagcccatgc gagaaccatt acgaataatg aaatgggtaa ccatagcggg 120tacgattatgaattatggaaggattatggaaatacctcgatgacactcaataacggcggg180gcatttagtgcaggctggaacaatatcggaaatgctttatttagaaaagggaaaaagttt240gattccactagaactcaccatcagcttggcaacatctccatcaattacaacgcaagtttt300aacccaggcgggaattcctatctatgtgtctatggctggacacaatctccattagcagaa360tactacattgttgattcatggggcacgtatcgtccaacaggagcgtataaaggatcattt420tatgctgatggaggcacatatgacatttatgaaacaacccgtgtcaatcagccttccatt480atcgggatcgcaaccttcaagcaatattggagtgtacgtcaaacgaaacgtacaagcgga540acggtctccgtcagtgcgcattttagaaaatgggaaagcttagggatgccaatggggaaa600atgtatgaaa cggcatttac tgtagaaggc taccaaagca gcggaagtgc aaatgtgatg660accaatcagc tgtttattgg caactaa687。引物的合成采用β —乙腈磷酸胺化學合成法，使用全自動DNA合成儀進行 OligoDNA的合成；經過大量的反應條件優選、對比試驗和驗證試驗，并經過大量實際樣品的檢測應用評估，得到擴增效率和特異性好的下述2對特異性引物。本發明的短小芽孢桿菌RT-LAMP檢測試劑，包括反應緩沖液、dNTP液、Bst DNA 聚合酶液和特異性引物溶液，特異性引物溶液為F3/ B3引物溶液和FIP/ BIP引物溶液， 所述 F3/ B3 引物溶液含有序列為F3 :5' - TCCGGAAAGC TTCCTGAAAG - 3'、B3:5'-ATAATCGGTT GCCCACTTGA - 3'的特異性引物；所述FIP/ BIP引物溶液含有序列為FIP 5' - CATCGTACCA GCCGCCTGTT CTTAACTGGC GAGGGGATTC - 3' , BIP 5' - TGGCTTACTC TGCAGCCGTG CAAGCAGCTC TGCCTCTTC - 3'。該短小芽孢桿菌RT-LAMP檢測試劑中，所述反應緩沖液為10 X ThermoPol反應緩沖液，所述dNTP液的濃度為10mM，所述Bst DNA聚合酶液的濃度為8U/ μ L，所述F3/ Β3引物溶液中引物的濃度都為5μΜ，所述FIP/ BIP引物溶液中引物的濃度都為ΙΟμΜ。利用短小芽孢桿菌RT-LAMP檢測試劑檢測短小芽孢桿菌的方法，包括下述步驟
1、RNA提取取待測樣品50 100ml，在3000r / min離心5min，棄沉淀，上清液再在 12000 r / min離心20min，沉淀物中加入700 μ L Trizol試劑和200 μ L氯仿，室溫振蕩充分混勻lOmin，4°C條件下12000 r/min離心lOmin，吸取上清，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置10min，4°C條件下12000 r/min離心lOmin，棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌， 干燥后溶于20 μ L經焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的雙蒸水中，得到短小芽孢桿菌RNA提取物，_20°C保存；取一部分可用瓊脂糖凝膠電泳檢測該RNA提取物的純度及含量；
2、合成在冰上的PCR管中加入上述短小芽孢桿菌RNA提取物1.O μ L、引物濃度都為 5 μ M的所述F3/B3引物溶液1. O μ L、無核酸酶水10 μ L，混勻后，70°C反應5min，冰上放置 30 s，離心1 3min，再順序加入5 X第一條鏈緩沖液4 μ L，濃度為20U/ μ L的RNase抑制劑1 μ L，濃度為IOmM的dNTP液2 μ L，混勻，離心1 3min，37°C放置5min，馬上加入濃度為20U / μ L的M-MLV Rtase溶液1 μ L，加無核酸酶水至終體積為20 μ L，混勻；37°C反應60min，70°C下滅活反轉錄酶lOmin，然后依說明書操作，用Oligotex mRNA純化試劑盒分離純化得到cDNA模板；
3、檢測取cDNA模板1.O μ L、10X ThermoPol反應緩沖液2. 5 μ L，濃度為IOmM的dNTP 液lyL，濃度為8U/yL的Bst DNA聚合酶液1 μ L，引物濃度都為10 μ M的FIP / BIP引物溶液1. 6 μ L，引物濃度都為5 μ M的F3/B3引物溶液0. 8 μ L，雙蒸水補到25 μ L，恒溫水浴63°C加熱45min，產生白色沉淀即確定待測樣品含有短小芽胞桿菌。上述Trizol試劑、5X第一條鏈緩沖液、RNase抑制劑、dNTP液、M-MLV Rtase溶液、10 X ThermoPol反應緩沖液和Bst DNA聚合酶液均購自TaKaRa公司。Oligotex mRNA 純化試劑盒購于Oligotex公司。上述引物由上海生工生物工程有限公司合成。本發明優點在于該短小芽孢桿菌RT-LAMP檢測試劑是構建出上述擴增效率和特異性好的2對引物，克服了常規RT-PCR費時，對設備要求高等缺點，可對樣品中的短小芽孢桿菌活體進行快速準確的定性檢測，具有特異性好、簡單易操作、結果直觀和成本低廉等優點。具體優點如下
1、本發明與常規RT-PCR的檢測試劑相比，具有特異、敏感的優點；RT-LAMP技術的關鍵是針對靶基因的6 8個區域設計2對特異引物，當引物完全識別靶序列結合區并匹配的情況下才能順利進行，這一點實現了該技術的高度特異性。2、本發明與常規RT-PCR的檢測試劑相比，操作簡單，無需昂貴設備。RT-LAMP反應只需要一個簡單的恒溫水浴鍋，不需要昂貴的PCR儀，操作簡單，成本低廉，易于在現場操作或基層推廣應用。3、本發明與常規RT-PCR的檢測試劑相比，具有檢測周期短的優點。該方法采用一種具有解旋功能且呈瀑布式擴增的Bst DNA聚合酶，呈恒溫擴增，不需要PCR儀升降溫的時間，也無需DNA凝膠電泳觀察，所以檢測時間非常短，擴增效率非常高。常規RT-PCR的樣品檢測時間一般4小時以上，而本發明的檢測時間在1. 5 h 2. 5 h左右。4、本發明與常規RT-PCR的檢測試劑相比，結果無需PCR電泳等復雜的后處理程序，可以通過白色沉淀或加入染色劑，用肉眼來快速定性判斷RT-LAMP結果，具有結果直觀、判定難度小的優點。5、本發明與常規方法相比，可檢測活細菌，對那些在食品腐敗的過程中，起決定性作用的短小芽胞桿菌活體或芽胞進行早期快速檢測。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。1、引物設計和合成通過 GenBank (登錄號AY5^092. 1、EU421717. 1 ；EF090270 等)選擇短小芽孢桿菌的xynA特異且保守片段(687bp)為靶序列，應用TOIMEREXPLORER V4 軟件，設計引物，將引物與短小芽孢桿菌的xynA比對，常規篩選試驗和分析，用常規的β -乙腈亞磷酸胺化學合成法合成引物，得到特異、敏感、穩定的F3/B3、FIP/BIP 二對引物。2、短小芽孢桿菌RT-LAMP檢測試劑組成10XHiermoPol反應緩沖液，濃度為 IOmM的dNTP液，濃度為8 U/μ L的Bst DNA聚合酶液，F3、Β3引物濃度都為5μΜ的F3/ Β3引物溶液，FIP、BIP引物濃度都為IOyM的FIP/ BIP引物溶液。3、RNA提取取待測樣品50-100ml，在3000 r / min離心5min，棄沉淀，上清液再在12000 r / min離心20min，沉淀物中加入700 μ L Trizol試劑和200 μ L氯仿，室溫振蕩充分混勻10min，4°C條件下12000 r/min離心10 min，吸取上清，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置10 min，4°C條件下12000 r/min離心lOmin，棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌，干燥后溶于20 μ L經DEPC處理過的雙蒸水中，得到短小芽孢桿菌RNA提取物，_20°C保存；取一部分可用瓊脂糖凝膠電泳檢測該RNA提取物的純度及含量。
4、cDNA合成在冰上的PCR管中加入上述短小芽孢桿菌RNA提取物1. 0 μ L、各引物濃度都為5 μ M的F3/B3引物溶液1. 0 μ L、無核酸酶水10 μ L，混勻后，70°C反應5min，冰上放置30 8，離心1 ；31^11，再順序加入5\第一條鏈緩沖液4 4 1^，濃度為2(^ /μ L的 RNase抑制劑1 μ L，濃度為IOmM的dNTP液2 μ L，混勻，離心1 3min，37°C放置5min，馬上加入濃度為20 U/μ L的M-MLV Rtase溶液1 μ L，加無核酸酶水至終體積為20 μ L，混勻； 37°C反應60 min, 70°C下滅活反轉錄酶lOmin，然后依說明書操作，用Oligotex mRNA純化試劑盒分離純化得到cDNA模板；
5、RT-LAMP檢測取上述cDNA模板1. Ομ LUOX ThermoPol反應緩沖液2. 5 μ L，濃度為IOmM的dNTP液1 μ L，濃度為8U/ μ L的Bst DNA聚合酶液1 μ L，引物濃度都為10 μ M 的FIP/BIP引物溶液1. 6 μ L，引物濃度都為5 μ M的F3/B3引物溶液0. 8 μ L，雙蒸水補到 25 μ L，恒溫水浴63°C加熱45min，產生白色沉淀即確定待測樣品含有短小芽胞桿菌。6、擴增條件優化取短小芽孢桿菌cDNA模板1. O μ L，按照RT-LAMP檢測方法，分別在 60°C、61°C、63°C、64°C和 65°C 的溫度條件，時間 30min、45min 和 60min、MgCl2 (2. 5mM) 加入量O μ L、1 μ L、2 μ L、3 μ L和4 μ L，以在試管地有無白色沉淀為陽性，結果顯示溫度 630C、時間45min為佳；每次檢測時，設立空白對照和陰性對照，每個樣品檢測做3管平行實驗，在空白對照、陰性對照為陰性。7、敏感性試驗選擇短小芽孢桿菌，腐敗希瓦氏菌，熒光假單胞菌，地衣芽孢桿菌， 枯草芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，威爾氏李斯特菌等(均購自廣東省微生物菌種保藏中心) 的DNA為模板進行特異性檢測，依上述RNA提取、cDNA合成和RT-LAMP檢測，結果只有短小芽孢桿菌有生成沉淀，腐敗希瓦氏菌，熒光假單胞菌，地衣芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，威爾氏李斯特菌都呈陰性。8、特異性試驗對感染短小芽孢桿菌的養殖大黃魚樣品，依上述RNA提取和cDNA 合成，用常規RT-PCR檢測和上述本發明的RT-LAMP檢測，比較它們的敏感性；結果本發明的 RT-LAMP檢測靈敏度為16. 2拷貝/反應，要比常規RT-PCR方法的檢測靈敏度162拷貝/ 反應高出1個數量級。9、穩定性和重復性實驗在同樣反應條件下，反復進行RT-LAMP檢測，每次實驗的每個樣品做6個平行的反應管，重復12次，結果本發明的2對引物的擴增樣品平行實驗陽性結果穩定，重復性好；因此？1 、81 ，？3、83 二對引物特異、敏感、穩定。10、驗證實驗對無菌大黃魚樣品、感染短小芽孢桿菌、腐敗希瓦氏菌，熒光假單胞菌，地衣芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌的大黃魚樣品，依上述RNA提取、cDNA合成和RT-LAMP檢測方法，進行RT-LAMP檢測，結果表明，只有感染短小芽孢桿菌樣品有沉淀反應，其他均為陰性。
權利要求
1.短小芽孢桿菌RT-LAMP檢測試劑，包括反應緩沖液、dNTP液、BstDNA聚合酶液和特異性引物溶液，特異性引物溶液為F3/ B3引物溶液和FIP/ BIP引物溶液，其特征在于所述 F3/ B3 引物溶液含有序列為 F3 :5' - TCCGGAAAGC TTCCTGAAAG - 3'、B3 -ATAATCGGTT GCCCACTTGA - 3'的特異性引物；所述FIP/ BIP引物溶液含有序列為FIP 5' - CATCGTACCA GCCGCCTGTT CTTAACTGGC GAGGGGATTC - 3' , BIP 5' - TGGCTTACTC TGCAGCCGTG CAAGCAGCTC TGCCTCTTC - 3'。
2.如權利要求1所述的短小芽孢桿菌RT-LAMP檢測試劑，其特征在于該短小芽孢桿菌 RT-LAMP檢測試劑中，所述反應緩沖液為10XThermoPol反應緩沖液，所述dNTP液的濃度為10mM，所述Bst DNA聚合酶液的濃度為8U/yL，所述F3/ B3引物溶液中引物濃度都為 5 μ M，所述FIP/ BIP引物溶液中引物濃度都為10 μ Μ。
3.利用權利要求2所述的短小芽孢桿菌RT-LAMP檢測試劑檢測短小芽孢桿菌的方法， 其特征在于包括下述步驟1) RNA提取取待測樣品50 100ml，在3000r/min離心5min，棄沉淀，上清液再在 12000r/min離心20min，沉淀物中加入700 μ L Trizol試劑和200 μ L氯仿，室溫振蕩充分混勻10min，4°C條件下12000r/min離心lOmin，吸取上清，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置10min，4°C條件下12000r/min離心lOmin，棄上清，沉淀用質量濃度為70%的乙醇洗滌，干燥后溶于20 μ L經焦碳酸二乙酯處理過的雙蒸水中，得到短小芽孢桿菌RNA提取物，-20°C保存；2cDNA合成在冰上的PCR管中加入上述短小芽孢桿菌RNA提取物1. O μ L、各引物濃度都為5 μ M的所述F3/B3引物溶液1. O μ L、無核酸酶水10 μ L，混勻后，70°C反應5min，冰上放置30s，離心1 3min，再順序加入5 X第一條鏈緩沖液4 μ L，濃度為20U/μ L的RNase 抑制劑1 μ L，濃度為IOmM的dNTP液2 μ L，混勻，離心1 3min，37°C放置5min，馬上加入濃度為20U/ μ L的M-MLV Rtase溶液1 μ L，加無核酸酶水至終體積為20 μ L，混勻；37°C反應60 min, 70°C下滅活反轉錄酶lOmin，然后依說明書操作，用Oligotex mRNA純化試劑盒分離純化得到cDNA模板；3)檢測取上述cDNA模板1. O μ L、10X ThermoPol反應緩沖液2. 5 μ L，濃度為IOmM 的dNTP液1 μ L，濃度為8U/ μ L的Bst DNA聚合酶液1 μ L，引物濃度都為10 μ M的FIP / BIP引物溶液1.6 μ L，引物濃度都為5 μ M的F3 / Β3引物溶液0. 8 μ L，雙蒸水補到25 μ L， 恒溫水浴63°C加熱45min，產生白色沉淀即確定待測樣品含有短小芽胞桿菌。
全文摘要
本發明公開了短小芽孢桿菌RT-LAMP檢測試劑及檢測方法，該短小芽孢桿菌RT-LAMP檢測試劑是構建出2對特異性引物TCCGGAAAGCTTCCTGAAAGB3/ATAATCGGTTGCCCACTTGA，CATCGTACCAGCCGCCTGTTCTTAACTGGCGAGGGGATTC/TGGCTTACTCTGCAGCCGTGCAAGCAGCTCTGCCTCTTC，檢測方法通過RNA提取、合成和檢測，克服了常規RT-PCR費時，對設備要求高等缺點，可對樣品中的短小芽孢桿菌進行快速準確的定性檢測，該短小芽孢桿菌RT-LAMP檢測試劑具有特異性好、簡單易操作、結果直觀和成本低廉等優點。
文檔編號C12Q1/04GK102382880SQ20111032119
公開日2012年3月21日 申請日期2011年10月21日 優先權日2011年10月21日
發明者周君, 應琪, 張春丹, 李成華, 李曄, 蘇秀榕 申請人:寧波大學