專利名稱：青藏高原野生大麥HsCIPK5基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，尤其是青藏高原野生大麥HsCIPK5基因。
背景技術：
青藏高原的禾本科野生種質資源非常豐富，尤其是其特有的一年生野生大麥 (Hordeum spontoneum C. Koch)，一直是國際矚目的珍貴的禾本科野生資源，是尚待開發利用的國寶。由于長期生長在各種惡劣環境下，經過漫長的自然進化，形成了與之相適應的獨特的抗(耐)性基因網絡(Nevo et al.，1997)，以及豐富的等位變異，具有很大的利用價值。近年來，我們在國家自然科學基金重點項目的資助下，已經對這批野生資源環境脅迫耐性下的表觀特征，生理指標進行了篩選與鑒定，系統地分析了其遺傳構成、轉錄本與蛋白組特征，獲得了一批抗(耐)鹽、干旱、凍害、鋁毒等的基因資源，取得了具有自主知識產權的階段性研究成果。在當前國際間愈演愈烈的“基因大戰”的勢態下，利用現代生物技術，系統地對這批野生資源的優異逆境抗性等位基因及其調控元件進行克隆，并在禾本科近緣主要農作物(水稻)以及模式植物擬南芥中進行功能驗證，將為今后有效地通過轉基因手段改良重要糧食作物的非生物脅迫抗(耐)性，提供候選基因資源，并在利用珍貴野生資源特異基因方面，在國際上取得主動的地位。干旱、凍害、鹽漬、酸性土壤等是植物在自然界遭受的主要環境脅迫因子，嚴重影響作物的生長與產量。相應地，植物在長期適應自然環境中，也發展了一系列環境脅迫耐 (抗)機制，能夠在形態結構、生理生化、分子遺傳及信號傳遞等方面對脅迫做出一系列響應。隨著對植物逆境響應機制研究的深入與現代分子生物學技術的迅速發展，人們開始擺脫費力耗時的傳統育種方式，轉而通過轉基因等遺傳手段大量地改造現有農作物，以期獲得抗逆、優質、高產、環保農作物新品種。迄今，模式植物的研究結果表明，耐逆境基因位點 (調控區域與編碼區域)決定著基因型某一非生物脅迫耐性，或者非生物脅迫總體耐性表現的差異。然而，目前我國(水稻等禾本科糧食作物)主要糧食作物的品種均源自少數骨干親本，這些品種中存在于上述(與逆境抗性相關的)基因位點上的等位基因并不太豐富，在長期的馴化過程，丟失了許多優異等位基因資源。然而，這些優異等位基因資源在青藏高原野生大麥中卻比較豐富。根據我們的前期研究，青藏高原野生大麥中的DNA多態性豐富程度，比馴化品種高40%以上。通過逆境抗性位點上等位基因的篩選，將攜帶某等位基因的野生資源與該資源在逆境條件下的抗性表現聯系起來分析，并通過超表達設計，驗證在水稻中的抗性表現，在國內外還沒有嘗試，很大程度上是因為缺乏特異禾本科野生資源。遺傳理論和育種實踐均已表明，種質資源，特別是特異種質資源的發掘與利用是育種目標能否實現的基礎與關鍵。青藏高原是世界大麥起源中心之一，大麥種質資源非常豐富，尤其是其所獨有的一年生野生大麥(Hordeum spontoneum C. Koch)，一直是國際大麥界所矚目的珍貴野生資源。由于長期生長在各種惡劣環境中，形成了與之相適應的遺傳控制系統(Nevo et al.，1997)，表現出很強的環境脅迫耐性。近緣野生資源有多年生野生大麥與一年生野生大麥兩類，對多年生野生大麥H. Bulbosum(球莖大麥)和H. Chilense (智利大麥)，人們雖曾進行過不少研究，但至今尚未通過轉基因技術將其有利性狀的等位基因導入近緣禾本科糧食作物(如水稻)的成功例證。一年生野生大麥是品種改良上可以儲備并加以利用的初級基因庫(Nevo et al.，1992 ；Ceccarelli et al.，1995)。一年生野生大麥主要分布在中東的“肥沃月灣”(Fertile Crescent)地區和我國的青藏高原。目前國際上對一年生野生大麥的研究主要限于中東類型，且該地區的野生大麥已經在麥類作物遺傳改良中發揮了巨大的作用。中東地區一年生野生大麥的研究已經相當程度為品種改良所利用。由于受特殊的地理和社會環境的限制，目前國外對青藏高原一年生野生大麥的研究較少，但一些研究者對間接獲得的零星或少量材料進行過研究，并從中鑒定到一些特殊的遺傳材料(Kaneko et al.，2000 ；KOnishi，2001)。國內對青藏高原一年生野生大麥種質資源也有過研究。“六五” 期間，國家曾組織有關專家對青藏高原的大麥種質資源進行考查與收集；“七五”和“八五” 期間，全國進行了栽培大麥、野生大麥資源的編目、繁種和鑒定工作。徐廷文等對“六五”期間收集的一年生野生大麥標本進行了鑒定整理，將其歸屬為1個種，兩個亞種，計32個變種，其中野生退化二棱、野生裸粒二棱，野生六棱為世界稀有變種，計200多個株系。邵啟全 (中國科學院)、馬得泉(中國農科院)等對一年生野生大麥的農藝性狀進行了較為系統的研究；張國平(浙江大學)等在研究西藏大麥葡聚糖含量基因型差異的基礎上(aiang et al.，2002)，開展了耐鹽和抗旱材料的鑒定研究。張啟發(華中農業大學)、丁毅(武漢大學)等則在野生大麥的起源與進化及分子生物學方面開展研究(Yin et al. ,2003 ；Li et al.，2004)。孫東發等利用青藏高原一年生野生大麥資源育成了中國第一個核質互作大麥雄性不育系88BCMS及6個早熟、矮桿大麥新品種(川農大1號、川農大2號、華大麥1號、華大麥2號、華大麥3號、華大麥4號)，并獲得了 9份特異抗旱、抗寒、耐鹽堿、特殊釀造品質材料。以上研究顯示出青藏高原大麥一年生野生大麥資源的利用上具有很大的潛力。然而， 我國對青藏高原一年生野生大麥資源的研究，總體上與發掘和利用這些資源的要求差距甚遠，對其蘊藏的環境脅迫耐性等位基因的克隆與通過轉基因手段跨物種利用的研究開展甚少。現代基因組學的快速發展，為種質資源的研究帶來全新的理論與技術手段，使我們得以在整個基因組的視野范圍內與分子微觀水平上解析農藝性狀的遺傳本質。基因組學技術在種質資源上的應用早期側重于各類分子標記的發展、核心種質資源(core collection)的建立、基因型鑒定(genotyping)、重要農藝性狀(包括QTL性狀)的基因作圖與定位等，近年來更注重特異基因的發掘、基因的克隆與功能研究。 鈣是植物信號轉導途徑中一個重要的第二信使，細胞通過各種鈣感受器解碼鈣信號，激活下游的基因表達和生理反應。其中，類鈣調磷酸酶B亞基蛋白(calcineurin B-Iike protein, CBL)是一類典型的鈣感受器，與其靴蛋白CIPK (CBL-interacting protein kinase)蛋白激酶構成了獨特的鈣信號網絡系統，在調控植物逆境應答中起重要作用。CIPK 是植物特有、與CBL特異作用的一類絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。Cira的C端區域含有一個獨特的21- 個氨基酸組成的調節域即NAF結構域(圖IA和B)，也稱FISL motif。這一調節域的序列在所有Cira中高度保守，其中A，F和L殘基是完全保守。它在N端有一特異的催化結構域，在結構上與酵母 SNFl (sucrose non-fermenting)、動物 AMPK (AMP-activated protein kinase)極其相似，所以CIPKs被認為是植物SNFl-類似激酶(SnRK)三大亞族之一，即SnRK3亞族，該結構域高度保守。CIPKs基因家族中位于N端的Ser/Thr/Tyr即絲/ 蘇/酪氨酸激酶域和靠近C端的NAF/FISL結構域在整個基因家族中都是高度保守的，因此也成為判斷未知基因序列是否屬于CIPKs的一種有效方法。目前，在已完成基因組測序工作的植物中，相關學者已從擬南芥中鑒定出沈個 AtCIPKs, 31個水稻OsCII3Ks, 43個玉米ZmCII3Ks, 27個胡楊PtCII3Ks,其他如棉花、番茄、葡萄、高粱等物種中也有相繼報道。根據已有的研究結果，植物cira主要參與各種逆境脅迫的信號傳導。由于目前大麥基因組測序仍未完成，無法確定其含有多少個HsCira基因，但理論上野生大麥基因組中至少應包含31個HsCIPKs基因家族成員。從基因結構上來看， AtCira基因分為多內含子基因和少內含子基因，通過轉錄表達和功能分析表明，Cira基因是否含有內含子與其對應的逆境脅迫沒有明顯關系。已有研究表明CBL與Cira之間并不是簡單的一對一關系，一個CBL可以與多個CII3K相結合，多個CBL也可以和一個CII3K互作， 一種脅迫可能引起多種CBL-CII3K互作。已有的研究證明，AtCIPKH基因可能參與糖信號調節途徑，0sCIPK2, OsCIPKlO, OsCIHQ 1和OsCII3KH基因在高鹽、低溫等逆境下表達量都有不同程度的變化，可能參與了多條逆境信號轉導途徑。表達序列標簽(expressed sequence tags, EST)是對某個基因cDNA克隆測序所得的部分序列片段，長度大約為200 600bp由于基因表達調控作用不同，同一個基因的 mRNA剪接位點和方式不同，所以同一個基因的全長cDNA可能包含多個EST。EST既代表了基因cDNA的某一區段，也表征了成熟mRNA可能的剪接方式。電子克隆技術是生物學數據庫中EST數據庫、核酸序列數據庫、基因組數據庫，采用同源性序列比對和歸類分析、重疊區域組裝和拼接等方法延長EST序列，直至沒有與之同源的序列可供拼接為止，所得到的序列可以認為是相對應基因的全長cDNA，根據所得的cDNA序列設計囊括開放閱讀框兩端的引物，進行RT-PCR克隆出相應基因的方法。轉座子標簽法，DNA亞克隆，電子克隆(Cloning In Silico)，Tail-PCR, iPCR(Inverse PCR)，TD-PCR(Touchdown-PCR), RACE (cRACE、3，-RACE,5' -RACE)等技術都是分子克隆中常用的技術。此外隨著轉座子的深入研究及測序技術的飛躍發展，直接分離鑒定新基因的難度變得越來越小。

發明內容
本發明利用水稻OsCira同源基因序列設計電子探針，從已有的各種大麥核苷酸序列庫如EST庫中搜索同源片段，然后用聚類分析和電子拼接等方法，獲取目標基因編碼序列(coding sequence，⑶S)。運用生物信息學方法對目標基因進行結構分析和功能預測。 提取野生大麥總RNA，制備cDNA和設計PCR引物，通過PCR技術克隆目標基因。對所獲得的目標基因進行TA克隆、測序和序列分析。青藏高原野生大麥HsCIPK5基因，其特征在于源于青藏高原一年生野生大麥且它是植物所特有、與CBL (calmodulin B-Iike protein，CBL)特異作用的一類絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，其由SEQ ID NO 1的核苷酸序列定義。所述的青藏高原野生大麥HsCIPK5基因，其特征在于它在N端有一特異的催化結構域，C端區域含有一個獨特的21-M個氨基酸組成的調節域即NAF結構域，這兩個調節域的序列在所有CII3K中高度保守，，所述的青藏高原野生大麥HsCIPK5基因，其編碼SEQ ID NO 2定義的氨基酸序列本發明從青藏高原一年生野生大麥(Hordeum spontoneum C. Koch)中鑒定并分離出HsCIPK5基因。


圖1為CIPKs基因結構、示激酶域和NAF結構域圖2為本發明的技術路線圖；圖3為本發明HsCIPK5電泳結果；圖4為pMD18T: :HsCIPK5陽性克隆鑒定結果；圖5為本發明HsCIPK5蛋白結構；圖6為本鹽誘導HsCIPK5基因的Real-time PCR圖。
具體實施例方式由于目前大麥基因組仍未公布，因此，本發明所克隆到的目標基因與水稻同源基因進行序列分析時，不匹配的核苷酸位點很可能是SNP (single nucleotide polymorphism)位點，但也還能排除是PCR或測序過程中產生的誤差。為避免這一點本發明對目標基因進行獨立重復克隆和測序。實施例1本發明所采用的技術路線如圖2所示。1.根據相關文獻，從各種數據庫中檢索獲取禾本科其他物種(如水稻、小麥、高粱、玉米)中已知CIPK5基因序列，并根據外顯子和內含子的編碼規則和排布方式搜索和定位開放閱讀框ORF (open read frame)，進而獲取完整編碼序列CDS (coding sequence)。2.用0sCIPK5的完整或部分保守序列為探針，檢索比對(nBlast或tBlastn)大麥的各種核苷酸序列庫，推測其中同源性較高的一條序列可能為野生大麥中HsCIPK5的部分序列，則將該序列列為種子序列進行下一步電子拼接和延伸。3.以種子序列為探針，重復檢索上述數據庫將檢索得到的同源序列保存到PC機上，運行DNAMar軟件包，將上述序列輸入，由于基因測序是借助質粒載體完成的，序列中難免混有載體序列，因此需要運行程序查找載體序列，對序列進行末段修剪去掉冗余部分4.程序根據外顯子和內含子的編碼規則和排布方式搜索和定位開放閱讀框；接著，程序對各段序列的重復序列和差異序列進行逐一檢索和比對，并對重疊區域進行拼接和組裝，構建重疊序列群(Contig)5.以構建的重疊序列群為信息標簽，進一步檢索比對，搜索其高度同源序列如果發現了與之高度同源的未知序列，則重復上述步驟；若沒有新的發現，說明拼接組裝得到的 EST可能囊括了所有可能的目的基因序列。6.以此EST序列為cDNA序列，對其設計囊括整個開放閱讀框的一對特異性引物。7.提取野生大麥總RNA，合成cDNA，并進行PCR克隆。8.對PCR產物進行TA克隆、測序、序列分析。根據已有的研究結果，植物CIPKs主要參與各種逆境脅迫響應或養分吸收等的信號傳導。如水稻中30個CIPKs對逆境脅迫的響應，其中20個至少響應干旱、高鹽、低溫和 ABA等脅迫中的一種，響應干旱和高鹽的OsCIPKs對ABA脅迫也有響應。又如鉀高效利用候選基因水稻 0sCIPK3、0sCIPK9、0sCBL2、0sCBL3、0sCBL4、0sCBL5、0sCBL6、0sCBL7、0sCBL8和OSCBLIO基因和擬南芥AKTl、CIPK23、CBLl和CBL9基因。青藏高原野生大麥長期適應極端生境，其CIPKs很可能在逆境脅迫響應或養分吸收等方面具有更強的生物學功能。因此，本發明從青藏高原野生大麥中所克隆到的HsCIPK5很可能在養分高效利用或耐逆境農作物新品種培育中具有重要應用價值。實施例2HsCIPK5基因全序列的獲得1. 1引物設計(帶下劃線的為酶切位點序列)HsCIPK5-KpnI-F :CGGGGTACCATGGAGAGGAAGTCCACCATCCTCATGHsCIPK5-XbaI-R :TGCTCTAGATTAAATGACATTCCTTTTGGTCGACTT表1反應體系
權利要求
1.青藏高原野生大麥HSCIPK5基因，其特征在于源于青藏高原一年生野生大麥且它是植物所特有、與CBUcalmodulin B-Iike protein，CBL)特異作用的一類絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，其由SEQ ID NO 1的核苷酸序列定義。
2.根據權利要求1所述的青藏高原野生大麥HsCIPK5基因，其特征在于它在N端有一特異的催化結構域，C端區域含有一個獨特的21-M個氨基酸組成的調節域即NAF結構域， 這兩個調節域的序列在所有Cira中高度保守，所述的青藏高原野生大麥HsCIPK5基因，其編碼SEQ ID NO :2定義的氨基酸序列。
全文摘要
本發明公開了青藏高原野生大麥HsCIPK5基因，其特征在于，其由SEQ ID NO1的核苷酸序列定義。本發明利用水稻OsCIPK同源基因序列設計電子探針，從已有的各種大麥核苷酸序列庫如EST庫中搜索同源片段，然后用聚類分析和電子拼接等方法，獲取目標基因編碼序列(coding sequence，CDS)。運用生物信息學方法對目標基因進行結構分析和功能預測。提取野生大麥總RNA，制備cDNA和設計PCR引物，通過PCR技術克隆目標基因。對所獲得的目標基因進行TA克隆、測序和序列分析。
文檔編號C12N15/54GK102399800SQ201110321520
公開日2012年4月4日 申請日期2011年10月21日 優先權日2010年12月23日
發明者沈金秋, 潘建偉, 王文祥, 鄭仲仲, 馬伯軍 申請人:浙江師范大學