本發明屬于微生物應用技術領域，涉及一種植物乳桿菌在制備食品或藥品中的應用。

背景技術：

牦牛酸乳是青藏高原藏族地區的一種自然發酵乳制品，含有豐富的營養成分，具有抗氧化、降低膽固醇、調節免疫力的作用。由于特殊的自然發酵條件，包括發酵原料乳、發酵溫度、發酵時間、發酵器皿，特別是特殊的發酵微生物組成，造成牦牛酸乳具有特殊風味及品質。

人類潰瘍性結腸炎是一種2型輔助性t細胞(th2)介導的炎癥性腸病，其病因和發病機制尚不清楚，治療進展緩慢且缺乏特異性。噁唑酮誘導的結腸炎是一種il-4介導的th2型炎癥，其組織學特征和炎癥分布均類似人類潰瘍性結腸炎，因此，噁唑酮誘導的小鼠結腸炎模型可作為潰瘍性結腸炎發病機制研究和評估藥物療效或功能性食品生理活性作用的有益工具。

技術實現要素：

本發明的目的在于通過噁唑酮誘導的小鼠結腸炎模型，考察從牦牛酸乳中分離得到的植物乳桿菌ys4對潰瘍性結腸炎的預防效果，以便研發能夠預防潰瘍性結腸炎的食品或藥品。

經研究，本發明提供如下技術方案：

保藏編號為cctccno：m2016750的植物乳桿菌ys4(lactobacillusplantarumys4)在制備預防潰瘍性結腸炎的食品或藥品中的應用。

植物乳桿菌ys4(lactobacillusplantarumys4)是從青海玉樹藏族自治州的牦牛酸乳中分離得到，于2016年12月14日保藏于中國典型培養物保藏中心(簡稱cctcc，地址：湖北省武漢市武昌區八一路299號武漢大學)，保藏編號為cctccno：m2016750。

本發明是在噁唑酮誘導balb/c小鼠結腸炎后，通過測定血清和結腸組織中相關指標檢測植物乳桿菌ys4的結腸炎預防效果。實驗結果顯示，植物乳桿菌ys4能顯著降低結腸炎小鼠的疾病活動指數(diseaseactivityindex，dai)，抑制結腸炎造成的結腸長度縮短，提高結腸重量/結腸長度的比值；可以顯著降低結腸炎小鼠結腸組織髓過氧化物酶(mpo)、no、mda含量和提高gsh含量；還可以顯著提高結腸炎小鼠血清中il-2水平和降低il-10水平。rt-pcr實驗結果顯示，植物乳桿菌ys4可以顯著上調結腸炎小鼠結腸組織中神經型nos(nnos)、內皮型nos(enos)、c-kit、scfmrna表達，下調誘生型nos(inos)、il-8、cxcr2mrna表達。由此可見，植物乳桿菌ys4對噁唑酮誘導的小鼠結腸炎具有良好的預防效果，可用于制備預防潰瘍性結腸炎的食品或藥品。

本發明的有益效果在于：本發明提供了植物乳桿菌ys4在制備預防潰瘍性結腸炎的食品或藥品中的應用，不僅擴大了植物乳桿菌ys4的應用范圍，提高了其應用價值，而且給潰瘍性結腸炎的治療或保健帶來了新的希望。

附圖說明

圖1為植物乳桿菌ys4的基因組dna的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中m為λdna/hindⅲmarker，1為植物乳桿菌ys4的基因組dna。

圖2為植物乳桿菌ys4的16srdna基因片段的pcr擴增結果，其中m為dnamarker，c為陰性對照，1為植物乳桿菌ys4的16srdna基因片段的pcr擴增產物。

圖3為植物乳桿菌ys4對噁唑酮誘導結腸炎小鼠結腸組織nnos、enos和inosmrna表達的影響。

圖4為植物乳桿菌ys4對噁唑酮誘導結腸炎小鼠結腸組織c-kit和scfmrna表達的影響。

圖5為植物乳桿菌ys4對噁唑酮誘導結腸炎小鼠結腸組織il-8和cxcr2mrna表達的影響。

圖3至圖5中，lb表示保加利亞乳桿菌，lp-ys4表示植物乳桿菌ys4。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明的優選實施例進行詳細的描述。

實施例1、植物乳桿菌ys4的分離和鑒定

一、乳酸菌的分離純化

采集青海玉樹藏族自治州牧民家庭的自然發酵牦牛酸乳樣品10份，每份樣品用無菌玻棒充分攪勻后，吸取50ml放入無菌離心管中，置于食品采樣箱內帶回實驗室，4℃冰箱保存。

每份牦牛酸乳樣品取1ml，用滅菌生理鹽水作10倍梯度稀釋至10^-7。取10^-5、10^-6、10^-7三個稀釋度各1ml稀釋液分別于裝有15mlmrs培養基(含質量比為5％的caco3)的平皿中，混勻，置30℃恒溫箱培養72±3h。每個稀釋度作三個平行。菌落形成后，觀察其形態特征，挑取有溶鈣圈的不同菌落分別接種于脫脂乳培養基中，置30℃培養24～48h，待菌株生長良好后，劃線接種于mrs瓊脂培養基，置30℃培養48h；重復以上步驟至少三次，直至得到純菌落。

將純菌株在mrs固體培養基上劃線，置30℃培養48h，用10倍放大鏡觀察菌落大小、形狀等表觀特征，進行革蘭氏染色，挑取形態典型的菌株進行過氧化氫酶試驗。將革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗陰性的球菌菌株和桿菌菌株，暫定為乳酸菌。

二、乳酸桿菌的鑒定

將初步篩選出的乳酸桿菌菌株分別進行生長溫度試驗(10℃、15℃、45℃、60℃,30min)、ph值梯度試驗、運動性試驗、接觸酶試驗、氧化酶試驗、硫化氫試驗、明膠液化實驗、硝酸鹽還原試驗、吲哚試驗、葡萄糖產氣試驗、聯苯胺試驗、石蕊牛乳試驗、精氨酸產氨試驗、酪素分解試驗以及各種糖醇發酵試驗。

結果從10份牦牛酸乳樣品中共分離純化出20株乳酸桿菌，均為革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗陰性。通過形態學觀察和生理生化試驗，將這20株菌株初步鑒定為7種乳酸桿菌，依次編號為lb1～lb7，其中，編號為lb7的乳酸桿菌初步鑒定為植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)(表1)。

表1編號為lb7的乳酸桿菌的形態學特征和生理生化試驗結果

注：+，陽性；－，陰性；+w，弱陽性。

三、植物乳桿菌的鑒定

取編號為lb7的乳酸桿菌液體培養的菌懸液，離心棄上清，收集菌體，按照細菌基因組dna提取試劑盒(北京索萊寶科技公司)所述方法提取基因組dna，進行瓊脂糖凝膠電泳(凝膠質量比濃度0.8％，電壓80v，電泳80min)，用gelred核酸染料染色后，在凝膠成像系統中觀察(圖1)。將提取的基因組dna稀釋200倍，用紫外分光光度計進行濃度純度測定。采用引物27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’(seqidno.1)和1492r：5’-ggctaccttgttacgactt-3’(seqidno.2)對16srdna基因片段進行pcr擴增(圖2)。擴增產物由生工生物工程(上海)有限公司和北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序，并將測序結果(seqidno.3)與genbank中相關序列進行比對。結果顯示，編號為lb7的乳酸桿菌的16srdna基因片段序列與lactobacillusplantarumstraincip103151的相似性達到98％。

因此，編號為lb7的乳酸桿菌鑒定為植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)，將其命名為ys4，并于2016年12月14日保藏于中國典型培養物保藏中心(簡稱cctcc，地址：湖北省武漢市武昌區八一路299號武漢大學)，保藏編號為cctccno：m2016750。

實施例2、植物乳桿菌ys4對噁唑酮誘導小鼠結腸炎的預防作用

本實施例使用的主要材料、儀器與實驗動物如下：植物乳桿菌ys4(保藏號：cctccno：m2016750)，保加利亞乳桿菌(中國工業微生物菌種保藏管理中心)；噁唑酮(美國sigma公司)；mpo、no、gsh、mda、sod測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；il-2、il-10血清細胞因子測定試劑盒(美國biolegend公司)；trizol試劑、oligodt18、rnase、dntp、mlv逆轉錄酶(美國invitrogen公司)；roxreferencedye和sybrpremixextaqii(日本takara公司)；rt-pcr引物(北京天根生化科技有限公司)。biomate3s紫外可見光分光光度儀、a200pcr儀、lux多功能性酶標儀(美國thermofisherscientific公司)；tancon2500pcr凝膠成像儀(上海天能科技有限公司)；icen-24r高速冷凍離心機(杭州奧盛儀器有限公司)。雄性7周齡spf級balb/c(體重25-30g)小鼠購自重慶醫科大學動物實驗中心(動物許可證號：scxk(渝)2012-0001)。

將50只balb/c小鼠隨機分成5組，分別是正常組、模型對照組、保加利亞乳桿菌處理組、植物乳桿菌ys4低濃度處理組和高濃度處理組，每組10只。正常組和模型對照組正常自由攝入飲食和飲水2周；在這2周中除了正常自由攝入飲食和飲水外，保加利亞乳桿菌處理組小鼠每日每只灌胃2ml的1.0×10⁹cfu/ml的保加利亞乳桿菌，植物乳桿菌ys4低濃度處理組和高濃度處理組小鼠每日每只分別灌胃2ml的1×10⁸cfu/ml的植物乳桿菌ys4和1×10⁹cfu/ml的植物乳桿菌ys4。2周后第1天所有小鼠的腹部以2×2cm面積進行剃毛，正常組小鼠腹部涂抹0.2ml乙醇；其他各組小鼠腹部涂抹0.2ml質量比為3％的噁唑酮溶液(乙醇為溶劑)。第5天對小鼠實施禁食，但允許小鼠自由攝入飲水。禁食24h后對小鼠實施麻醉(0.1ml/10g的水合氯醛)，然后進行灌腸：用硅膠管鈍頭從小鼠肛門插入腸道深3.5cm，正常組小鼠注入0.15ml體積比為50％的乙醇溶液，其他各組小鼠注入0.15ml質量比為1％的噁唑酮溶液(體積比為50％的乙醇溶液為溶劑)，20s后拔出導管，同時將小鼠倒置30s。灌腸7天后斷頸處死全部小鼠，收集小鼠血漿和結腸組織備用。

1、植物乳桿菌ys4對結腸炎癥狀的影響

灌腸后1天(第20天)、3天(第22天)、6天(第25天)分別按表2所述dai評分標準計算dai值，dai＝(體重下降分數+大便性狀分數+便血分數)/3。結腸炎會導致機體體重減輕并出現腹瀉和出血等癥狀，以體重、大便性狀和便血作為計分標準的dai可以作為衡量結腸炎程度的標準。

表2dai評分標準

各組小鼠的dai值計算結果見表3，正常組小鼠在整個實驗周期中的dai值保持為0.00±0.00，模型對照組小鼠在噁唑酮灌腸后dai值一直增加并一直在各組中保持最高，保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌ys4灌胃后的噁唑酮誘導結腸炎小鼠的dai值較模型對照組顯著下降(p<0.05)，其中植物乳桿菌ys4高濃度處理組下降最多。

表3各組小鼠的dai值

注：字母不同表示組間差異顯著(p＜0.05)。

取小鼠結腸組織，測定結腸的重量和長度，計算結腸重量/結腸長度的比值。結腸長度和結腸重量/結腸長度的比值同樣也是衡量結腸炎程度的標準。與正常小鼠相比，結腸炎小鼠的結腸長度更短、結腸重量/結腸長度的比值更低。

各組小鼠的結腸長度和結腸重量/結腸長度的比值見表4，模型對照組小鼠的結腸長度和結腸重量/結腸長度的比值均最低，正常組小鼠最高，而植物乳桿菌ys4高濃度處理組小鼠的結腸長度和結腸重量/結腸長度的比值最接近正常組。

表4各組小鼠的結腸長度和結腸重量/結腸長度的比值

注：字母不同表示組間差異顯著(p＜0.05)。

上述實驗結果說明，植物乳桿菌ys4可以降低噁唑酮誘導的小鼠結腸炎癥狀，且隨著濃度的增加效果更為明顯，其效果優于同濃度的保加利亞乳桿菌。

2、植物乳桿菌ys4對小鼠結腸組織mpo、no、gsh和mda含量的影響

在洗凈的小鼠結腸組織中加入9倍質量的生理鹽水，采用超聲粉碎將結腸組織勻漿，然后按試劑盒說明書對小鼠結腸組織中mpo、no、gsh和mda含量進行測定。mpo在結腸中的含量提高意味著中性粒細胞內流進入結腸組織，是發炎組織中中性粒細胞聚集降低的表現。在結腸炎過程中inos生成no加劇結腸組織的損傷，同時在結腸組織中隨著no的含量增加mpo活性也隨之增強，炎癥加劇。結腸炎還可以導致ros(活性氧)和rns(活性氮)大量產生，使組織細胞發生毒性反應，使結腸組織發生炎癥損傷。發生炎癥反應后ros的大量生成將破壞機體氧化/抗氧化平衡，降低結腸組織中gsh的含量，大量的脂質過氧化反應加劇脂質過氧化終產物mda的產生。

由表5可知，模型對照組小鼠結腸組織中的mpo、no、mda含量最高，gsh含量最低；正常組小鼠的結腸組織呈現出相反的趨勢，mpo、no、mda含量最低，gsh含量最高；相對于模型對照組，保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌ys4都可以降低結腸炎小鼠結腸組織中的mpo、no、mda含量和提高gsh含量，但植物乳桿菌ys4的作用更強。

表5各組小鼠結腸組織的mpo、no、gsh和mda含量

注：字母不同表示組間差異顯著(p＜0.05)。

3、植物乳桿菌ys4對小鼠血清細胞因子il-2和il-10水平的影響

取小鼠血清，采用elisa法按試劑盒說明書測定小鼠血清中il-2和il-10細胞因子的含量。噁唑酮誘導的結腸炎是一種th2細胞介導的炎癥。炎癥產生的機制是th2/th1之間的免疫網絡失衡導致結腸炎。il-10是一種th2細胞產生的細胞因子，il-2是th1細胞產生的細胞因子，都與結腸炎直接相關，過低的il-2水平和過高的il-10水平都意味著結腸炎程度加深。

由表6可知，正常組小鼠血清細胞因子il-2水平顯著高于其他組小鼠(p<0.05)，而il-10水平顯著低于其他組小鼠(p<0.05)；和其他各組相比，植物乳桿菌ys4高濃度處理組小鼠血清細胞因子il-2和il-10水平最為接近正常組。

表6各組小鼠血清細胞因子il-2和il-10水平

注：字母不同表示組間差異顯著(p＜0.05)。

4、植物乳桿菌ys4對小鼠結腸組織相關mrna表達的影響

取小鼠的結腸組織，粉碎后用rnazol提取結腸組織總rna，稀釋至1μg/μl；取2μl稀釋后的總rna提取液，依次加入1μl的oligodt18、rnase、dntp、mlv酶和10μl的5×buffer，37℃120min、99℃4min、4℃3min合成cdna；然后采用表7所述引物，rt-pcr擴增nnos、enos、inos、c-kit、scf、il-8和cxcr2的mrna表達，以持家基因gapdh作為內參照；最后用含質量比為1％的溴化乙錠的瓊脂電泳檢查pcr擴增產物，并用image1.44軟件進行半定量分析。

表7rt-pcr引物序列

(1)植物乳桿菌ys4對小鼠結腸組織nnos、enos和inosmrna表達的影響

nos分為nnos、enos和inos，研究證實enos產生的no對控制結腸組織損傷有關鍵作用，inos產生的過量no則加速結腸炎癥損傷，nnos下調也使inos表達加強同時大量釋放no。

由圖3和表8可知，正常組小鼠結腸組織的nnos、enosmrna表達最高，而inosmrna的表達最低；模型對照組小鼠的nnos、enosmrna表達最低，inosmrna的表達最高；相對于模型對照組，保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌ys4都可以顯著上調結腸炎小鼠結腸組織中nnos、enosmrna的表達和下調inosmrna的表達(p<0.05)，但植物乳桿菌ys4的作用更強。

表8小鼠結腸組織nnos、enos和inosmrna表達的半定量分析

(相對模型對照組表達倍數)

注：字母不同表示組間差異顯著(p＜0.05)。

(2)植物乳桿菌ys4對小鼠結腸組織c-kit和scfmrna表達的影響

潰瘍性結腸炎不僅表現出腹瀉和便血，同時還出現結腸動力紊亂。研究證明icc(cajal間質細胞)與結腸動力有關，直接參與結腸炎進程。出現炎癥性腸病時，scf對維持icc數量和功能有直接作用，scf是c-kit的天然配基，scf/kit信號途徑受到損傷后icc的增殖和分化均會下降，從而加重結腸炎。

由圖4和表9可知，相對于模型對照組，保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌ys4都可以顯著上調結腸炎小鼠結腸組織中c-kit和scfmrna的表達(p<0.05)，但植物乳桿菌ys4的作用更強。

表9小鼠結腸組織c-kit和scfmrna表達的半定量分析(相對模型對照組表達倍數)

注：字母不同表示組間差異顯著(p＜0.05)。

(3)植物乳桿菌ys4對小鼠結腸組織il-8和cxcr2mrna表達的影響

il-8有炎性活性和趨化作用，cxcr是il-8受體，il-8和cxcr2均與結腸癌的發病有關，文獻也報道結腸癌狀態下會出現il-8和cxcr2的高表達。

由圖5和表10可知，相對于模型對照組，保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌ys4都可以顯著下調結腸炎小鼠結腸組織中il-8和cxcr2mrna的表達(p<0.05)，但植物乳桿菌ys4的作用更強。

表10小鼠結腸組織il-8和cxcr2mrna表達的半定量分析(相對模型對照組表達倍數)

注：字母不同表示組間差異顯著(p＜0.05)。

最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明的精神和范圍。

<110>重慶第二師范學院

<120>植物乳桿菌ys4在制備預防潰瘍性結腸炎的食品或藥品中的應用

<160>19

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物27f

<400>1

agagtttgatcctggctcag20

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物1492r

<400>2

ggctaccttgttacgactt19

<210>3

<211>1469

<212>dna

<213>植物乳桿菌ys4（lactobacillusplantarumys4）

<220>

<223>16srdna基因片段

<400>3

catgatttacatttgagggagtggcgaactggtgagtaacacgtgggaaacctgcccaga60

agcggggaataacacctggaaacagatgctataccgcataacaacttggaccgcatggtc120

cgagnttgaaagatggcttcggctatcagtgcaatggcggcttttggatggtcccgcggc180

gtattagctagatggtggggtaacggctcaccatggcaatgatacgtagccgacctgaga240

gggtaatcggccacattgggactgactcacggccaaactcctacgggaggcagcagtagg300

gaatcttccacaatggacgaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaaaagggtttcg360

gctcgtaaactctgttgttaaagaagaacatatctgagagtaactgcagaaagccacggc420

taactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgg480

gcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccttcggctcaaccgaa540

gaagtgcatcggaaatgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccattgtagc600

ggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcgctgtctggtctgtaac660

tgacgctgaggctcgaaagtatggtagcaaacaggattagataccctggtatccataccg720

taaacgatgaatgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagctaacgcatt780

aagcattccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattacgggggccc840

gcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaagaaccttaccaggtctt900

gacatactatgcaaatctaagagattagacgttcccttcggggacatggatacaggtggt960

gcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttagtcccgcacgagcgcaaccc1020

ttattatcagttgccagcattaagttgggcactctggtgagactgccggtgacaaacgga1080

ggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgcta1140

caatggatggtacaacagttgcgaactcgcgagagtaagctaatctcttaaagccattct1200

cagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagtaatccggat1260

cagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgacacaccgcccgtcacaccatgagag1320

tttgtaacacccaaagtcggtggggtaaccttttaggaaccagccgcctaagggggacag1380

atgattagggtgggtcttgcctaatacatgcaagtcgaacgaactctggattgattggtg1440

cttgcatttcaggtattgacggtatttaa1469

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr擴增nnosmrna表達的上游引物

<400>4

gaataccagcctgatccatggaa23

<210>5

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr擴增nnosmrna表達的下游引物

<400>5

tcctccaggagggtgtccaccgcatg26

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr擴增enosmrna表達的上游引物

<400>6

ggagaggctgcatgacattg20

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr擴增enosmrna表達的下游引物

<400>7

ggtagagccatagtggaatgac22

<210>8

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr擴增inosmrna表達的上游引物

<400>8

agagagatcgggttcaca18

<210>9

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr擴增inosmrna表達的下游引物

<400>9

cacagaactgagggtaca18

<210>10

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr擴增c-kitmrna表達的上游引物

<400>10

agaccgaacgcaactt16

<210>11

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr擴增c-kitmrna表達的下游引物

<400>11

ggtgccatccacttca16

<210>12

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr擴增scfmrna表達的上游引物

<400>12

aaactggtggcgaatc16

<210>13

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr擴增scfmrna表達的下游引物

<400>13

cacgggtagcaagaac16

<210>14

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr擴增il-8mrna表達的上游引物

<400>14

agaagcatggcccagaaatca21

<210>15

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr擴增il-8mrna表達的下游引物

<400>15

ggccttgtagacaccttggt20

<210>16

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr擴增cxcr2mrna表達的上游引物

<400>16

gaacaaaggcaaggctaa18

<210>17

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr擴增cxcr2mrna表達的下游引物

<400>17

aacataacaacatctgggca20

<210>18

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr擴增gapdhmrna表達的上游引物

<400>18

cggagtcaacggatttggtc20

<210>19

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr擴增gapdhmrna表達的下游引物

<400>19

agccttctccatggtcgtga20