專利名稱：肌肉組織特異性表達Follistatin以提高豬瘦肉率的轉基因載體的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種肌肉組織特異性表達Follistatin以提高豬瘦肉率的轉基因載體。
背景技術：
豬肉作為中國人民的主要肉類食品，保證全國人民有充足的、優質的豬肉供應是關系到人民日常生活的重要事件。而隨著人口的增長和人民生活水平的提高，除了對豬肉的需求量增加以外，對豬肉的質量和口感的要求也提高了。因此，有必要建立和改良中國自己的豬的品種，改善豬肉口感和質量，以滿足人民群眾的生活需求。Follistatin是由肌肉細胞分泌到血液中的一種糖蛋白，它可與抑制肌肉生長的Myostatin結合,從而拈抗Myostatin的功能,進而促進肌肉的生長。已在小鼠和猴中通過實驗證明，將表達Follistatin的腺病毒群(Adeno-associated Virus)注射到肌肉中，可有效地促進肌肉的生長，不僅提高了肌肉的重量，還增強了肌肉的力量(Haidet A.M.etal." Long-term enhancement of skeletal muscle mass and strength by single geneadministration of myostatin inhibitors." Proc Natl Acad Sci U S A, 2008.105:4318-4322 ；Kota, J.et al.“Follistatin gene delivery enhances muscle growth andstrength in nonhuman primates”.Sci Transl Med, 2009.1,6ral5)?；谶@些數據，我們預期在豬的骨豁肌中過表達Follistatin可提聞豬的瘦肉率，并可改善肌肉的品質。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在于提供一種肌肉組織特異性表達Follistatin以提高豬瘦肉率的轉基因載體。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下:轉基因載體含有小鼠的肌酸激酶(muscle creatine kinase,MCK)增強子、2kb豬的α-骨骼肌肌動蛋白(a-skeletal actin)基因的啟動子、豬的Follistatin的cDNA和牛生長激素基因(bGH)的3’端不翻譯區域，且帶有哺乳動物細胞中篩選用的抗性基因一嘌呤霉素(PuiOmycin)基因和原核細胞中篩選用的抗性基因-博萊霉素(Zeocin)基因(見圖2)。2kb的α-骨骼肌肌動蛋白(a-skeletal actin)的啟動子可保證下游的基因在骨骼肌中特異表達，而且MCK增強子也具有肌肉組織特異性的增強子活性，可特異地促進下游基因的聞表達。在此轉基因載體中表達的是豬自身的Follistatin基因，所以從食品安全的角度講，對消費者的健康沒有任何影響。此外，本發明在嘌呤霉素和博萊霉素抗性基因的兩端還加入LoxP序列， 這樣，在Follistatin基因整合到基因組DNA后，如有需要，本發明可通過表達Cre蛋白，誘導LoxP序列的重組，以除去抗性基因，進一步保障轉基因動物的食品安全性。
本發明所構建的在肌肉組織特異表達豬Follistatin的轉基因載體pML34的全序列如SEQ ID No:1所示。其中，第10-1044堿基為豬Follistatin編碼區，第1064-1277堿基為bGH 3’端不翻譯區，第1453-1486堿基為LoxP，第1842-2513堿基為嘌呤霉素抗性基因，第2571-2942堿基為博萊霉素(Zeocin)抗性基因，第2952-2985堿基為LoxP，第4459-4809堿基為MCK增強子，第4905-6838堿基為豬α -骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子。本發明的轉基因載體可應用于體細胞克隆，以構建高瘦肉率的Follistatin.轉基因豬。


圖1是本發明的技術流程圖。圖2是本發明構建的PML34轉基因載體的示意圖。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發 明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例1:插入 LoxP-Puro-Zeo-LoxP 片段,構建 pZTl。將pO)NA3.I (myc-His) a 載體(Invitrogen)用 PvuII 酶切，酶切體系為 2 μ g 質粒DNA, 3 μ I 10 Xbuffer, 2 μ I PvuII 酶，加入 ddH20 補足體積至 30 μ 1，37°C溫浴 3 小時。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出3.3kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟為，將紫外光下切下目的DNA條帶裝入1.5ml離心管中，稱重后加入3倍體積的溶膠液，55°C保溫10分鐘，使瓊脂糖凝膠完全融化；融化的凝膠待溫度降至室溫后，將混合液轉入附柱中，10，OOOg離心I分鐘，倒掉流出液；加入650 μ I漂洗緩沖液，10，OOOg離心I分鐘，倒掉流出液；吸附柱再次離心，10，OOOg離心，I分鐘，倒掉流出液；將吸附柱轉移到一個新的1.5ml離心管中，加入50 μ IddH2O，放置I分鐘，10，OOOg離心I分鐘收集純化產物.
從pSNAP載體用EcoRV酶切出LoxP-Puro-Zeo-LoxP片段,酶切體系為3 μ g質粒DNA, 3 μ I 10 Xbuffer, 2 μ I EcoRV 酶，加入 ddH20 補足體積至 30 μ 1，37°C溫浴 3 小時。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出1.7kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。將pCDNA3.1 (myc-His) a(PvuII)和 LoxP-Puro-Zeo-LoxP (EcoRV)連接，連接反應中加入2μ I載體，6μ I插入片段，1μ I 10Xbuffer，I μ I T4DNA連接酶，16°C溫浴16小時。將連接產物轉化到E.coli的感受態細胞中。取一管50 μ I的Trans5 α感受態細胞置于冰上，待其融化后，向其中加入4μ I上述連接產物，輕彈混勻，后于冰上孵育30分鐘；42°C熱擊30秒，后冰上靜置10分鐘；加入500 μ I無抗性的LB液體培養基，37°C震蕩培養I小時；4，OOOrpm離心5分鐘，吸走，保留100 μ I左右的培養基，用移液器將細菌沉淀吹打均勻后涂布在含氨節和博萊雙抗性的LB培養基平板上。然后將平板置于37°C溫箱培養16小時?？寺∩L出來后，挑單克隆菌落至3ml含氨芐青霉素的LB培養液中，37°C震蕩培養12小時，提取質粒DNA，用EcoRI酶切鑒定，陽性克隆中可得到2.9kb和2.0kb的兩條DNA條帶。再通過測序進一步確定陽性克隆的正確性，得到的克隆即為PZT1。實施例2:插入豬α-骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子DNA片段，構建pZT20。將pZTl用PvuI和NdeI雙酶切，酶切體系為2yg質粒DNA，3y I 10Xbuffer,1.5μ I PvuI酶，1.5μ I NdeI酶，加入ddH20補足體積至30μ 1，37°C溫浴3小時。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出4.0kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。通過全基因合成(InvitiOgen)得到2kb長度的豬α-骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子DNA片段，用PvuI和NdeI雙酶切，酶切體系為3 μ g質粒DNA，3 μ I 10Xbuffer,1.5μ IPvuI酶，1.5μ I NdeI酶，加入ddH20補足體積至30μ 1，37°C溫浴3小時。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出2kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。將pZTl (PvuI/NdeI)和豬α -骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子DNA(PvuI/NdeI)連接，連接反應同上。將連接產物轉化到Ε.coli的感受態細胞中。具體步驟同上，除了只用博萊霉素進行抗性篩選。克隆生長出來后，挑單克隆菌落至3ml含博萊霉素的LB培養液中，37°C震蕩培養12小時，提取質粒DNA，用EcoRI酶切鑒定，陽性克隆中可得到3.8kb和2.0kb的兩條DNA條帶。再通過測序進一步確定陽性克隆的正確性，得到的克隆即為PZT20。實施例3:插入MCK增強子DNA片段，構建pML7。將pZT20用 P vuI 酶切，酶切體系為 2μ g質粒 DNA，3y I 10 X buffer,1.5μ I KpnI酶，1.5μ I NdeI酶，加入ddH20補足體積至30μ 1，37°C溫浴3小時。然后將酶切體系在1%的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出5.9kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。pZT20 載體的去磷酸化，35 μ I pZT20 (PvuI)，4 μ I 10 X buffer, I μ I 牛小腸堿性去磷酸化酶(CIP)，37°C溫浴I小時。然后將反應體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出5.9kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。通過PCR擴增得到MCK增強子DNA片段，PCR條件如下:I μ I (約IOng)模板DNAPST181，引物 I (gataCGATCGACGGGCCAGATATACGCGTTAGAA)和引物 2 (ccggCGATCGGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTAT)的終濃度均為 0.5 μ M, dNTPs 的終濃度為 0.2mM, 5 μ I 10 X buffer, I μ IHiFi Taq酶，加入ddH20補足體積至50 μ I。PCR循環為，95°C，2分鐘；接著是95°C，30秒，550C，30秒，720C，30秒，35個循環；72°C，5分鐘；4°C，保溫。然后將PCR產物在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出500bp大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。用PvuI酶切MCK增強子DNA片段，酶切體系為3yg DNA，4y I 10Xbuffer,3 μ IPvuI酶，加入ddH20補足體積至40μ 1，37°C溫浴3小時。然后將酶切體系在1%的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出500bp大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。將pZT20(PvuI/CIP)和MCK增強子DNA片段(PvuI)連接，連接反應同上。
將連接產物轉化到E.coli的感受態細胞中。具體步驟同上，除了只用博萊霉素進行抗性篩選?？寺∩L出來后，挑單克隆菌落至3ml含博萊霉素的LB培養液中，37°C震蕩培養12小時，提取質粒DNA，用PvuI酶切鑒定，陽性克隆中可得到5.9kb和0.5kb的兩條DNA條帶。再通過測序進一步確定陽性克隆的正確性，得到的克隆即為PML7。實施例4:插入豬Follistatin編碼區域DNA片段，構建pML34。將pML7用NdeI和PmeI雙酶切，酶切體系為2yg質粒DNA，3y I 10Xbuffer,1.5μ I PmeI酶，1.5μ I NdeI酶，加入ddH20補足體積至30 μ 1，37°C溫浴3小時。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出5.8kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。通過全基因合成(Invitrogen)得到豬Follistatin編碼區域DNA片段,用NdeI和PmeI 雙酶切，酶切體系為 3μ g質粒 DNA，3y I 10Xbuffer,1.5μ I PmeI 酶，L 5μ I NdeI酶，加入ddH20補足體積至30 μ 1，37°C溫浴3小時。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出1.0kb 大小的DNA條帶,用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。將pML7 (PmeI/NdeI)和豬 Follistatin 編碼區域 DNA 片段(Pmel/Ndel)連接，連接反應同上。將連接產物轉化到E.coli的感受態細胞中。具體步驟同上，除了只用博萊霉素進行抗性篩選?？寺∩L出來后，挑單克隆菌落至3ml含博萊霉素的LB培養液中，37°C震蕩培養12小時，提取質粒DNA，用EcoRI酶切鑒定，陽性克隆中可得到5.0kbU.5kb和0.2kb的三條DNA條帶。再通過測序進一步確定陽性克隆的正確性，得到的克隆即為PML34。
SEQUENCE LISTING
<110〉南京醫科大學
<120〉肌肉組織特異性表達Follistatin以提高豬痩肉率的轉基因載體
〈130〉sglll02403
<160〉I
<170>Patentln version 3.3
〈210〉I
<211〉6838
<212〉DNA
<213〉肌肉組織特異表達豬Follistatin的轉基因載休pML34的全序列 <220〉
<221>misc_feature
〈222〉(6188)..(6189)
<223>n is a，c，g，or t〈220〉
<221>misc_feature
〈222〉(6522)..(6522)
<223>n is a，c, g，or t
<220〉
權利要求
1.一種肌肉組織特異性表達Follistatin以提高豬瘦肉率的轉基因載體，其特征在于，該轉基因載體含有小鼠的肌酸激酶增強子、2kb豬的α-骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子、豬的Follistatin的cDNA和牛生長激素基因的3’端不翻譯區域，且帶有哺乳動物細胞中篩選用的抗性基因一嘌·呤霉素基因和原核細胞中篩選用的抗性基因-博萊霉素基因。
全文摘要
本發明公開了一種肌肉組織特異性表達Follistatin以提高豬瘦肉率的轉基因載體，該轉基因載體含有小鼠的肌酸激酶(muscle creatine kinase，MCK)增強子、2kb豬的α-骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子、豬的Follistatin的cDNA和牛生長激素基因的3’端不翻譯區域，且帶有哺乳動物細胞中篩選用的抗性基因-嘌呤霉素基因和原核細胞中篩選用的抗性基因-博萊霉素基因。本發明的轉基因載體可應用于體細胞克隆，以構建高瘦肉率的Follistatinmus轉基因豬。
文檔編號C12N15/85GK103074370SQ201110329069
公開日2013年5月1日 申請日期2011年10月26日 優先權日2011年10月26日
發明者戴一凡, 陳凌懿 申請人:南京醫科大學