專利名稱：一種外周血單核細胞的富集方法
技術領域：
本發明涉及一種外周血單核細胞的富集的方法。
背景技術：
大量的實驗及臨床研究表明，樹突狀細胞(DCs)治療技術是一個非常具有前景的免疫治療手段，尤其在腫瘤治療方面。然而，它的臨床實際應用由于受到了多方面因素影響而一直未能有大的突破，其中原因之一就是缺乏一種有效并易行的手段以提供在質量和數量上都能滿足治療需要的樹突狀細胞。由于外周血中樹突狀細胞數目有限，直接從外周血中富集治療所需的樹突狀細胞不太現實。現有報道中的樹突狀細胞主要來源于在細胞因子誘導下外周血單核細胞(MCs) 的體外分化。因此，外周血單核細胞的富集和純化過程是樹突狀細胞治療實施的關鍵之一 (現有技術中MCs —般需要純化到80%以上方可用于臨床，保證治療效果以及安全性)。雖然目前已有的技術手段如細胞貼壁吸附，免疫選擇技術等都能達到一定的質量和數量上的要求，但它們大都需要配置昂貴的符合GMP條件的實驗室設施和相對高的人員素質要求， 對臨床應用存在著諸多的不便。
發明內容
本發明的目的在于提供一種外周血單核細胞富集方法，該方法可操作性強，耗時短，得到的產品產量、純度較高，適用于臨床的推廣。本發明的技術方案如下
本發明的一種外周血單核細胞的富集方法，采用血細胞采集結合離心淘洗。其中血細胞采集采用的抗凝劑與全血的比率為1 :5 -1 :20。抗凝劑與全血的比率為1 :12-1 :13。血細胞采集過程所處理血量為自身血容量的2-4倍。血細胞采集過程中給予患者靜脈鈣劑的輸注。如所述的富集方法得到的外周血單核細胞在腫瘤治療中的應用。血細胞采集分離結合離心淘洗技術(Centrifugal Elutriation)的原理是基于細胞的物理性質而通過離心分離的，相比于抗原-抗體結合為原理的免疫選擇技術而言所得到的細胞產物可能更加“純樸”。我們的富集結果也表明，該方法得到的產品純度較高，此外還具有臨床適用性高、產量大的特點。相對于較為成熟和一致的由MCs到DCs的體外誘導分化方法而言，用于DCs治療為目的的MCs的富集及純化在業內尚無較為統一的方法。我們的應用結果表明，基于離心淘洗技術為基礎的MCs富集及純化方法是較為非常理想的方法，具體表現如下。1)臨床適用性自動化設備的應用省去了許多對臨床單位來說相對苛刻的要求，由于所有的采集及分離過程均在密閉體系中進行，無需附加的符合GMP條例的實驗室設施。其次，時效性極高，MNC采集結束后的一個小時左右即可得到純度高的MCs終產物。2)可靠的產品質量由于細胞淘洗技術的原理是基于細胞的物理性質而通過離心分離的，相比于抗原-抗體結合為原理的免疫選擇技術而言所得到的細胞產物可能更加“純樸”。3)充足的產量由于現代DCs治療需要足夠量的細胞以滿足多次、系列注射的需要。
具體實施例方式1對象計劃接受DCs治療的癌癥患者共17位，其中卵巢癌患者9例，乳腺癌患者和黑色素瘤患者各4例。2方法及原理首先采用血細胞分離機采集外周血單個核細胞(MNC)，然后利用自動化細胞淘洗設備將初步收集產物根據細胞大小及密度的不同分離成不同的細胞成分。 所有患者進行MNC采集前都經歷過化療或放療，MNC采集時間與最后一個化療或放療的療程間的間隔為至少2-3周。32. 1 MNC采集所有患者應用COBE SPECTRA血細胞分離機的AUTO PBSC程序 (美國CARIDIAN BCT公司)進行大處理量的MNC采集。大處理量的定義為處理血量至少為自身血容量的兩倍，使用的抗凝劑ACD-A與全血的比率為1 :12到1 :13。采集過程中，所有患者給予靜脈鈣劑的輸注以避免枸櫞酸相關的副反應的發生。2.2細胞淘洗 MNC初級產物經細胞計數后將相關數據(包括白細胞數、紅細胞數、總體積)輸入Elutra Cell Separation System細胞淘洗機(美國CARIDIAN BCT公司產品)中。根據設備提示接通一次性使用的密閉管道，設備將自動運行并生成五個不同的成分同時分裝于五個不同的密閉塑料袋中。2.3細胞計數收集患者MNC采集前、后外周血，MNC初級產物及五個不同成分的樣本分別予以細胞計數。3數據統計所有數據以mean士s表示，外周血單核細胞的回收率計算=終產品中外周血單核細胞絕對數X 100%+MNC初產品中外周血單核細胞絕對數.
1 MNC的采集大處理量MNC采集平均耗時(237. 5士 19. 4)分鐘；平均處理血量為(121 士 1384)毫升，相當于自身血容量的(3. 1 士0.4)倍；采集過程中平均血液流速為 (58. 4士 10)毫升/秒；A⑶-A平均用量為(972. 9士 123. 4)毫升。所有患者都能很好地耐受該采集過程。在MNC采集產物中，外周血單核細胞(MCs)平均含量達(32. 2士 13.0)%，絕對數達(3.2 士 1.0)X109，平均采集效率達(54. 9 士 15. 3)%。與采集前相比，采集后患者外周血白細胞計數平均降低(10. 1 士9.0 )%;血小板計數平均降低了(23. 2士 12. 7)%。2 單核細胞(MCs)的分離及富集全自動細胞淘洗過程平均用時為58士2分鐘。血小板和血漿被首先分離并主要出現在成分1中；成分2主要為殘余的紅細胞和大量的淋巴細胞；這之后是兩次的管道沖洗過程，分別收集于成分3和4，其中含有少量的淋巴細胞和外周血單核細胞；成分5則是我們的標的細胞。細胞計數結果顯示，終產品中外周血單核細胞的平均產量及純度分別達到了(2. 7士0.9) XlO9和(92. 1 士5. 5)%。以外周血單核細胞作為前體細胞在體外誘導生成樹突狀細胞并由此制成樹突狀細胞腫瘤疫苗是當今免疫生物治療的主要手段。由本方法富集的外周血單核細胞除了在數量和純度上可滿足腫瘤治療的需要外，更重要的是在其整個采集和純化過程中，所有的操作都是在密閉的無菌體系中進行的，完全符合藥品生產所要求的GMP條件，具有極大的實用價值。
權利要求
1.一種外周血單核細胞的富集方法，其特征在于所述富集方法采用血細胞采集結合離心淘洗。
2.根據權利要求1所述的外周血單核細胞的富集方法，其特征在于血細胞采集采用的抗凝劑與全血的比率為1 :5 -1 :20。
3.根據權利要求2所述的外周血單核細胞的富集方法，其特征在于抗凝劑與全血的比率為 1 :12-1 :13ο
4.根據權利要求1所述的外周血單核細胞的富集方法，其特征在于血細胞采集過程所處理血量為自身血容量的2-4倍。
5.根據權利要求1所述的外周血單核細胞的富集方法，其特征在于血細胞采集過程中給予患者靜脈鈣劑的輸注。
6.一種如權利要求1-5中任一條所述的富集方法得到的外周血單核細胞在腫瘤治療中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種外周血單核細胞富集方法。該方法采用血細胞采集結合離心淘洗，相比于抗原-抗體結合為原理的免疫選擇技術而言所得到的細胞產物可能更加“純樸”。我們的富集結果也表明，該方法得到的產品純度較高，此外還具有臨床適用性高、產量大的特點。
文檔編號C12N5/0786GK102352344SQ201110329478
公開日2012年2月15日 申請日期2011年10月26日 優先權日2011年10月26日
發明者林雋, 陳申 申請人:福建省閩東力捷迅藥業有限公司