專利名稱：一株降解酞酸酯的真菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于環境有機污染物生物處理技術領域，具體涉及一株降解酞酸酯的真菌及其在受污染土壤生物處理和環境污染修復中的應用。
背景技術：
鄰苯二甲酸酯又名酞酸酯(phthalic acid esters，PAEs)，是由一個剛性平面芳烴和兩個可塑的非線性脂肪側鏈組成，通常用酞酸酐與各種醇類之間的酯化反應獲得。PAh「泛存在于水體、土壤及空氣中。隨著塑料薄膜的廣泛農用，以及大量城鎮污水和垃圾被排放到農田，酞酸酯(phthalic acid esters, PAEs)已成為農田土壤中最常見的有機污染物之一，是“第二個全球性PCB污染物”。由于PAEs的雌激素效應，以及致畸、致癌和致突變特性，對生態環境、食品安全和人體健康構成嚴重威脅。人類通過皮膚、呼吸、食物鏈等途徑長期接觸環境雌激素PAEs，可對人體造成慢性危害，主要表現為生殖毒性。美國 EPA已經列出了 6種PAEs作為優控物。在我國環境優先污染物中有3種肽酸酯化合物鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DOP)。因此，修復 PAEs污染的水土環境已成為研究的熱點。盡管PAEs能夠通過物理作用、臭氧氧化、紫外光解等途徑降解和轉移，但是微生物降解是環境界中PAh礦化的主要途徑。生物修復被認為是目前去除環境中有機物的最經濟有效的方法。近年來，PAEs的細菌降解已得到廣泛研究，但真菌降解PAEs的報道較少。與細菌相比，絲狀真菌具有較強的穿透力，可深入接觸土壤顆粒內部污染物，因而對污染物的降解率會較高；另外，菌絲生長可將土壤穿出眾多微小孔隙，有利于營養物質流通。利用叢枝菌根真菌(AM)可以促進PAh在土壤中的降解、降低其在植物中的殘留，但是AM需與特殊寄主植物的根系結合這一特性將限制這一技術的廣泛應用，對于根系未能接觸到的土壤中的污染物來說，可能降解困難。另外，目前以單一 PAE為降解對象的報道較多，但對于實際土壤環境而言，PAE污染往往是多種單體同時存在的復合污染，生物修復過程將由于污染物之間的相互作用、以及微生物與植物共同作用等變得更為復雜。

發明內容
針對現有PAEs污染土壤、水體環境修復技術中存在的不足，本發明的首要目的在于提供一株能高效、快速降解PAEs的真菌。本發明的另一目的在于提供上述真菌在污染土壤生物處理和環境污染修復中的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一株降解酞酸酯的真菌，是棒束梗霉(Isaria sp.)F3,已于2011年8月四日保藏于中國典型培養物保藏中心(地址中國武漢市武漢大學內)，其簡稱為CCTCC，保藏編號為 CCTCC No. M 2011299。
上述的菌株F3來源于廣東省某地PAEs污染農田的耕層(0 20cm) 土，經人工富集、篩選及純化所得到，菌株命名為F3。該菌株具有以下分類學特征在察氏培養基培養7d 菌落直徑2. 5cm,絲絨狀至毛狀，米黃色，反面桔黃色；在PDA培養基培養7d菌落直徑km， 絲絨狀至毛狀，米白色，反面桔黃色；在查氏酵母膏瓊脂培養基培養7d直徑2. 5-3. Ocm,絨毛狀，白色，反面桔黃色。電子顯微鏡下觀察，該菌株菌體的形態為氣生菌絲透明，分生孢子單細胞，長橢圓形至棱形、細柱形。此外，該菌株的18S rDNA序列與Isaria(棒束梗霉屬) 的同源性達97. 1%。結合以上分類學形態特征和18S rDNA序列的比對結果，該菌株命名為棒束梗霉(Isaria sp. )F3。將棒束梗霉(Isariasp.)F3 用于降解酞酸酯(phthalic acid esters，PAEs) 棒束梗霉(Isaria sp.) F3在純培養條件下7天內對鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DOP)三種酞酸酯的混合體系的總降解率為52. 7 66. 2%，其中 DMP 降解率 61. 5 78. 4%、DEP 53. 7 68. 1 %、D0P 29. 5 53. 7%。30d 內將滅菌土壤中300mg/kgPAEs降解69. 0%，可顯著提高DMP、DEP、DOP復合污染土壤植物修復的效率。與其它菌株相比，該菌株具有高效的酞酸酯降解能力。本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果棒束梗霉(Isaria sp. ) F3對鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、 鄰苯二甲酸二正辛酯(DOP)三種酞酸酯的混合體系的總降解率為52. 7 66. 2%，其中DMP 降解率 61. 5 78. 4%、DEP 53. 7 68. 1 %、DOP 29. 5 53.7%。30d 內將滅菌土壤中 300mg/kgPAEs降解69. 0%，可顯著提高DMP、DEP、D0P復合污染土壤植物修復的效率。與其它菌株相比，該菌株具有高效的酞酸酯降解能力。


圖1是棒束梗霉(Isariasp.)F3對混合體系中酞酸酯的降解效果。圖2是棒束梗霉(Isariasp.)F3對土壤介質中酞酸酯的降解效果。圖3是棒束梗霉(Isaria sp.)F3與植物聯合作用對土壤介質中酞酸酯的降解效^ ο
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例1棒束梗霉(Isaria sp.)F3的篩選分離和鑒定及其對酞酸酯降解性能稱取受PAEs污染的新鮮水稻土 10g，裝入有90mL去離子水、3g玻璃珠的250mL三角瓶，300C、180r/min振蕩30min,靜置30min。然后取IOmL上清液，加入含有140mL PAEs 的真菌培養基(MYEA)(其配方為麥芽膏提取物0. 2%;酵母膏提取物0. 2%，余量為0. 02% 氯霉素溶液，調節PH值為7. 0即可；若配成固體培養基則加入2%瓊脂；所述百分比為質量體積比)中進行3次梯度馴化。每個梯度3種PAEs (DMP、DEP和D0P)濃度依次為200、400、 600mg/L(PAEs總濃度600、1200、1800mg/L)，每次取IOmL菌液轉入140mL新鮮培養基中， 30°C、120r/min培養7d，加入0.02%氯霉素抑制細菌生長。最后取ImL菌液平板涂布(真菌培養基)，30°C培養7d，將不同形態的菌落分別平板劃線得到單菌落，斜面保存。該菌株具有以下分類學特征在察氏培養基培養7d菌落直徑2. 5cm,絲絨狀至毛狀，米黃色，反面桔黃色；在PDA培養基培養7d菌落直徑km，絲絨狀至毛狀，米白色，反面桔黃色；在查氏酵母膏瓊脂培養基培養7d直徑2. 5-3. Ocm,絨毛狀，白色，反面桔黃色。電子顯微鏡下觀察，該菌株菌體的形態為氣生菌絲透明，分生孢子單細胞，長橢圓形至棱形、 細柱形。此外，該菌株的18S rDNA序列與Isaria (棒束梗霉屬)的同源性達97. 1%。該菌株18S rDNA的測序由上海英駿生物技術有限公司負責，其序列見序列表。結合以上分類學形態特征和18S rDNA序列的比對結果，證實該菌株為棒束梗霉 (Isaria sp.)F3。實施例2棒束梗霉(Isaria sp. )F3對酞酸酯的降解接種環挑取篩選出的真菌，分別接入5g/L葡萄糖溶液，搖床30°C、120r/min培養 36h誘導孢子萌發和菌絲生長。分光光度計測定菌液660nm處的OD值，適當稀釋使其濃度一致(OD660 0. 8)。將IOmL菌液加入90mL PAEs無機鹽培養基(3種PAEs濃度分別為0、 25、50、75、100mg/L，總濃度 0、75、150、225、300mg/L)，25°C、120r/min 培養 7d,以不接種的 PAEs無機鹽培養基為非生物降解對照。每個處理進行3個平行樣，均在無菌條件下操作。 7d后取樣分析培養液中的PAHs含量及生物量。實驗結果見圖1。在不同濃度條件下，F3對3種PAEs降解率的大小順序均是DMP > DEP > DOP ；在純培養條件下7d內對鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DOP)三種酞酸酯的混合體系的總降解率為52. 7 66. 2%，其中DMP降解率61. 5 78. 4%, DEP 53. 7 68. 1%、DOP 29. 5 53.7%。本實施例說明分離所得到的棒束梗霉(Isaria sp. )F3對三種酞酸酯混合物具有較好的降解能力。實施例3生長因子對棒束梗霉(Isaria sp.)F3降解效果的影響1、選取PAh濃度、C N和pH作為影響因子((NH4)2SO4為N源)，設計成L27 (33) 正交實驗，表頭如表1所示。2、向一系列裝有50mL不同碳氮比的PAEs無機鹽培養基的錐形瓶中接入數量相同的優勢真菌孢子(OD66tl 0. 8)，設3個重復；用未接種的PAEs無機鹽培養基為對照。振蕩培養(120rpm，25°C )7d，測定Σ PAEs的降解率和菌液pH值，結果如表2所示。上述無機鹽培養基的配制方法為(g· L—1) =KH2PO4 1.0g/L, (NH4)2SO4 1. Og/L, MgSO4 · 7H20 0. 2g/L, CaCl2 0. lg/L, FeCl3 0. Olg/L, pH 7. 0 ；蒸餾水定容至 1. 0L, pH 7. 0， 121°C蒸汽滅菌30min。表2的結果表明棒束梗霉(Isaria sp. ) F3在條件為pH值7. 0、C N為20 1 時對PAEs的降解效果較好。試驗結束時，菌液pH在5. 0-7. 0的范圍。本實施例說明，本發明的棒束梗霉(Isaria sp. )F3對PAh具有較強的耐受能力和較寬的PH適用范圍(5. 0-9. 0)。表1生長因子對棒束梗霉(Isaria sp.)F3降解效果影響正交試驗的表頭設計
權利要求
1.一株降解酞酸酯的真菌，是棒束梗霉(Isaria sp.) F3CCTCC No. M201U99，已于2011 年8月四日在位于中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心保藏。
2.權利要求1所述的真菌在降解酞酸酯中的應用。
3.根據權利要求2所述的真菌在降解酞酸酯中的應用，其特征在于所述的酞酸酯為鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二乙酯或鄰苯二甲酸二正辛酯中的一種以上。
全文摘要
本發明屬于環境有機污染物生物處理技術領域，公開了一株降解酞酸酯的真菌及其在受污染土壤生物處理和環境污染修復中的應用。一株降解酞酸酯的真菌是棒束梗霉(Isaria sp.)F3CCTCC No.M 2011299。棒束梗霉(Isaria sp.)F3在純培養條件下7天內對鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DOP)三種酞酸酯的混合體系的總降解率為52.7～66.2％，其中DMP降解率61.5～78.4％、DEP 53.7～68.1％、DOP 29.5～53.7％。30d內將滅菌土壤中300mg/kgPAEs降解69.0％，可顯著提高DMP、DEP、DOP復合污染土壤植物修復的效率。與其它菌株相比，該菌株具有高效的酞酸酯降解能力。
文檔編號C12R1/645GK102409000SQ20111033100
公開日2012年4月11日 申請日期2011年10月27日 優先權日2011年10月27日
發明者李詩殷, 杜文婷, 楊子江, 蔡信德, 郭楊, 韓蕊 申請人:環境保護部華南環境科學研究所