專利名稱：一種新的shRNA表達載體及其構建方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，具體地說，涉及一種新的shRNA表達載體，本載體可通過雙短鏈或者單長鏈退火的方法實現低成本、高效地shRNA克隆。
背景技術：
功能缺失的表現型在尋找和驗證基因和生物功能方面關系中起著重要作用。RNAi 誘發的基因沉默現象具有高效性、高特異性等特點，已廣泛應用于抗病毒、抗腫瘤、基因功能組學、細胞信號轉導通路等方法的研究。shRNA是一種非常有前景的RNA干擾技術。傳統的shRNA克隆方法，是合成兩條序列不完全相同的寡核苷酸片段，將這兩種寡核苷酸片段在退火形成雙鏈后，插入用限制性內切酶雙酶切得到的線性化載體，從而得到環形的DNA分子，隨后將環狀DNA分子轉化大腸桿菌，通過篩選得到正確的基因克隆。上述方法一般需要每條鏈合成60堿基以上，兩條鏈需合成堿基120nt以上。本專利中我們描述一種通過雙短鏈或者單長鏈構建shRNA的新方法及其載體，可快速、高效的實現shRNA的克隆表達，尤其是其具有低成本、高構建成功率、高抑制率的優勢，僅需合成50多個堿基即可實現shRNA的克隆，更適用于大規模shRNA的克隆篩選。

發明內容
本發明的目的在于對傳統的shRNA克隆方法進行改造，從而提供一種新型的 shRNA克隆載體及其構建方法。具體說，本發明涉及通過雙短鏈或者單長鏈退火構建shRNA 的新載體及其新方法。本發明的shRNA克隆方法包括制備合適的克隆載體、雙短鏈或者單長鏈自身退火形成長雙鏈DNA并與本發明的載體進行連接得到環形DNA分子，通過轉化在大腸桿菌中進行復制擴增。其特征在于本發明的新載體采用PIII型Hl啟動子并對其3’端進行了突變使其最后3_5個堿基均改變為T ；構建的shRNA采用具有回文序列的環序列，因此僅需合成兩條短鏈或者一條長鏈寡核苷酸片段，在退火后自身互補配對而形成長雙鏈DNA片段；所述載體和自身退火后的DNA雙鏈均具有堿基序列相同的粘性末端，且同為5’端或3’端的突出端。所述載體和自身退火后的DNA雙鏈長度的粘性末端突出段為1-5個堿基，所述堿基包括A和T ；所述載體和自身退火后的DNA雙鏈能夠通過相同的粘性末端進行互補配對；根據本發明，最后還包括將連接到環狀DNA分子及轉化到細菌，通過篩選得到正確的基因克隆。總體來說，本發明提供的載體和shRNA克隆方法，只需要合成雙短鏈或者單長鏈寡核苷酸片段，自身退火后與改造后的載體通過相同的粘性末端連接，可以高效、方便、低成本地實現shRNA克隆。本發明另一方面提供了一種基因治療載體，所述構建物含有本發明上述shRNA結構以及與所述shRNA結構相連的表達調控序列。本發明所述的shRNA基因治療載體適用于人類細胞或組織、各種哺乳類動物細胞或組織以及轉基因動物。


為了更好的理解本發明的實質，下面將結合圖表、附圖來說明本載體及本載體的構建方法及其適用性。圖1本發明載體pshOK-basic的示意2基于本載體的環序列以及正義反義序列方向的優化圖3基于本載體的兩種shRNA構建方法比較圖4基于本載體抗LacZ基因的shRNA對LacZ的抑制效果圖5基于本載體抗Gluc基因的shRNA對Gluc的抑制效果
具體實施例方式本發明提供了一種通過雙短鏈或者單長鏈寡核苷酸構建shRNA的新方法，可以高效、方便、低成本地實現shRNA克隆，以下通過實例對本發明做進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實例僅僅用于解釋本發明，并不用于限定本發明。實施例一 pshOK-basic克隆載體的構建采用pSuper載體為模板，PCR擴增Hl啟動子序列(HlF ATAGGATCCGAACGCTGACGTCATCAAC，HlR :GCCAGATCTCCAAAAAAACGAAGAGCAAGCTTGCTCTTCCTTT GATCTGTGGTCTCATACAGAAC)并將其3端最后三個堿基全部突變為T，同時引入兩個SapI酶切位點用于shRNA克隆，PCR產物純化后采用BamHI和BglII雙酶切插入到pCMV_emGFP 載體(實驗室構建保存)，酶切及測序選擇Hl突變啟動子正向插入的正確克隆命名為 pshOK-basic (載體圖譜如圖1所示，序列見序列表序列1)。實施例二 shRNA結構的優化(環和莖)采用已報道對HBV有抑制作用的有效序列1856(序列為 AGGACAAACGGGCAACATACC)，分別設計不同長度回文序列的環結構考察對HBsAg和HBeAg的抑制作用。2. 1將合成的單鏈oligo干粉稀釋至50 μ M，通過自身退火，形成帶有粘性末端的雙鏈DNA與本發明的載體進行連接得到環形DNA分子，通過轉化在大腸桿菌中進行復制擴增得到質粒。2. 2于37 °C、5 % CO2、含5 %胎牛血清(Hyclone)的DMEM培養液中培養H印G2 細胞。培養至對數生長期后，將H印G2細胞接種M孔板，繼續培養12-24小時，待長至 70% -90%細胞匯合后，采用GenJet轉染試劑并參照說明書操作共轉染HBV質粒和構建好的shRNA (質量比為1 1)。2. 3分別細胞轉然后48h收集細胞培養液，按照HBsAg，HBeAg ELISA檢測試劑盒 (科華生物工程股份有限公司)說明書操作步驟檢測(結果如圖2所示)。
實施例三兩種不同shRNA構建方法的比較比較單長鏈寡核苷酸自身退火和雙短鏈寡核苷酸自身退火形成長雙鏈寡核苷酸用于克隆shRNA的效率和正確率。采用已報道對HBV有抑制作用的有效序列1856(序列為 AGGACAAACGGGCAACATACC)，采用實施例三優化的回文環序列TTCTAGAA，單長鏈寡核苷酸合成后按實施例二方法自身退火形成長雙鏈寡核苷酸，雙短鏈寡核苷酸合成后首先用T4多聚核苷酸激酶和ATP將兩條短鏈的5’端磷酸化后再退火形成長雙鏈寡核苷酸，然后分別與酶切好的pshOK-basic載體連接，比較克隆數以確定連接效率，通過測序確定正確率，經驗證兩種方法的正確率平均都達到了 90%以上，但通過雙短鏈寡核苷酸退火的方法連接效率明顯較高(結果如圖3所示)。實施例四基于本載體抗LacZ基因的shRNA對LacZ的抑制效果設計并構建針對LacZ基因的shRNA，與LacZ的表達載體pAAV_LacZ以1 1的比例共轉染G2細胞，在4 采用β -半乳糖苷酶原位染色試劑盒按照說明書操作步驟進行染色，并在普通光學顯微鏡下觀察(結果如圖4所示)。實施例五基于本載體抗Gluc基因的shRNA對Gluc的抑制效果設計并構建針對Gluc基因的shRNA，與Gluc的表達載體pCMV-Gluc以1 1的比例共轉染G2細胞，4 后檢測細胞上清中Gluc的含量(結果如圖5所示)。
權利要求
1.一種用于shRNA介導基因沉默的shRNA構建載體。其特征在于采用PIII型Hl啟動子并對其3’端進行了突變使其最后3-5個堿基均改變為T ；含有兩個SapI (或BspMI，BbvII, BsmI)酶切位點進行shRNA構建。
2.—種shRNA的克隆方法，包括僅需合成兩條短鏈或者一條長鏈寡核苷酸片段，在退火后自身互補配對而形成長雙鏈DNA片段后，插入用限制性內切酶酶切得到的線性化的載體，得到環形的DNA分子。隨后將環狀DNA分子轉化細菌，通過篩選得到正確的基因克隆。
3.根據權利要求2所述的shRNA克隆方法，其特征在于兩條短鏈或者一條長鏈寡核苷酸片段，兩條同種鏈在自身退火后能夠形成長雙鏈寡核苷酸片段。
4.根據權利要求2所述的shRNA克隆方法，其特征在于，退火形成的DNA片段能夠和權利要求1中的酶切后載體通過互補的粘性末端連接。
5.根據權利要求1所述的載體和權利要求2所述的方法，其構建的shRNA采用具有回文序列的環序列。
6.一種基因治療載體，其特征在于含有權利要求1中shRNA結構相連的表達調控序列以及權利要求2中的shRNA結構。
全文摘要
本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種用于新的shRNA的克隆表達載體及其構建方法與應用。所述的載體包括自主改造后的載體和酶切后的載體片段，及優化好的環堿基序列。所述的克隆方法包括合成雙短鏈或單長鏈通過自身退火形成長雙鏈DNA，將酶切后的載體和長雙鏈DNA通過互補的粘性末端連接得到環形的DNA，并將其轉化得到正確的基因克隆等步驟。利用本發明提供的載體shRNA克隆方法，采用優化后的回文結構環序列，且只需合成雙短鏈或單長鏈，不僅提高了shRNA的療效，而且能夠快速，高效，低成本地克隆，可取代傳統的克隆方法來實現shRNA克隆。
文檔編號C12N15/10GK102533826SQ20111033103
公開日2012年7月4日 申請日期2011年10月27日 優先權日2011年10月27日
發明者張秀娟, 李丹丹, 李英, 王升啟, 王學軍, 胡偉, 謝佩雯 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所