專利名稱：單核細胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定方法及pna探針的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于鑒定單核細胞增多性李斯特菌(Zisteria的PNA 探針的設計，及應用PNA-FISH法鑒定單核細胞增多性李斯特菌的方法。
背景技術：
李斯特菌屬包括單核細胞增多性李斯特菌ilisteria monocytogenes )、伊氏李斯 #lif(.Listeria、無害李其jf特菌(厶 i/wc^wa),格氏李其Jf特菌(厶 graja·)、塞氏李斯特菌、L. seeligeri )、威氏李斯特菌(Z. welsshimeri )、以及2009年新近發現的L. marthii和Z. rocourtiae.其中單增李斯特菌和伊氏李斯特菌對動物具有致病性，且單增李斯特菌為人畜共患食源性致病菌。孕婦、小孩、老年人及免疫力低下人群易感，常表現為腦膜腦炎、腦炎、骨髓炎、心肌炎、膿血癥、流產等，發病率雖然不高，但死亡率較高，成年人的致死率為20% 60%，對嬰兒及免疫力低下的人群致死率高達54% 90%。該菌在自然界中廣泛分布，環境適應性很強，PH4. 4 9. 2、3 45°C以及高達10%NaCl的環境中均可以生長，通過多種途徑進入食品加工和生產過程污染食品，對消費者健康構成潛在威脅。肽核酸是1991年由丹麥科學家Nielsen等人設計的一種以中性酰胺鍵為骨架的全新的DNA模擬物，其骨架結構單元為(2-氨乙基)甘氨酸，堿基部分通過亞甲基羰基連接與主骨架的氨基N上，可以序列特異地與DNA、RNA結合。其骨架為電中性，與DNA-DNA或 RNA-DNA互補鏈相比，PNA-DNA和PNA-RNA互補不存在靜電排斥作用，因此具有很高的DNA 或RNA親和性，在無錯配的情況下其結合具有高穩定性，且雜交速度快，具有良好的細胞穿透性，是核酸探針的良好選擇。同時PNA探針結合原位熒光雜交技術(FISH)，與傳統生化鑒定比較，PNA-FISH法可節約大量時間，若不計增菌時間，一般耗時不超過4個小時。與PCR 等方法比較，PNA-FISH法的結果判斷基于熒光檢測和形態檢測兩部分，較PCR法等假陽性較低，且PNA-FISH法可省去核酸提取的步驟。

發明內容
本發明的第一個目的是設計了單核細胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定用PNA探針，該PNA探針具單核細胞增多性李斯特菌特異性；本發明的第二個目的是提供了一種單核細胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定方法，該方法結合FISH檢測技術，實現對單核細胞增多性李斯特菌的快速檢測。為了實現上述第一個目的，本發明采用以下技術方案
單核細胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定用PNA探針，其特征在于該PNA探針的DNA序列如SEQ ID NO 1所示。為了實現上述第二個目的，本發明采用以下技術方案
單核細胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定方法，該方法包括以下的步驟 1)離心收集對數生長期的細菌，用PBS洗滌一次，再用PBS調整菌液濃度至OD600=O. 5-2. 0 ；
2)取10μ1菌液于98%酒精清洗過的玻片上涂勻，火焰固定，將玻片于80%的酒精中浸泡15分鐘，風干；
3)25μ1含500pmole/mlPNA探針的雜交緩沖液，PNA探針的DNA序列如SEQ ID NO 1 所示，滴加于玻片上，55°C作用1-1. 5小時，雜交后玻片于55°C預熱的洗滌緩沖液中洗滌2 次，每次10分鐘；
4)取2 5μ1菌液涂片，風干后顯微鏡觀察其熒光亮度及細菌的形態。作為優選，上述的雜交緩沖液，ρΗ7. 5，該雜交緩沖液包括10% (w/v)硫酸葡聚糖， 10 mM NaCl, 30% (ν/ν)甲酰胺，0.1% (w/v)焦磷酸鈉，0. 2% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0. 2% (w/v)聚蔗糖，5 mM Na2EDTA, 0. 2% (v/v) TritonX-IOO 和 50 mM Tris/HCL·作為優選，上述的洗滌緩沖液，pHIO,該洗滌緩沖液包括5 mM Tris，15mM NaCl和 0. 1% (v/v) TritonX-100。本發明由于采用了上述技術方案，PNA具有與DNA和RNA特異性結合的高穩定性、 雜交快速性、及其良好的細胞穿透性，使本發明的檢測方法具有快速，準確、靈敏的特性。同時結合原位熒光雜交技術使檢測具有分子生物學和形態學的雙重保證，更加提高了鑒定的準確率。本發明建立了固相熒光原位雜交檢測方法，并優化了雜交條件。PNA-FISH法具有快速特點，一般整個鑒定過程耗時不超過4個小時；PNA-FISH法的結果判斷基于熒光檢測和形態檢測兩部分，較PCR法等假陽性低，且PNA-FISH法可省去繁瑣DNA提取的步驟。
具體實施例方式下面對本發明的具體實施方式
做一個詳細的說明。一、PNA探針的設計
在 NCBI 的網站上(http://www. ncbi. him. nih. gov/BLAST/)選取了 27 個分別來自 8 個種的李斯特菌的 16S rRNA的基因，用MegAlign 軟件(version 5.0; DNASTAR, Madison, WI)的ClustalV算法進行排序。在排序后的在變異區域設計了單增李斯特菌特異性探針 Lm-16S-2。探針序列見表1。二、探針敏感度和靈敏度的理論驗證
為了驗證探針的敏感度和特異性，用BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/)和 ProbeCheck (http://131. 130. 66. 200/cgi-bin/probecheck/)對探針進行了驗證。BLAST 搜索發現，所設計的探針具有較高的特異性。但也發現李斯特菌Z. marthii與Lm-16S_2 序列上存在重合，但Ζ. marthii目前只在美國紐約的一處湖泊中發現，其他地區都未有發現的報道，因此一般并不會與我們的目標細菌混淆。ProbeCheck的驗證結果顯示探針Lm-16S_2能檢測到數據庫中所有的101個目標單增李斯特菌，但和BLAST的結果一致，不能區分單增和Z. marthii.而其他檢測到的非目標細菌，與李斯特菌關系都較疏遠，也并非食品中常見的致病菌(表2)。隨后將PNA探針與大亞基(233/ 數據庫匹配檢測，發現探針Lm-16S-2不與23S rRNA存在錯配。經過BLAST和ftObeCheck驗證，所設計的探針理論上具有很高的靈敏度和特異性。表1 PNA 探針探針序列(5’ -3’)熒光標記探針位置堿基序列；GenBank號BacUinaCTGCCTCCCGTAGGA-FAM—Lm—16S—2TAGTACAAAGGGTCG-FAM1247-1261;FJ434468
a BacUin 為陽性對照探針；引用自 Perry-0，Keefe, H. , Stender, H. , Broomer, A.， Oliveira, K. , Coull, J. , Hyldig-Nielsen, J. J. , 2001. Filter-based PNA in situ hybridization for rapid detection, identification and enumeration of specific micro-organisms. J Appl Microbiol 90(2): 180-189. 探針合成和標記由韓國Panagene完成.
表2 ProbeCheck檢測PNA探針的敏感度和特異性
探針名可檢測到的目標菌數/數據庫中所有的目標菌數檢測到的非目標菌菌數13特異性°(%)敏感度d(%)Lm-16S-2aZ. monocytogenes 101/1011099. 99100
3檢測到了 ProbeCheck 16S/18S數據庫中的所有101個單增李斯特菌； bProbeCheck的16S/18S數據庫中共有菌株數460，783 ；非單增李斯特菌的菌株數 460，682 ；
c特異性=沒有檢測到的非目標菌菌株數/數據庫中所有的非目標菌菌株數； d敏感度=檢測到的目標菌菌株數/數據庫中所有的目標菌菌株數。三、固相PNA熒光原位雜交
離心(2000g，5min)收集對數生長期的細菌，用PBS洗滌一次，再用PBS調整菌液濃度至0D_=0. 5-2. 0，取ΙΟμΙ菌液于98%酒精清洗過的玻片上涂勻，火焰固定，將玻片于80% 的酒精中浸泡15分鐘，風干；25μ1含500pmole/mlPNA的雜交緩沖液(pH7. 5，10% (w/v)硫酸葡聚糖，10 mM NaCl, 30% (ν/ν)甲酰胺，0.1% (w/v)焦磷酸鈉，0. 2% (w/v)聚乙烯吡咯燒酮，0.2% (w/v)聚蔗糖，5 mM Na2EDTA, 0. 2% (v/v) TritonX-100, 50 mM Tris/HCl)滴加于玻片上，55°C作用1_1.5小時，雜交后玻片于551預熱的洗滌緩沖液(？!110，5 mM Tris, 15mM NaCl,0. 1% (v/v) TritonX-100)中洗滌2次，每次10分鐘，取2 5μ1菌液涂片，風干后顯微鏡觀察其熒光亮度及細菌的形態。試驗例1 PNA-FISH敏感度驗證
對9株不同血清型的單增李斯特菌進行敏感度驗證。試驗方法如上所述。每次試驗(包括以下實例2和3)都同步進行陽性對照和陰性對照試驗，陽性對照試驗，用探針BacUin替代其他探針，而陰性對照試驗中，用空白替代其他探針。結果顯示，所有的菌株都能和陽性對照探針BacUin和探針Lm-16S_2結合(見表 3)。上述結果和預設結果一致，探針Lm-16S-2能檢測到自己的目標菌株，有較高的敏感度。表3 PNA探針敏感度試驗
權利要求
1.單核細胞增多性李斯特菌(listeria的肽核酸原位熒光鑒定用 PNA探針，其特征在于該PNA探針的DNA序列如SEQ ID NO 1所示。
2.單核細胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定方法，其特征在于該方法包括以下的步驟1)離心收集對數生長期的細菌，用PBS洗滌一次，再用PBS調整菌液濃度至 OD600=O. 5-2. 0 ；2)取10μ1菌液于98%酒精清洗過的玻片上涂勻，火焰固定，將玻片于80%的酒精中浸泡15分鐘，風干；3)25μ1含500pmole/mlPNA探針的雜交緩沖液，PNA探針的DNA序列如SEQ ID NO 1 所示，滴加于玻片上，55°C作用1-1. 5小時，雜交后玻片于55°C預熱的洗滌緩沖液中洗滌2 次，每次10分鐘；4)取2 5μ1菌液涂片，風干后顯微鏡觀察其熒光亮度及細菌的形態。
3.根據權利要求2所述的單核細胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定方法，其特征在于雜交緩沖液，ΡΗ7. 5，該雜交緩沖液包括10%(w/v)硫酸葡聚糖，10 mM NaCl, 30% (ν/ ν)甲酰胺，0.1% (w/v)焦磷酸鈉，0.2% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0.2% (w/v)聚蔗糖，5 mM Na2EDTA,0. 2% (v/v) TritonX-100 和 50 mM Tris/HCl。
4.根據權利要求2所述的單核細胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定方法，其特征在于洗滌緩沖液，pHIO，該洗滌緩沖液包括5 mM Tris, 15mM NaCl和0. 1% (ν/ν) TritonX-100。
全文摘要
本發明涉及用于鑒定單核細胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的PNA探針的設計，及應用PNA-FISH法鑒定單核細胞增多性李斯特菌的方法。 單核細胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定用PNA探針，其特征在于該PNA探針的DNA序列如SEQ ID NO1所示。本發明并將探針N端標記熒光素，與熒光原位雜交技術結合用于檢測。同時建立了固相熒光原位雜交檢測方法，并優化了雜交條件。PNA-FISH法具有快速特點，一般整個鑒定過程耗時不超過4個小時；PNA-FISH法的結果判斷基于熒光檢測和形態檢測兩部分，較PCR法等假陽性低，且PNA-FISH法可省去繁瑣DNA提取的步驟。
文檔編號C12N15/11GK102358908SQ20111033342
公開日2012年2月22日 申請日期2011年10月28日 優先權日2011年10月28日
發明者吳姍, 帥江冰, 張曉峰, 李可, 董強 申請人:浙江省檢驗檢疫科學技術研究院