專利名稱：李斯特菌屬的肽核酸原位熒光鑒定方法和pna探針的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于鑒定李斯特菌屬(Zhteria genus) PNA探針的設計，及應用 PNA-FISH法鑒定李斯特菌的方法。
背景技術：
李斯特菌屬包括單核細胞增多性李斯特菌(Zisteria 0/70c_Fio#/7e>s，單增李斯特菌)、伊氏李斯特菌(Zisteria ira/7orii)、無害李斯特菌(Z. i/wo /a)，格氏李斯特菌 U.識’砂/)、塞氏李斯特菌(厶sedi^iriX威氏李斯特菌(Z. re/s^eri)、以及2009年新近發現的imrthii諑L. rocourtiaeo其中單增李斯特菌和伊氏李斯特菌對動物具有致病性，且單增李斯特菌為人畜共患食源性致病菌。孕婦、小孩、老年人及免疫力低下人群易感，常表現為腦膜腦炎、腦炎、骨髓炎、心肌炎、膿血癥、流產等，發病率雖然不高，但死亡率較高，成年人的致死率為20% 60%，對嬰兒及免疫力低下的人群致死率高達54% 90%。 該菌在自然界中廣泛分布，環境適應性很強，PH4. 4 9. 2、3 45°C以及高達10%NaCl的環境中均可以生長，通過多種途徑進入食品加工和生產過程污染食品，對消費者健康構成潛在威脅。肽核酸是1991年由丹麥科學家Nielsen等人設計的一種以中性酰胺鍵為骨架的全新的DNA模擬物，其骨架結構單元為(2-氨乙基)甘氨酸，堿基部分通過亞甲基羰基連接與主骨架的氨基N上，可以序列特異地與DNA、RNA結合。其骨架為電中性，與DNA-DNA或 RNA-DNA互補鏈相比，PNA-DNA和PNA-RNA互補不存在靜電排斥作用，因此具有很高的DNA 或RNA親和性，在無錯配的情況下其結合具有高穩定性，且雜交速度快，具有良好的細胞穿透性，是核酸探針的良好選擇。同時PNA探針結合原位熒光雜交技術(FISH)，與傳統生化鑒定比較，PNA-FISH法可節約大量時間，若不計增菌時間，一般耗時不超過4個小時。與PCR 等方法比較，PNA-FISH法的結果判斷基于熒光檢測和形態檢測兩部分，較PCR法等假陽性較低，且PNA-FISH法可省去核酸提取的步驟。

發明內容
本發明的第一個目的是設計了李斯特菌屬的肽核酸原位熒光鑒定用PNA探針，該 PNA探針具有李斯特菌屬特異性。本發明的第二個目的是提供了一種李斯特菌屬的肽核酸原位熒光鑒定方法，該方法結合FISH檢測技術，實現對李斯特菌屬的快速鑒定。為了實現上述第一個目的，本發明采用以下技術方案
李斯特菌屬的肽核酸原位熒光鑒定用PNA探針，該PNA探針的DNA序列如SEQ ID NO 1所示。為了實現上述第二個目的，本發明采用以下技術方案
李斯特菌屬的肽核酸原位熒光鑒定方法，該方法包括以下的步驟 1)離心收集對數生長期的細菌，用50%酒精/磷酸緩沖液固定緩沖液重懸，細菌濃度控制在OD600=O. 5-1. 0，室溫固定1小時后置于_20°C保存；2)取ΙΟΟμΙ固定好的菌體2000g離心5min，棄上清，室溫下加入50μ1含300pmole/ mlPNA探針的雜交緩沖液，PNA探針的DNA序列如SEQ ID NO 1所示，重懸；
3)樣品于薄壁PCR管中，55°C水浴1-1.5小時，加入200μ1洗滌緩沖液，洗滌緩沖液預熱至^°C，55°C水浴20min，2000g離心5min，棄洗滌緩沖液，重復洗滌一次，取25 30μ1洗滌緩沖液重懸，取2 5μ1菌液涂片，風干后熒光顯微鏡觀察熒光亮度及細菌的形態。作為優選，上述的磷酸緩沖液包括7mM Na2HPO4,7mM NaH2PO4和130mM NaCl。作為優選，上述的雜交緩沖液pH9.0，該雜交緩沖液包括20 mM TrisUOO mM NaCl 和 0. 5% SDS。作為優選，上述的洗滌緩沖液pH9. 0，該洗滌緩沖液包括10 mM Tris，1 mM EDTA0本發明由于采用了上述的技術方案，PNA探針具有與DNA和RNA特異性結合的高穩定性、雜交快速性、及其良好的細胞穿透性，使本發明的檢測方法具有快速，準確、靈敏的特性。同時結合原位熒光雜交技術使檢測具有分子生物學和形態學的雙重保證，更加提高了鑒定的準確率。本發明建立了液相模式的熒光原位雜交檢測方法，并優化了雜交條件。 PNA-FISH法具有快速特點，一般整個鑒定過程耗時不超過4個小時；PNA-FISH法的結果判斷基于熒光檢測和形態檢測兩部分，較PCR法等假陽性低，且PNA-FISH法可省去繁瑣DNA 提取的步驟。
具體實施例方式
下面對本發明的具體實施方式
做一個詳細的說明。一、PNA探針的設計
在 NCBI 的網站上(http://www. ncbi. him. nih. gov/BLAST/)選取了 27 個分別來自 8 個種的李斯特菌的 16S rRNA的基因，用MegAlign 軟件(version 5.0; DNASTAR, Madison, WI)的ClustalV算法進行排序。在排序后的保守區域設計了李斯特菌屬特異性探針 Lis-16S-l。探針 DNA 序列如 SEQ ID N0:1 所示。二、探針敏感度和靈敏度的理論驗證
為了驗證探針的敏感度和特異性，用BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/)和 ProbeCheck (http://131. 130. 66. 200/cgi-bin/probecheck/)對探針進行了驗證。BLAST 搜索發現，所設計的探針具有較高的特異性。但也有一些顯示為“非培養細菌(uncultured kicteria)”的非目標細菌與探針Lis-16S-l有重合區域。但以上非目標細菌，與李斯特菌關系都較疏遠，也并非食品中常見的致病菌。因此一般并不會與我們的目標細菌混淆。ProbeCheck的驗證結果顯示Lis-16S_l能檢測到ProbeCheck中小亞基 (16S/18S)數據庫中所有的204個李斯特菌，但同時也能檢測到30個非目標菌，其中包括 22個非培養細菌(表2)。隨后將PNA探針與大亞基(233/ 數據庫匹配檢測，發現探針 Lis-16S-l不與23S rRNA存在錯配。經過BLAST和ftObeCheck驗證，所設計的探針理論上具有很高的靈敏度和特異性。表1 PNA 探針
權利要求
1.李斯特菌屬(Zisteriagenus)的肽核酸原位熒光鑒定用PNA探針，其特征在于該 PNA探針的DNA序列如SEQ ID NO 1所示。
2.李斯特菌屬的肽核酸原位熒光鑒定方法，其特征在于該方法包括以下的步驟1)離心收集對數生長期的細菌，用50%酒精/磷酸緩沖液固定緩沖液重懸，細菌濃度控制在OD600=O. 5-1. 0，室溫固定1小時后置于_20°C保存；2)取ΙΟΟμΙ固定好的菌體2000g離心5min，棄上清，室溫下加入50μ1含300pmole/ mlPNA探針的雜交緩沖液，PNA探針的DNA序列如SEQ ID NO 1所示，重懸；3)樣品于薄壁PCR管中，55°C水浴1-1.5小時，加入200μ1洗滌緩沖液，洗滌緩沖液預熱至^°C，55°C水浴20min，2000g離心5min，棄洗滌緩沖液，重復洗滌一次，取25 30μ1洗滌緩沖液重懸，取2 5μ1菌液涂片，風干后熒光顯微鏡觀察熒光亮度及細菌的形態。
3.根據權利要求2所述的李斯特菌屬的肽核酸原位熒光鑒定方法，其特征在于磷酸緩沖液包括 7mM Na2HPO4,7mM NaH2PO4SP 130mM NaCl。
4.根據權利要求2所述的李斯特菌屬的肽核酸原位熒光鑒定方法，其特征在于雜交緩沖液PH9. 0，該雜交緩沖液包括20 mM TrisUOO mM NaCl和0. 5% SDS。
5.根據權利要求2所述的李斯特菌屬的肽核酸原位熒光鑒定方法，其特征在于洗滌緩沖液PH9. 0，該洗滌緩沖液包括10 mM Tris,l mM EDTA。
全文摘要
本發明涉及用于鑒定李斯特菌屬(Listeriagenus)PNA探針的設計，及應用PNA-FISH法鑒定李斯特菌的方法。李斯特菌屬的肽核酸原位熒光鑒定用PNA探針，該PNA探針的DNA序列如SEQ ID NO1所示。本發明并將探針N端標記熒光素，與熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization，FISH)技術結合用于檢測。建立了液相模式的熒光原位雜交檢測方法，并優化了雜交條件。PNA-FISH法具有快速特點，一般整個鑒定過程耗時不超過4個小時；PNA-FISH法的結果判斷基于熒光檢測和形態檢測兩部分，較PCR法等假陽性低，且PNA-FISH法可省去繁瑣DNA提取的步驟。
文檔編號C12N15/11GK102358909SQ20111033343
公開日2012年2月22日 申請日期2011年10月28日 優先權日2011年10月28日
發明者吳姍, 帥江冰, 張曉峰, 李可, 李愛云 申請人:浙江大學醫學院附屬婦產科醫院, 浙江省檢驗檢疫科學技術研究院