專利名稱：交替假單胞菌b3及其在生物氧化l-氨基酸中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種產L-氨基酸氧化酶的新菌株，特別涉及交替假單胞菌B3及其在生物氧化L-氨基酸中的應用。
背景技術：
L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase，簡稱 LAA0，酶學編號為EC1. 4. 3. 2)是一種以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔基的黃素蛋白酶。此酶能夠特異性催化L-氨基酸的氧化脫氨生成α-酮酸、氨和過氧化氫。因此，它能被應用于生物氧化L-氨基酸。近年來有文獻報道了 LAAO具有與血小板相互作用、細胞毒性及誘導細胞凋亡的作用。還報道它具有出血或溶血活性、引起水腫及抗菌、抗艾滋病病毒(張云等.蛇毒L-氨基酸氧化酶在制備艾滋病治療藥物中的應用.申請號03117417. 5.申請日2004-09-08.)等特性。LAAO 在抗菌、殺病原蟲、抗腫瘤及抗艾滋病病毒等領域具有極其廣闊的應用前景。LAAO被發現廣泛存在于微生物、蛇毒、魚的表皮粘液、老鼠、海兔子等多種生物體中。到目前為止，來源于不同物種的一些LAAO已經被成功分離、純化及鑒定，酶活性、底物特性、酶穩定性等理化性質被研究，一些LAAO的基因序列已被測定和公布。相關研究表明， 來源于不同物種的目前已知的LAAO在細胞內均是由兩個非共價的亞基組成的二聚體，分子量大約為120kDa，每個亞基的分子量約為60kDa，是一種需要FAD為輔基的含糖基化位點的蛋白；LAAO的抗菌等生物活性中大部分與LAAO催化產生過氧化氫具有直接或間接的聯系，過氧化氫酶能抑制LAAO的抗菌等生物活性，不過，研究表明，LAAO是被分泌到細胞外， 這就便于將LAAO分離純化。已有來源于魚的表皮粘液的LAAO被成功在大腸桿菌中克隆表達，并且，已有來源于蛇毒的LAAO被初步結晶。這些都給深入開展LMO的相關研究提供了堅實基礎和理論指導。同時，國內外的研究表明，不同物種來源的LAAO的底物特異性和最適性差異較大。有些LAAO能作用于幾種甚至幾十種氨基酸，像國外文獻報道的渾濁紅球菌 LAA0，它不僅能催化二十種L-氨基酸，而且也能催化它們的一些衍生物；但有些只能作用于一種氨基酸，像海默氏菌LAAO僅能嚴格地作用于L-賴氨酸。某些物種既含有底物特異性寬的LAA0，同時還含有底物特異性窄的LAA0。許多LAAO對疏水性和中性氨基酸的催化活性比較高，而有些LAAO對其他類型的氨基酸活性較高。L-氨基酸被LAAO催化氧化后生成對應的α-酮酸是重要的有機合成與生物合成的中間體，在食品、醫藥和化工等行業有重要應用前景。雖然，國外對LAAO已有三、四十年的研究，對來源于微生物、蛇毒、魚的表皮粘液等不同LAAO均有涉獵，但相關報道還不是特別多，研究主要集中在蛇毒來源的LAA0。 國內對LAAO的研究只有十多年的時間，僅有對來源于蛇毒的LAAO有所研究，對來源于其它物種的未見報道，而且，國內對利用微生物源LAAO進行生物氧化L-氨基酸也未見報道。

發明內容
本發明目的是提供一種產L-氨基酸氧化酶的新菌株一一交替假單胞菌Β3，以及所述菌株在氧化L-氨基酸中的應用，具有底物光譜，反應溫和，環境友好等特點。
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本發明采用的技術方案是交替假單胞菌B3 (Pseudoalteromonas sp. B3)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，菌種保藏號為=CGMCC NO. 5353，保藏日期為2011年10月17日。本發明所述交替假單胞菌B3菌種的篩選與鑒定a)菌種篩選(1)菌種來源從浙江寧波定海海域(30.03° N，122. 11° E)的海泥中分離篩選
獲得；(2)菌種篩選從寧波定海海域(30.03° Ν，122.1Γ Ε)海平面50cm以下收集海泥，置于無菌的樣品瓶中帶至實驗室，然后稱取IOg海泥樣品，加入到90mL的無菌海水中，混勻后即是濃度為KT1的樣品，然后按常規方法分別梯度稀釋成濃度為10_2、10_3、10_4、 10_5、10_6的樣品；分別取不同濃度的樣品100 μ L涂布于匪固體培養基(酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，海鹽30g/L，瓊脂20g/L;pH 7. 2，溶劑為水)平板上，于下培養4d，獲得單菌落；然后將初篩獲得的單菌落在MM固體培養基(酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，海鹽30g/L，瓊脂20g/L ；pH 7. 2，溶劑為水)平板上進行兩次劃線復篩；然后將復篩后獲得的單菌落分別接種于5mL的匪液體培養基(酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，海鹽30g/L ；pH 7. 2，溶劑為水) 中，于，200rpm轉速下搖床培養4d，8000rpm離心5min收集發酵上清液；取3mL發酵上清液作為酶液，與150mmol/L的L-苯丙氨酸(L-Phe)反應，用過氧化氫檢測試劑盒(Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay kit, Invitrogen, USA)檢測過氧化氧產生情況，發現交替假單胞菌B3能使過氧化氫檢測試劑發生顏色反應，說明交替假單胞菌B3能催化氧化L-苯丙氨酸而釋放出過氧化氫，從而說明交替假單胞菌B3能產生L-氨基酸氧化酶 (LAAO)。(3)菌株形態特征和生理生化特征所述的交替假單胞菌B3形態特征為短小桿菌，直徑Ι.Ομπι，長培養 24h后，菌落為點狀、圓形、濕潤；革蘭氏陰性，生理生化特征見表1所示表1菌株B3的生理生化特性(表中“ + ”為陽性，“-”為陰性)
權利要求
1.交替假單胞菌B3(Pseudoalteromonas sp. B3)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所， 菌種保藏號為=CGMCC NO. 5353，保藏日期為2011年10月17日。
2.如權利要求1所述的交替假單胞菌B3，其特征在于所述的交替假單胞菌B3的16S rDNA序列為AGTCGAGCGGTAACATTTCTAGCTTGCTAGAAGATGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAACAT GCCTTTAGGTGGGGGACAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGGGGGCTTCGGCT CTCGCCTTTAGATTGGCCCAAGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGG TTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGC ACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCAGG AGGAAAGGTTAGTAGTTAATACCTGCTAGCTGTGACGTTACTGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAG CCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTGATTAAGCGAG ATGTGAAAGCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGTCAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGTAGAATT TCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAACACTGACG CTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGGAG CTGGGGTCTTCGGACAACTTTTCCAAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAAC TCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTA CACTTGACATACAGAGAACTTACCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCG TCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTAGTTGCCAGCGATTCGGTC GGGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGT AGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAGAGTGCTGCGAACTAGCGATAGTAAGCGAATCACTTAAAGTATGT CGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGT GAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTGGATAGCTTAACC TTCGGGAGGGCGTCA。
3.如權利要求1所述的交替假單胞菌B3在生物氧化L-氨基酸中的應用。
4.如權利要求3所述的交替假單胞菌B3在生物氧化L-氨基酸中的應用，其特征在于所述的應用為以交替假單胞菌B3發酵培養獲得的酶為酶源，以L-氨基酸為底物，25 50°C，pH 6 8，反應0.5 池，使L-氨基酸氧化，釋放出過氧化氫。
5.如權利要求4所述的交替假單胞菌B3在生物氧化L-氨基酸中的應用，其特征在于所述酶源為交替假單胞菌B3發酵培養后獲得的含濕菌體發酵液離心棄去沉淀后獲得的上清液，所述L-氨基酸濃度為30 300mmol/L，所述上清液用量以含濕菌體發酵液中濕菌體質量計為0. 04 0. 8mg濕菌體/mmol底物。
6 如權利要求4所述的交替假單胞菌B3在生物氧化L-氨基酸中的應用，其特征在于所述的L-氨基酸為L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-酪氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-甲硫氨酸、L-胱氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸或L-半胱氨酸。
7.如權利要求4所述的交替假單胞菌B3在生物氧化L-氨基酸中的應用，其特征在于所述的酶源按如下步驟制備(1)斜面培養將交替假單胞菌B3接種于斜面培養基，20 37°C培養12 Mh，獲得斜面菌體，所述斜面培養基終濃度組成為酵母膏1. 5 6g/L，蛋白胨2. 5 10g/L，海鹽15 45g/L，瓊脂15 25g/L，pH 7 8，溶劑為水；(2)種子培養從斜面菌體挑取一接種環菌株接種至種子培養基，20 37°C培養18 Mh，獲得種子液，所述種子培養基終濃度組成為酵母膏1. 5 6g/L，蛋白胨2. 5 10g/L，海鹽15 45g/L， PH 7 8，溶劑為水；(3)發酵培養將種子液以1 10%的接種量接種至發酵培養基，20 37°C培養48 120h，獲得發酵液，將發酵液離心，棄去沉淀，收集上清液，獲得所述酶源，所述發酵培養基終濃度組成為酵母膏1. 5 6g/L，蛋白胨2. 5 10g/L，海鹽15 45g/L， PH 7 8，溶劑為水。
8.如權利要求4所述的交替假單胞菌B3在生物氧化L-氨基酸中的應用，其特征在于所述的應用為以交替假單胞菌B3發酵培養后的含濕菌體發酵液離心獲得的上清液為酶源，以L-氨基酸為底物，30°C，pH 7.0，反應0. ，使L-氨基酸氧化釋放出過氧化氫；所述交替假單胞菌B3發酵液中濕菌體濃度為10 25mg/L，所述L-氨基酸底物濃度為30 300mmol/L,所述上清液用量以含濕菌體發酵液中濕菌體質量計為0. 08 0. Smg濕菌體/ mmol底物。
全文摘要
本發明公開了一種交替假單胞菌B3(Pseudoalteromonas sp.B3)及其在生物氧化L-氨基酸中的應用，所述應用為以交替假單胞菌B3發酵培養獲得的酶為酶源，以L-氨基酸為底物，25～50℃，pH 6～8，反應0.5～2h，使L-氨基酸氧化，釋放出過氧化氫，本發明提供了一株新的產L-氨基酸氧化酶的微生物菌種，該菌種能生物氧化L-氨基酸，并具有底物廣譜、反應溫和、對環境友好等特點，在L-氨基酸的定量分析、DL-氨基酸拆分等方面具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12Q1/26GK102367430SQ201110336029
公開日2012年3月7日 申請日期2011年10月28日 優先權日2011年10月28日
發明者喬華, 余志良, 裘娟萍 申請人:浙江工業大學