專利名稱：一種微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-熊果苷的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物、醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種以黑曲霉菌株轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-熊果苷的方法。特別提供一株人工馴化的黑曲霉菌株，以及用該菌株在發(fā)酵罐中發(fā)酵轉(zhuǎn)化α-熊果苷的工藝。
背景技術(shù)：
熊果苷(arbutin)是從多種屬植物中可分離得到的天然活性物質(zhì)，天然提取物中含的是β -熊果苷。Kazuhisa等人研究發(fā)現(xiàn)α -熊果苷的美白效果是β _熊果苷的10倍以上，并且強(qiáng)于目前其他美白活成分，有效性和安全性均較熊果苷高。熊果苷已基本上實(shí)現(xiàn)了化學(xué)合成生產(chǎn)，由于α -熊果苷的化學(xué)合成具有較大難度，易形成α -熊果苷和 β -熊果苷混合物，難以分離，因此α -熊果苷更傾向用微生物或酶合成，而現(xiàn)在世界范圍內(nèi)只有日本江琦糖業(yè)公司實(shí)現(xiàn)了 α-熊果苷的酶合成。在國(guó)內(nèi)劉春巧嘗試進(jìn)行α-熊果苷生物合成研究，但效率不高，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。隨著人們對(duì)于α -熊果苷的研究的不斷深入，α _熊果苷作為安全高效美白劑必將在國(guó)際化妝品中占有極其重要的地位，有著廣闊的應(yīng)用前景。而本課題的研究正是從酶合成的角度開(kāi)展α -熊果苷的生產(chǎn)工藝研究，為我國(guó)生產(chǎn)醫(yī)藥化妝品市場(chǎng)所需的生物源的高純度α-熊果苷提供較好的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以黑曲霉菌株轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-熊果苷的方法。為了簡(jiǎn)便、 高效、規(guī)模化發(fā)酵制備α -熊果苷，本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)化微生物是一株人工馴化的黑曲霉菌株。在本發(fā)明生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α -熊果苷的方法中，黑曲霉菌株經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的馴化培養(yǎng)后，可在PDA培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、虎紅培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。在本發(fā)明生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-熊果苷的方法中，對(duì)苯二酚的投料量比例為0. 1 2% (w/v)，麥芽糖的投料量比例為2 5% (w/v)發(fā)酵溫度25 40°C，通氣比0. 1 10 (ν/ν)， 攪拌速率120 500r/min，發(fā)酵時(shí)間IOOh 200h。產(chǎn)物提取過(guò)程中添加1 5% (w/v)的 Amberlite XAD 16大孔吸附樹(shù)脂，25 40°C處理2h。在本發(fā)明黑曲霉菌株發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-熊果苷的方法中，可以通過(guò)全自動(dòng)發(fā)酵罐發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-熊果苷，經(jīng)過(guò)柱層析分離后得到α-熊果苷的單體。本發(fā)明中采用的黑曲霉菌株轉(zhuǎn)化效率更高，并易于大規(guī)模生產(chǎn)，將具有很好的工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明實(shí)施例中所用的黑曲霉菌株發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-熊果苷的方法中發(fā)酵步驟是在發(fā)酵罐中接種培養(yǎng)IOh后，調(diào)整通氣比0.1 2% (ν/ν)；之后根據(jù)對(duì)苯二酚的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，將發(fā)酵溫度調(diào)整為25 40°C，pH 4 6，攪拌速率250r/min。產(chǎn)物收集步驟為 在發(fā)酵罐中添加1 5% (w/v)的Amberlite XAD 16大孔吸附樹(shù)脂，25 40°C、250r/ min處理2h。發(fā)酵液經(jīng)過(guò)固液分離所得菌絲體和大孔吸附樹(shù)脂在乙醇中超聲提取6h。提取液減壓蒸去乙醇，經(jīng)正相與反相硅膠色譜分離、減壓濃縮、結(jié)晶、干燥后獲得純度大于98% α-熊果苷產(chǎn)品。實(shí)施例1將黑曲霉從PDA斜面轉(zhuǎn)接到PDA種子培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)12h ；然后接種到含有 200g對(duì)苯二酚(98%含量)的20LPDA培養(yǎng)基中，在30L發(fā)酵罐中28°C進(jìn)行發(fā)酵。36h后調(diào)整提高通氣比為1 3卜八)，攪拌速率調(diào)整為4001·/!^!!。48h后調(diào)整發(fā)酵溫度至42°C，5% (w/v)氨水動(dòng)態(tài)調(diào)整pH = 5.0。60h發(fā)酵結(jié)束，按5% (w/v)加入Amberlite XAD 16大孔吸附樹(shù)脂，攪拌處理2h后放罐。發(fā)酵液經(jīng)濾布過(guò)濾得濕重429g沉淀物，用30L乙醇(95% ) 超聲提取2h并濾布過(guò)濾，濾渣再用IL乙醇(95% )洗滌5次。乙醇提取液減壓濃縮干后得粗提取物1416. 6g，經(jīng)過(guò)硅膠與反相硅膠柱層析分離、減壓濃縮、結(jié)晶、干燥后獲得α -熊果苷白色粉末143. 28g，經(jīng)過(guò)HPLC檢測(cè)純度為98.01%,摩爾轉(zhuǎn)化率78. 11 %。實(shí)施例2將黑曲霉菌株從察氏培養(yǎng)基斜面轉(zhuǎn)接到察氏種子培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)12h;然后接種到含有200g對(duì)苯二酚(98%含量)的察氏培養(yǎng)基中，在30L發(fā)酵罐中28°C進(jìn)行發(fā)酵。 36h后調(diào)整提高通氣比為1 2，攪拌速率調(diào)整為350r/min。48h后調(diào)整發(fā)酵溫度至38°C， 5% (w/v)氨水動(dòng)態(tài)調(diào)整pH = 5. 0。60h發(fā)酵結(jié)束，按(w/v)加入Amberlite XAD 16 大孔吸附樹(shù)脂，攪拌處理4h后放罐。發(fā)酵液經(jīng)濾布過(guò)濾得濕重1623g沉淀物，用20L乙醇 (95%)超聲提取2h并濾布過(guò)濾，濾渣再用IL乙醇(95%)洗滌3次。乙醇提取液減壓濃縮干后得粗提取758. 4g，經(jīng)過(guò)硅膠與反相硅膠柱層析分離、減壓濃縮、真空干燥后獲得α -熊果苷白色粉末152. 39g，經(jīng)過(guò)HPLC檢測(cè)睪酮純度為98. 32%，摩爾轉(zhuǎn)化率83. 34%。
權(quán)利要求
1.一種黑曲霉生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-熊果苷的方法。
2.一種用權(quán)利要求1所述菌株發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-熊果苷的方法。 其特征在于(1)所述培養(yǎng)基為PDA或察氏液體培養(yǎng)基。(2)培養(yǎng)基中黃體酮投料量比例為0.1 2% (w/v)；發(fā)酵溫度18 50°C，0. 1 35% (w/v)氨水動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)pH= 2 8，通氣比0. 1 10卜八)，攪拌速率10 90017/!^11，發(fā)酵時(shí)間 20h 240h。(3)在產(chǎn)物提取過(guò)程中添加0.1 30% (w/v)的Amberlite XAD-16或DlOl大孔吸附樹(shù)脂，18-50°C處理Ih 10h。發(fā)酵液經(jīng)過(guò)固液分離所得菌絲體和大孔吸附樹(shù)脂在乙醇中超聲提取Ih 24h。(4)黑曲霉菌株發(fā)酵對(duì)苯二酚，得到α-熊果苷。
全文摘要
一種以黑曲霉菌株轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-熊果苷的方法。培養(yǎng)基選用PDA和察氏培養(yǎng)基。對(duì)苯二酚的投料量比例為0.1～2％(w/v)，麥芽糖的投料量比例為2～5％(w/v)；發(fā)酵溫度25～40℃，通氣比0.1～10(v/v)，攪拌速率120～500r/min，發(fā)酵時(shí)間100h～200h。產(chǎn)物提取過(guò)程中添加1～5％(w/v)的Amberlite XAD～16大孔吸附樹(shù)脂，25～40℃處理2h。本發(fā)明為規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)α-熊果苷提供一株性狀穩(wěn)定、培養(yǎng)基簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)良好的黑曲霉菌株、實(shí)用簡(jiǎn)便的發(fā)酵罐發(fā)酵及分離提取工藝。用該菌株及該工藝來(lái)規(guī)模制α-熊果苷，生產(chǎn)成本低、雜質(zhì)少，產(chǎn)物得率高。
文檔編號(hào)C12R1/685GK102329838SQ201110336430
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月31日
發(fā)明者杜剛, 楊海英 申請(qǐng)人:杜剛