專利名稱：表達乙型腦炎病毒E蛋白多表位抗原的重組痘病毒rMVA-mep及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程疫苗領(lǐng)域，涉及表達乙型腦炎病毒E蛋白多表位抗原的重組痘病毒rMVA-mep及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
日本腦炎病毒(簡稱乙腦)屬于黃病毒科黃病毒屬，是一種以蚊蟲為媒介傳播的人畜共患的病毒性疾病。對人類危害巨大，是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的蟲媒病之一，對豬可引起繁殖障礙，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。豬是JEV的中間宿主，帶毒豬是本病的主要傳染源。因此，控制豬的乙腦不僅對養(yǎng)豬業(yè)而且對人類健康都具有十分重要的意義。目前用于豬的乙腦疫苗包括弱毒苗和滅活苗，但是有關(guān)它們的安全性、生產(chǎn)和使用費用等問題越來越突出。WHO正在呼吁改善和研制新型乙腦疫苗，乙腦病毒的E蛋白與病毒和細(xì)胞受體結(jié)合、膜融合有關(guān)，也是引起中和抗體及宿主保護的主要免疫蛋白。表位(epitope)是抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團，又稱抗原決定簇(antigenic determinant)。它是 T 細(xì)胞抗原受體(T cell receptor, TCR)和 B 細(xì)胞抗原受體(B cell receptor,BCR)與抗體特異結(jié)合的基本單位。在免疫應(yīng)答中，TCR和BCR所識別的抗原表位不同，分別被稱為T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位。作為理想的免疫原，抗原分子中應(yīng)同時包含目的抗原B細(xì)胞表位和自身或外源T細(xì)胞表位，才能誘導(dǎo)出高度特異性的體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)，從體液免疫和細(xì)胞免疫水平起到預(yù)防或治療作用，賦予較廣泛的保護性。目前關(guān)于表位疫苗的設(shè)計策略取得了較大的研究進展，因此表位疫苗成為近年來病毒新型疫苗研究的熱點。E蛋白表位研究Takada K等Q002)通過JEV E蛋白在小鼠體內(nèi)特異性的⑶8+CTLs反應(yīng)，證明60Cyhasvtdi68是ε蛋白上主要的ctl表位。Lin等Q004)應(yīng)用噬菌體展示肽庫鑒定了 JEV囊膜蛋白的模擬表位，同單抗2H2結(jié)合的模擬表位擁有一個保守的基序X(I) (D/E) (Y/T/S)W2)，該基序位于E蛋白區(qū)域III的外側(cè)表面。閆麗萍等Q007)用融合蛋白進行免疫學(xué)反應(yīng)性掃描，鑒定出了 9個E蛋白線性抗原表位El (1-16)、E10-4 (77-84)、El 1-2 (83-94)、E19 (145-164)、E33 057-272)、E39-2(309-316)、E45-3(359-362)、E48-1(377-384)、E49 (385-400)。多表位疫苗(multi-印itope vaccine)也稱雞尾酒式疫苗，是同時攜帶多個與目標(biāo)抗原相關(guān)的及輔助性表位的疫苗。多表位疫苗是由基于抗原表位的氨基酸序列制備的，是近年發(fā)展起來的一種獨特的疫苗設(shè)計思路，代表了一種疫苗設(shè)計的新方向，對它的研究是基因工程疫苗研究領(lǐng)域里的熱點之一。與傳統(tǒng)疫苗相比，多表位疫苗有很多優(yōu)勢能被具有多種遺傳背景的MHC分子識別、結(jié)合，從而得到高效的遞呈；在細(xì)胞免疫方面具有獨特的優(yōu)勢，可有效應(yīng)對病原微生物的變異和免疫反應(yīng)中的諸多不利因素。
抗原表位的選擇為了使機體獲得最佳的免疫保護，需綜合考慮機體的免疫應(yīng)答特征和疾病的特殊性，有針對性的選擇目的表位。體液免疫和細(xì)胞免疫共同構(gòu)成了機體的免疫應(yīng)答系統(tǒng)。體液免疫主要是通過B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體來發(fā)揮作用的，故可以選擇特異性B細(xì)胞表位來定向誘導(dǎo)宿主的體液免疫應(yīng)答。細(xì)胞免疫應(yīng)答包括CD4+輔助性T細(xì)胞(分為Thl與Th2兩個亞群)應(yīng)答和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答，因此可根據(jù)機體對病原體的免疫應(yīng)答特點，選擇特異性的Thl表位、Th2表位或CTL表位誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答向Thl、Th2或CTL應(yīng)答類型定向發(fā)展。考慮到多表位疫苗的保護范圍，可將目標(biāo)抗原上的多個B細(xì)胞表位和外源性(或內(nèi)源性)T細(xì)胞表位同時考慮進來，以誘導(dǎo)特異的體液和細(xì)胞免疫，從體液和細(xì)胞免疫水平發(fā)揮預(yù)防控制作用，這種設(shè)計可以拓寬多表位疫苗的保護譜。若選擇的表位來自抗原分子的保守氨基酸區(qū)域，則可提供不同毒株之間的交叉免疫保護，可有效應(yīng)對宿主自身基因的高頻突變所造成的免疫逃避問題。據(jù)此構(gòu)建具有交叉保護作用的可準(zhǔn)確到達靶標(biāo)的復(fù)合型多表位疫苗，可能是預(yù)防具有多血清型及高突變率病毒(如禽流感病毒)感染的有效途徑。病毒表達系統(tǒng)歷史上，痘苗病毒(Vaccinia virus,W)曾經(jīng)為人類抗病毒斗爭做出過巨大貢獻， 曾作為預(yù)防天花的有效疫苗在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用，為人類在全世界范圍內(nèi)消滅天花做出了決定性的貢獻。痘苗病毒具有極高的免疫效率，但是它也具有明顯的副作用。由于痘苗病毒的副作用，人們在六、七十年代就開始了痘苗病毒的致弱工作。1960年至1974年間，德國教授Anton Mayr領(lǐng)導(dǎo)的研究小組通過將雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)傳代的方法，成功地將從Ankara地區(qū)分離得到的痘苗病毒CVA株致弱。傳到516 代時，這株致弱毒株被命名為MVA (Modified Vaccinia Ankara)。MVA不但繼承了 CVA良好的免疫原性，以及對天花保護性高的特點，同時在哺乳動物體內(nèi)不能有效繁殖，所以MVA還具有對人和動物毒副作用小的特點。動物實驗(雞、兔和小鼠)顯示，MVA對新生動物不產(chǎn)生任何副作用，甚至對于免疫缺陷的動物同樣沒有副作用。與親本VV相比，MVA在許可細(xì)胞系中的產(chǎn)量遠高于前者，表現(xiàn)出明顯的宿主細(xì)胞適應(yīng)傾向。研究表明，限制MVA宿主范圍(Host Range, HR)的基因突變主要分布在基因組左端，已知的有KIL基因和SPI-I基因，本發(fā)明中利用的是KlL基因。由于MVA的基因組龐大而復(fù)雜，不可能通過基因拼接直接將外源基因插入到病毒基因組中。因此，必須依靠轉(zhuǎn)移載體的協(xié)助，通過痘病毒DNA復(fù)制過程中發(fā)生的體內(nèi)同源重組將外源基因?qū)攵徊《净蚪M。Staib等近期報道了利用RK-13生長限制篩選重組MVA的新方法。早先的研究已表明，RK-13是MVA的非許可宿主細(xì)胞，但如果在MVA基因組中補償KIL基因，則可特異地恢復(fù)其在RK-13中的增殖。pGEM-KIL載體質(zhì)粒中包含了表達宿主范圍基因KIL的組件，以其作為瞬時選擇標(biāo)記，同時在KIL基因兩側(cè)又設(shè)置了重復(fù)的DNA序列，當(dāng)重組基因插入MVA 基因組后，可通過在RK-13中選擇性生長，獲得無野生型病毒混雜的重組病毒，此時再感染 BHK-21細(xì)胞，在沒有選擇壓力的條件下，KIL基因經(jīng)基因組內(nèi)部重組后很快被去除。此方法省卻了傳統(tǒng)方法需要使用抗生素和生色底物以及軟瓊脂培養(yǎng)的繁瑣環(huán)節(jié)，相對簡化了篩選過程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種表達乙型腦炎病毒E蛋白多表位抗原的重組痘病毒rMVA-m印。本發(fā)明的另一目的是提供含有該重組痘病毒rMVA-m印的藥用組合物。
本發(fā)明的又一目的是提供重組痘病毒rMVA-m印應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)一種重組轉(zhuǎn)移載體pGEM-KlL-m印，包含表達乙型腦炎病毒E蛋白多表位抗原的DNA序列SEQ ID NO. 1，以及MVA轉(zhuǎn)移載體pGEM-KIL ；所述的MVA轉(zhuǎn)移載體pGEM-KIL保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO. 5340，保藏日期為2011-10-13。一種重組痘病毒rMVA-m印，由所述的重組轉(zhuǎn)移載體pGEM-KlL_m印轉(zhuǎn)染被野生型MVA感染的原代倉鼠腎細(xì)胞BHK-21，并先后經(jīng)RK-13細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞傳代純化所得。該重組痘病毒rMVA-m印通過如下步驟得到(1)所述的重組轉(zhuǎn)移載體pGEM-KlL-m印轉(zhuǎn)染已被痘苗病毒野毒MVA感染的原代倉鼠腎細(xì)胞BHK-21，得到的培養(yǎng)液命名為BHK-21-m印；(2)將BHK-21-m印在兔腎細(xì)胞RK-13上傳代若干代，直至不再存在痘苗病毒野毒MVA，得到的培養(yǎng)液命名為RK-13-m印；(3)將RK-13-m印感染原代倉鼠腎細(xì)胞BHK-21，并傳代至重組病毒中宿主限制性基因KlL已缺失，從而得到重組痘病毒命名為rMVA-m印。所述的重組痘病毒rMVA-m印保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO. 5322，保藏日期為2011-10-13。一種藥用組合物，包含所述的重組痘病毒rMVA-m印以及藥學(xué)上可接受的載體和輔料。所述的重組轉(zhuǎn)移載體pGEM-KlL-mep在制備預(yù)防和/或治療日本腦炎病毒感染的藥物中的應(yīng)用。所述的重組痘病毒rMVA-mep在制備預(yù)防和/或治療日本腦炎病毒感染的藥物中的應(yīng)用。所述的藥用組合物在制備預(yù)防和/或治療日本腦炎病毒感染的藥物中的應(yīng)用。有益效果1、本發(fā)明應(yīng)用的痘苗病毒轉(zhuǎn)移載體是經(jīng)過改造的，有一定的宿主限制性。該痘苗病毒轉(zhuǎn)移載體中包含了表達宿主限制范圍基因的KIL組件，以其作為瞬時選擇標(biāo)記，同時在KIL基因兩側(cè)又設(shè)置了重復(fù)的DNA序列，當(dāng)重組基因插入MVA基因組后，可通過在RK-13中選擇性生長，獲得無野生型病毒混雜的重組病毒，此時再感染BHK-21細(xì)胞，在沒有選擇壓力的條件下，KIL基因經(jīng)基因組內(nèi)部重組后很快被去除。此方法省略了傳統(tǒng)方法需要使用抗生素和生色底物以及軟瓊脂培養(yǎng)的繁瑣環(huán)節(jié)，相對簡化了篩選過程，如此得到的重組痘苗病毒，是野毒核酸與外源基因的重組。2.本發(fā)明利用痘苗病毒表達系統(tǒng)構(gòu)建表達外源基因的重組痘病毒rMVA-mep 將Japanese encephalitis virus E protein多表位抗原基因克隆入痘苗病毒表達系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后進行PCR鑒定和Wfestern-blotting實驗，結(jié)果表明外源多表位抗原基因在BHK-21細(xì)胞中高效表達。3.本發(fā)明構(gòu)建的重組痘病毒疫苗與傳統(tǒng)的原核表達系統(tǒng)表達目的蛋白作為疫苗相比，有如下優(yōu)點一是重組痘苗病毒疫苗在動物體內(nèi)產(chǎn)生的蛋白抗原具有天然構(gòu)象，能最大程度的發(fā)揮抗原表位的作用；二是病毒本身及收獲病毒過程中附帶的細(xì)胞營養(yǎng)液等不會對動物產(chǎn)生不可預(yù)測的免疫干擾；三是重組痘苗病毒疫苗能夠方便快速大量獲得，能有效地節(jié)省時間和成本，可見具有明顯的優(yōu)勢。


圖1、多表位基因(m印)的SOE-PCR擴增與重組質(zhì)粒pMD18-T_m印的酶切鑒定其中 M 表示 Marker 2000，1S0E-PCR 擴增產(chǎn)物 037bp)，2重組質(zhì)粒pMD18-T-m印酶切鑒定(pMD18_T載體2680bp ；目的片段437bp)。圖2:重組病毒的純化A圖為對BHK-21-m印轉(zhuǎn)接于RK-13細(xì)胞傳代鑒定目的基因為437bp，痘苗病毒野毒特征性基因為700bp左右，宿主限制性基因KlL 為 1332bp ；1 :RK-13-m印-6，2 :RK-13-mep-4 ；3 :RK-13-mep-3 ；4:RK-13-mep-l ；M 表示 Marker 2000 ；2、3、4泳道三者中同時含有三種基因，1泳道只有目的基因，無痘苗病毒特征性基因和宿主限制性基因，證明重組痘病毒在RK-13細(xì)胞上傳代至第六代已經(jīng)得到初步純化， MVA野毒已經(jīng)不存在。B圖為對RK-13-m印-6進行PCR鑒定6 用KlL特異引物鑒定，結(jié)果含有KlL基因；7:用m印特異引物鑒定，結(jié)果含有m印基因；8 用MVA野毒特異性基因引物鑒定，結(jié)果不含有MVA野毒特異基因；M 表示 Marker 2000 ；證明重組痘病毒在RK-13細(xì)胞上傳代至第六代已經(jīng)得到初步純化，MVA野毒已經(jīng)不存在。C圖為RK-13-m印-6轉(zhuǎn)接于BHK-21細(xì)胞傳代鑒定10 :BHK-21-mep-6 ；11 :BHK-21-mep-4 ；兩者中只有目的基因；12 :BHK-21-mep-2 ；13 :BHK-21-mep-l ；兩者中既含有目的基因也含有宿主限制性基因Kll ；M 表示 Marker 2000 ；證明RK-13-m印-6在BHK-21細(xì)胞上傳代已經(jīng)丟失KlL基因，重組毒得到充分純化，純化產(chǎn)物命名為rMVA-m印。圖3 重組痘病毒表達目的基因的蛋白印記M為低分子量蛋白質(zhì)Marker1 原核表達系統(tǒng)peU8-m印表達目的蛋白rMEP作陽性對照；2 :BHK-21-mep-6 表達目的蛋白；3 :BHK-21-mep-l 表達目的蛋白；4 :BHK-21細(xì)胞(未感染任何病毒)作空白對照；1、2、3泳道三者的目的條帶大小和濃度一致，空白對照中無任何條帶，說明重組痘病毒rMVA-m印能順利表達目的蛋白并且具有一定的穩(wěn)定性。圖4:免疫程序示意圖。圖5 JEV抗體水平。圖6 JEV抗體亞型IgGl水平。圖7 JEV抗體亞型IgG2水平。圖8 細(xì)胞因子(IFN-γ禾口 IL-4)水平。圖9 淋巴細(xì)胞增殖水平。生物材料保藏信息MVA轉(zhuǎn)移載體pGEM-KIL，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為CGMCC NO. 5340，保藏日期為2011-10-13，分類命名為大腸埃希氏菌hcherichiacoli ο重組痘病毒rMVA-m印，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為CGMCC NO. 5322，保藏日期為2011-10-13，分類命名為豆苗病毒。
具體實施例方式實施例11.獲取 Japanese encephalitis virus E protein 多表位抗原基因并克隆入PMD18-T 載體本發(fā)明選擇了 E蛋白上6個能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的B細(xì)胞表位，氨基酸殘基分別位于 75-92，149-163，258-285，356-362，373-399，397-403。以及一個 CTL 表位和一個Th表位，氨基酸殘基分別位于60-68和436-445，見表1。根據(jù)大腸桿菌偏嗜性密碼子原則，設(shè)計合成10條引物，見表2。采用重疊延伸PCR(SOE)合成JEVE蛋白的多表位基因，命名為m印，將其克隆到pMD18-T載體，測序分析正確獲得陽性質(zhì)粒，命名為pMD18-T_m印，該m印基因序列為SEQ ID No. 1。重疊延伸PCR (SOE)擴增體系為 5 X SP Buffer 10 μ L，dNTP (2. 5mM) 2 μ L，引物 F1、F2、F3、F4、F5、Rl、R2、R3、R4、R5 各 1 μ L，PrimeSTAR DNA 聚合酶 0. 5 μ L，去離子水補至50 μ L0重疊延伸PCR(SOE)擴增條件95°C預(yù)變性5min，擴增條件為94°C 30s，57°C 30s，72°C 30s，35cycles，72°C延伸 IOmin0
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表1各表位的特點
權(quán)利要求
1.一種重組轉(zhuǎn)移載體pGEM-KlL-mep，其特征在于包含表達乙型腦炎病毒E蛋白多表位抗原的DNA序列SEQ ID NO. 1，以及MVA轉(zhuǎn)移載體pGEM-KIL ；所述的MVA轉(zhuǎn)移載體pGEM-KIL 保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO. 5340，保藏日期為 2011-10-13。
2.一種重組痘苗病毒rMVA-mep，其特征在于由權(quán)利要求1所述的重組轉(zhuǎn)移載體 pGEM-KlL-m印轉(zhuǎn)染被野生型MVA感染的原代倉鼠腎細(xì)胞BHK-21細(xì)胞，并先后經(jīng)RK-13細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞傳代純化所得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組痘苗病毒rMVA-m印，其特征在于該重組痘苗病毒 rMVA-mep通過如下步驟得到(1)所述的重組轉(zhuǎn)移載體pGEM-KlL-mep轉(zhuǎn)染已被痘苗病毒野毒感染的原代倉鼠腎細(xì)胞BHK-21，此培養(yǎng)液命名為BHK-21-m印；(2)將BHK-21-m印在兔腎細(xì)胞RK-13上傳代若干代，直至不再存在痘苗病毒野毒所得培養(yǎng)液命名為RK-13-m印；(3)將RK-13-m印感染原代倉鼠腎細(xì)胞BHK-21細(xì)胞，并傳代至重組病毒中宿主限制性基因Kll已缺失，從而得到重組痘苗病毒命名為rMVA-m印。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組痘苗病毒rMVA-m印，其特征在于所述的重組痘苗病毒rMVA-mep保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO. 5322，保藏日期為 2011-10-13。
5.一種藥用組合物，其特征在于包含權(quán)利要求2所述的重組痘苗病毒rMVA-mep以及藥學(xué)上可接受載體和輔料。
6.權(quán)利要求1所述的重組轉(zhuǎn)移載體pGEM-KlL-m印在制備預(yù)防和/或治療日本腦炎病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求2所述的重組痘苗病毒rMVA-mep在制備預(yù)防和/或治療日本腦炎病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求5所述的藥用組合物在制備預(yù)防和/或治療日本腦炎病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了表達乙型腦炎病毒E蛋白多表位抗原的重組痘病毒rMVA-mep及其應(yīng)用。一種重組轉(zhuǎn)移載體pGEM-K1L-mep，包含表達乙型腦炎病毒E蛋白多表位抗原的DNA序列SEQ ID NO.1，以及MVA轉(zhuǎn)移載體pGEM-K1L。一種重組痘病毒rMVA-mep，由所述的重組轉(zhuǎn)移載體pGEM-K1L-mep轉(zhuǎn)染被野生型MVA感染的原代倉鼠腎細(xì)胞BHK-21，并先后經(jīng)RK-13細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞傳代純化所得。所述的重組痘病毒rMVA-mep可在制備預(yù)防和/或治療日本腦炎病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號C12R1/93GK102392048SQ201110338030
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月1日
發(fā)明者馮秀麗, 周斌, 曹瑞兵, 王鳳娟, 茅翔, 陳溥言 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)