專利名稱：一種纖維素戊糖中溫降解產(chǎn)氫菌的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)氫菌的分離方法。
背景技術(shù)：
作物秸桿是世界上農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要副產(chǎn)品之一，也是草食動物最豐富的飼料來源之一，同時也是一種潛在的非競爭性資源，具有數(shù)量大、分布廣、種類多的特點(diǎn)。全世界每年秸桿的總產(chǎn)量為29億多噸，僅有10°/Γ20%作為草食家畜的飼料或其他用途，剩余的80°/Γ90%直接還田、腐爛或被焚燒掉，這樣不僅造成了巨大的資源浪費(fèi)，還造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。通過瘤胃微生物的發(fā)酵，反芻動物能消化植物細(xì)細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶大多結(jié)合在細(xì)胞膜上，所以細(xì)菌細(xì)胞需要吸附在纖維素材料上才能起作用，生產(chǎn)上使用很不方便，而且 酶的分離提取也較困難，經(jīng)濟(jì)效益不高。近二、三十年來，在纖維素酶的組成及作用機(jī)制、降解纖維素菌株的選育、纖維素酶合成的控制和調(diào)節(jié)以及纖維素酶的應(yīng)用等諸多方面都取得了很大的發(fā)展。但是，由于目前已有的纖維素酶的酶解效率普遍較低，遠(yuǎn)不及淀粉酶和蛋白酶，從而很大程度上影響了纖維素酶的大量生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用。因此，進(jìn)一步尋找和開發(fā)高效纖維素降解菌，并不斷改善和優(yōu)化其培養(yǎng)條件，是纖維素資源能否高效利用的關(guān)鍵。目前大多數(shù)產(chǎn)氫菌都是在高溫下分離，且分離出來的產(chǎn)氫菌不能直接利用纖維素進(jìn)行產(chǎn)氫的問題。分離出的菌種不僅可以進(jìn)行戊糖發(fā)酵且可在中溫情況下直接利用纖維素產(chǎn)氫節(jié)省能耗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決目前大多數(shù)產(chǎn)氫菌都是在高溫下分離，且分離出來的產(chǎn)氫菌不能直接利用纖維素進(jìn)行產(chǎn)氫的問題。而提供一種纖維素戊糖中溫降解產(chǎn)氫菌的分離方法。本發(fā)明的一種纖維素戊糖中溫降解產(chǎn)氫菌的分離方法，是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)一、取菌源進(jìn)行培養(yǎng)，得懸濁液；二、取步驟一得到的懸濁液以體積百分比為1%的接種量接種于以葡萄糖為碳源的液體培養(yǎng)基中，在37°c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4飛d,得菌懸液A ;三、以結(jié)晶纖維素為底物，在以纖維素為碳源的液體培養(yǎng)基初始PH為5. 5^7. 5，溫度為37°C的條件下對菌懸液A進(jìn)行厭氧富集培養(yǎng)7d ;四、然后取富集培養(yǎng)后的菌懸液B按體積百分比為10%的接種量接種于以纖維素為碳源的液體培養(yǎng)基中繼續(xù)在PH為5. 5^7. 5，溫度為37°C的條件下富集培養(yǎng)2 3d ;五、重復(fù)步驟四3飛次，得菌懸液B ;六、取步驟五得到的菌懸液B用無菌水按10' 10_2、10' IO-4和10_5的倍數(shù)進(jìn)行稀釋，將10_5倍數(shù)稀釋后的菌懸液B按10%的接種量接種于PH為5. 5^7. 5的微晶纖維素固體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至出現(xiàn)透明圈；七、在無菌環(huán)境下，用氮?dú)忉樚羧∫粋€的步驟六中透明圈直徑為6 10mm的菌落至以戊糖為碳源的液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)f 3d ;八、重復(fù)步驟六至步驟七5次，即完成纖維素戊糖中溫降解產(chǎn)氫菌的分離；其中，步驟一中所述的菌源為牛瘤胃內(nèi)含物。本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明分離纖維素戊糖中溫產(chǎn)氫菌的方法能在中溫下分離，且分離出的產(chǎn)氫菌不僅能利用纖維素發(fā)酵產(chǎn)氫還可用于戊糖發(fā)酵產(chǎn)氫。目前已知的纖維素降解菌多為高溫菌，耗能較高，不利于產(chǎn)業(yè)化，而中溫菌的成功分離為纖維素類廢棄物降解利用的產(chǎn)業(yè)化實(shí)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。木糖作為木質(zhì)纖維素原料水解產(chǎn)物中含量很豐富的一種單糖，主要是由半纖維素水解生成，含量可達(dá)植物纖維素水解糖類的35%以上，在有些原料中甚至超過了葡萄糖的含量。因此是否能夠利用木糖是利用木質(zhì)纖維素的關(guān)鍵。



圖I為篩選所得降解木質(zhì)纖維素戊糖中溫產(chǎn)氫菌的透射電鏡具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式降解木質(zhì)纖維素戍糖中溫產(chǎn)氫菌的篩選方法按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、取菌源進(jìn)行培養(yǎng)，得懸濁液；二、取步驟一得到的懸濁液以體積百分比為1% 的接種量接種于以葡萄糖為碳源的液體培養(yǎng)基中，在37°c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4飛山得菌懸液A ;三、以結(jié)晶纖維素為底物，在以纖維素為碳源的液體培養(yǎng)基初始pH為5. 5^7. 5，溫度為37°C的條件下對菌懸液A進(jìn)行厭氧富集培養(yǎng)7d;四、然后取富集培養(yǎng)后的菌懸液B按體積百分比為10%的接種量接種于以纖維素為碳源的液體培養(yǎng)基中繼續(xù)在pH為5. 5^7. 5，溫度為37°C的條件下富集培養(yǎng)2 3d ;五、重復(fù)步驟四3飛次，得菌懸液B ;六、取步驟五得到的菌懸液B用無菌水按10'10_2、10_3、10_4和10_5的倍數(shù)進(jìn)行稀釋，將10_5倍數(shù)稀釋后的菌懸液B按10%的接種量接種于pH為5. 5^7. 5的微晶纖維素固體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至出現(xiàn)透明圈；七、在無菌環(huán)境下，用氮?dú)忉樚羧∫粋€的步驟六中透明圈直徑為6 10_的菌落至以戊糖為碳源的液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)f 3d;八、重復(fù)步驟六至步驟七5次，即完成纖維素戊糖中溫降解產(chǎn)氫菌的分離；其中，步驟一中所述的菌源為牛瘤胃內(nèi)含物。本實(shí)施方式分離纖維素戊糖中溫產(chǎn)氫菌的方法能在中溫下分離，且分離出的產(chǎn)氫菌不僅能利用纖維素發(fā)酵產(chǎn)氫還可用于戊糖發(fā)酵產(chǎn)氫。目前已知的纖維素降解菌多為高溫菌，耗能較高，不利于產(chǎn)業(yè)化，而中溫菌的成功分離為纖維素類廢棄物降解利用的產(chǎn)業(yè)化實(shí)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。木糖作為木質(zhì)纖維素原料水解產(chǎn)物中含量很豐富的一種單糖，主要是由半纖維素水解生成，含量可達(dá)植物纖維素水解糖類的35%以上，在有些原料中甚至超過了葡萄糖的含量。因此是否能夠利用木糖是利用木質(zhì)纖維素的關(guān)鍵。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中所述的取菌源進(jìn)行培養(yǎng)是指將菌源放入裝有玻璃珠的滅菌血清瓶內(nèi)，在無菌狀態(tài)下加入?yún)捬鯚o菌水，再向滅菌血清瓶中通氮?dú)?min后，將滅菌血清瓶進(jìn)行密封，并放入恒溫?fù)u床中，在溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為140r/min的條件下培養(yǎng)6 8h ;其中菌源與厭氧無菌水的體積比為I :5。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一或二不同的是步驟一和步驟三中所述的以葡萄糖為碳源的液體培養(yǎng)基按重量份數(shù)是由I份氯化銨、I份氯化鈉、3份磷酸氫二鉀、I. 5份磷酸二氫鉀、O. 7份半胱氨酸、O. 2份硫酸鎂、O. 2份氯化鉀、2份酵母提取物、O. 5份維生素，O. 5份微量元素，O. 05份質(zhì)量百分含量為O. 01%的刃天青和10份的葡萄糖組成的。其它與具體實(shí)施方式
一或二相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至三之一不同的是步驟五中所述的微晶纖維素培養(yǎng)基是由微晶纖維素和瓊脂粉組成；其中，微晶纖維素濃度為5g/L，瓊脂粉濃度為20g/L。其它與具體實(shí)施方式
一至三之一相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至四之一不同的是步驟五中所述的微晶纖維素液體培養(yǎng)基按重量份數(shù)是由I份氯化銨、I份氯化鈉、3份磷酸氫二鉀、I. 5份磷酸二氫鉀、O. 7份半胱氨酸、O. 2份硫酸鎂、O. 2份氯化鉀、2份酵母提取物、O. 5份維生素，O. 5份微量元素，O. 05份質(zhì)量百分含量為O. 01%的刃天青和5份的微晶纖維素組成的。其它與具體實(shí)施方式
一至四之一相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至五之一不同的是步驟一和步 驟六中所述的以戊糖為碳源的液體培養(yǎng)基按重量份數(shù)是由I份氯化銨、I份氯化鈉、3份磷酸氫二鉀、I. 5份磷酸二氫鉀、O. 7份半胱氨酸、O. 2份硫酸鎂、O. 2份氯化鉀、2份酵母提取物、O. 5份維生素，O. 5份微量元素，O. 05份質(zhì)量百分含量為O. 01%的刃天青和5份的戊糖組成的。其它與具體實(shí)施方式
一至五之一相同。通過以下試驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明的效果本試驗(yàn)的一種纖維素戊糖中溫降解產(chǎn)氫菌的分離方法按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、將10. Og新鮮牛瘤胃內(nèi)含物放入裝有細(xì)小玻璃珠的250mL滅菌血清瓶中，在無菌狀態(tài)下，加入50mL厭氧無菌水，通純度為99. 99%的氮?dú)?min后密封滅菌血清瓶，并放入恒溫?fù)u床中，在溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為140r/min的條件下培養(yǎng)8h ;得懸濁液A ;二、取IOmL步驟一得到的得懸濁液A放入以葡萄糖為碳源的液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d，得菌懸液B ;三、以結(jié)晶纖維素為底物，在培養(yǎng)基初始pH為5. 5、6、6. 5、7和7. 5的條件下對菌懸液B進(jìn)行厭氧富集培養(yǎng)7d ;四、然后取5mL富集培養(yǎng)后的菌懸液B放入50mL以纖維素為碳源的液體培養(yǎng)基繼續(xù)富集培養(yǎng)疒3d ;五、重復(fù)步驟四4次，得菌懸液；六、取步驟五得到的菌懸液用無菌水按10'10_2、10_3、10_4和10_5倍數(shù)依次進(jìn)行稀釋，取10_5倍數(shù)稀釋后的菌懸液ImL分別放入為pH為5. 5、6、6. 5、7和7. 5的5mL的微晶纖維素固體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至出現(xiàn)透明圈；七、在無菌環(huán)境下，用氮?dú)忉樚羧∫粋€的步驟六中直徑為IOmm的透明圈至戊糖液體培養(yǎng)基中，在70°C下水浴處理5min，然后將固體盡量碾碎后在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，檢測液體培養(yǎng)基中的氣相，有氫氣產(chǎn)生的即為目的細(xì)菌；八、重復(fù)步驟六至步驟七5次，即完成纖維素戊糖中溫降解產(chǎn)氫菌的分離。本試驗(yàn)的牛瘤胃內(nèi)含物取自哈爾濱畜牧廠。本試驗(yàn)的微晶纖維素固體培養(yǎng)基是由濃度為5g/L的微晶纖維素濃度和濃度為20g/L的瓊脂粉組成。本試驗(yàn)的以葡萄糖為碳源的液體培養(yǎng)是由IOg的葡萄糖、I. Og的氯化銨、I. Og的氯化鈉、3g的磷酸氫二鉀、3g的磷酸二氫鉀、O. 7g的半胱氨酸、O. 2g的氯化鎂、O. 2g的氯化鉀、2g的酵母提取物、ImL的維生素、ImL的微量元素、3 4滴濃度為O. 01% (w/v)的刃天青組成的。本試驗(yàn)的以戊糖為碳源的液體培養(yǎng)是由5g的戊糖、I. Og的氯化銨、I. Og的氯化鈉、3g的磷酸氫二鉀、3g的磷酸二氫鉀、O. 7g的半胱氨酸、O. 2g的氯化鎂、O. 2g的氯化鉀、2g的酵母提取物、ImL的維生素、ImL的微量元素、3 4滴濃度為O. 01% (w/v)的刃天青組成的。本試驗(yàn)分離的纖維素戊糖中溫降解菌通過原子力顯微鏡照片和透射電鏡照片表述菌體形態(tài)。如圖I所示，纖維素戊糖中溫降解菌為革蘭氏陽性菌，細(xì)菌呈球星或卵圓形，在液體培養(yǎng)基中成短鏈，有時以鞭毛運(yùn)動，無明顯莢膜。本試驗(yàn)中篩選所得的纖維素戊糖中溫降解菌在厭氧條件下取2. 5mL至50mL微晶纖維素液體培養(yǎng)基中，在37°C，140r/min條件 下培養(yǎng)一周，發(fā)酵2(T30h，累積產(chǎn)氣量即達(dá)到最大值為130mL/L，且除該細(xì)菌除產(chǎn)生氫氣與二氧化碳外無任何雜質(zhì)氣體，減免雜質(zhì)氣體去除步驟，且發(fā)酵溫度為37°C減少工業(yè)能耗，進(jìn)而為生物質(zhì)制氫工業(yè)化奠定基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種纖維素戊糖中溫降解產(chǎn)氫菌的分離方法，其特征在于纖維素戊糖中溫降解產(chǎn)氫菌的分離方法是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)一、取菌源進(jìn)行培養(yǎng)，得懸濁液；二、取步驟一得到的懸濁液以體積百分比為1%的接種量接種于以葡萄糖為碳源的液體培養(yǎng)基中，在37°c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4飛d，得菌懸液A ;三、以結(jié)晶纖維素為底物，在以纖維素為碳源的液體培養(yǎng)基初始pH為5. 5^7. 5，溫度為37°C的條件下對菌懸液A進(jìn)行厭氧富集培養(yǎng)7d ;四、然后取富集培養(yǎng)后的菌懸液B按體積百分比為10%的接種量接種于以纖維素為碳源的液體培養(yǎng)基中繼續(xù)在PH為5. 5^7. 5，溫度為37°C的條件下富集培養(yǎng)2 3d ;五、重復(fù)步驟四3飛次，得菌懸液B ;六、取步驟五得到的菌懸液B用無菌水按10'10_2、10_3、10_4和10_5的倍數(shù)進(jìn)行稀釋，將.10_5倍數(shù)稀釋后的菌懸液B按10%的接種量接種于pH為5. 5^7. 5的微晶纖維素固體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至出現(xiàn)透明圈；七、在無菌環(huán)境下，用氮?dú)忉樚羧∫粋€的步驟六中透明圈直徑為6 10mm的菌落至以戊糖為碳源的液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)f3d ；八、重復(fù)步驟六至步驟七5次，即完成纖維素戊糖中溫降解產(chǎn)氫菌的分離；其中，步驟一中所述的菌源為牛瘤胃內(nèi)含物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種纖維素戊糖中溫降解產(chǎn)氫菌的分離方法，其特征在于步驟一中所述的取菌源進(jìn)行培養(yǎng)是指將菌源放入裝有玻璃珠的滅菌血清瓶內(nèi)，在無菌狀態(tài)下加入?yún)捬鯚o菌水，再向滅菌血清瓶中通氮?dú)?min后，將滅菌血清瓶進(jìn)行密封，并放入恒溫?fù)u床中，在溫度為37°C,轉(zhuǎn)速為140r/min的條件下培養(yǎng)6 8h ;其中菌源與厭氧無菌水的體積比為I :5。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種纖維素戊糖中溫降解產(chǎn)氫菌的分離方法，其特征在于步驟一和步驟三中所述的以葡萄糖為碳源的液體培養(yǎng)基按重量份數(shù)是由I份氯化銨、I份氯化鈉、3份磷酸氫二鉀、I. 5份磷酸二氫鉀、O. 7份半胱氨酸、O. 2份硫酸鎂、O. 2份氯化鉀、2份酵母提取物、O. 5份維生素，O. 5份微量元素，O. 05份質(zhì)量百分含量為O. 01%的刃天青和.10份的葡萄糖組成的。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種纖維素戊糖中溫降解產(chǎn)氫菌的分離方法，其特征在于步驟五中所述的微晶纖維素固體培養(yǎng)基是由微晶纖維素和瓊脂粉組成；其中，微晶纖維素濃度為5g/L，瓊脂粉濃度為20g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種纖維素戊糖中溫降解產(chǎn)氫菌的分離方法，其特征在于步驟五中所述的微晶纖維素液體培養(yǎng)基按重量份數(shù)是由I份氯化銨、I份氯化鈉、3份磷酸氫二鉀、I. 5份磷酸二氫鉀、O. 7份半胱氨酸、O. 2份硫酸鎂、O. 2份氯化鉀、2份酵母提取物、O. 5份維生素，O. 5份微量元素，O. 05份質(zhì)量百分含量為O. 01%的刃天青和5份的微晶纖維素組成的。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種纖維素戊糖中溫降解產(chǎn)氫菌的分離方法，其特征在于步驟一和步驟六中所述的以戊糖為碳源的液體培養(yǎng)基按重量份數(shù)是由I份氯化銨、I份氯化鈉、3份磷酸氫二鉀、I. 5份磷酸二氫鉀、O. 7份半胱氨酸、O. 2份硫酸鎂、O. 2份氯化鉀、2份酵母提取物、O. 5份維生素，O. 5份微量元素，O. 05份質(zhì)量百分含量為O. 01%的刃天青和5份的戊糖組成的。
全文摘要
一種纖維素戊糖中溫降解產(chǎn)氫菌的分離方法，它涉及一種中溫產(chǎn)氫菌的分離方法。它解決了目前大多數(shù)產(chǎn)氫菌都是在高溫下分離，且分離出來的產(chǎn)氫菌不能直接利用纖維素進(jìn)行產(chǎn)氫的問題。其特征在于它是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)1.菌懸液的制備；2菌懸液A的富集；3按不同pH值對菌懸液A進(jìn)行選擇性富集；4對不用pH下的富集液倍比稀釋以微晶纖維素為底物進(jìn)行滾管5挑取滾管中的透明圈至戊糖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)6檢測液體培養(yǎng)基中的氣相，有氫氣產(chǎn)生的即為目的細(xì)菌7重復(fù)步驟4到步驟6五次，即可分離。本發(fā)明分離纖維素戊糖中溫產(chǎn)氫菌的方法能在中溫下分離，且分離出的產(chǎn)氫菌不僅能利用纖維素發(fā)酵產(chǎn)氫還可用于戊糖發(fā)酵產(chǎn)氫。
文檔編號C12N1/20GK102757927SQ20121027910
公開日2012年10月31日 申請日期2012年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月7日
發(fā)明者任南琪, 張璐, 邢德峰 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)