解淀粉乳桿菌l6及其在發酵黃漿水中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了解淀粉乳桿菌L6及其在發酵黃漿水中的應用。該解淀粉乳桿菌L6的保藏號為CGMCC?NO.9090；其16S?rDNA序列如SEQ.ID.NO1。該解淀粉乳桿菌L6在發酵豆腐黃漿水中的應用時，先將黃漿水在115-121℃滅菌；按黃漿水體積計，接入3％-6％的解淀粉乳桿菌L6的種子液；在35-47℃保溫酸化24-48h，黃漿水的酸度值可達到60°T-110°T，獲得了一種新型的豆腐點漿劑。本發明解決了自然發酵酸漿水中微生物生長雜亂的問題，提高了酸漿豆腐的質量安全性。該菌株直接利用黃漿水中的低聚糖和淀粉等生長產酸，無需補充其它碳源和營養素即可達到點漿劑所需酸度，降低了生產成本。
【專利說明】解淀粉乳桿菌L6及其在發酵黃漿水中的應用
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及乳酸菌和豆制品加工領域，具體涉及一株解淀粉乳酸菌(Lactobacillus amylolyticus)L6及其在制備豆腐凝固劑中的應用。
【背景技術】
[0002]黃漿水為豆腐制作過程中產生的黃色浙水，含有大量水溶性的糖類如水蘇糖、棉籽糖等低聚糖，以及異黃酮、蛋白質和維生素等營養物質，非常適合微生物的生長。直接排放不僅會造成資源的浪費，而且會嚴重污染環境與土壤，因此實現對黃漿水的綜合利用引起了國內外科學工作者的關注。
[0003]我國傳統豆腐生產過程中，石膏和鹽鹵作為凝固劑長期使用。使用鹽鹵點漿的豆腐風味極佳，但持水性差，不易放置時間過長；使用石膏作為點漿劑的豆腐持水性好，但成品略帶有苦澀味，缺乏大豆香氣。近年來研究發現，豆制品加工過程中產生的黃漿水，在存貯的過程中經自然發酵所生成的酸漿水，是一種良好的豆腐凝固劑，已在部分豆制品生產廠家使用，以酸漿水制成的豆腐色澤微黃、口感鮮嫩，無化學點漿劑的苦澀味，屬純天然食品。但目前使用的酸漿水均為自然發酵，所涉及到的微生物除產酸的乳酸菌外，還含有部分其它的細菌和酵母等，其中也有可能污染蠟樣芽孢桿菌、葡萄球菌等雜菌，對豆腐及其制品的食用安全性構成危害。
[0004]當使用商用乳酸菌如嗜酸乳桿菌對黃漿水進行純種發酵制備點漿劑時，雖然可以獲得安全性高的酸漿水，但需要補充營養素如蔗糖才能達到合適的酸度，增加了生產成本，因此尋找適宜發酵黃漿水的乳酸菌具有重要實際意義。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于針對現有技術中存在的問題，提供一株乳酸菌即解淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylolyticus)L6。
[0006]本發明的另一目的在于提供上述乳酸菌Lactobacillus amylolyticus L6在發酵豆腐黃漿水中的一種應用。
[0007]本發明通過以下技術方案予以實現:
[0008]一株解淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylolyticus)L6,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地點為北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，郵政編碼為100101 ;保藏號為CGMCC N0.9090，保藏日期為2014年4月25曰。
[0009]本發明中解淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylolyticus)L6是通過稀釋平板法篩選獲得。使用無菌采樣瓶現場采樣自然發酵而成的酸漿水，低溫帶回；立即使用無菌水分別稀釋至ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—5倍，涂布于改良的MRS固體培養基上；然后放入37°C的恒溫培養箱中，培養48h ;挑取疑似菌落，進行平板劃線分離，如此重復4~5次，直至獲得純的單菌落。將純化的單菌落穿刺接種到MRS固體培養基內，于4°C冰箱保存。其中改良MRS液體培養基(g/U配方為:牛肉膏1g,蛋白胨1g,酵母浸粉5g,葡萄糖20g,吐溫-801mL,K2HPO4.3H202g，NaAc.3H205g，檸檬酸三銨 2g，MgSO4.7H200.58g，MnSO4.H2O0.25g，加入蒸餾水到1L，調pH到6.4 ± 0.2 (MRS固體培養基在液體培養基的基礎上添加2 %或0.7 %的瓊脂),121°C 滅菌 15min。
[0010]本發明中乳桿菌L6的生物活性特征如下:在MRS固體培養基平板上菌落突起，呈圓形，直徑一般為l_3mm，灰白色，不透明，濕潤光滑(見圖1a);菌體為革蘭氏染色陽性無芽孢桿菌，呈細短桿狀，成對或堆狀排列(見圖1b);葡萄糖同型發酵，生長溫域寬(30-47°C可正常生長，見圖2)，生長速度快；常規生理生化實驗結果(見表1)表明菌株L6為革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性、可利用淀粉、同型發酵的無芽孢桿菌(表1)。將所測16S rDNA序列(如SEQ.1D.N01)通過BLAST比對,鑒定其為解淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylolyticus)(見圖3)。
[0011]本發明提供解淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylolyticus)L6在發酵豆腐黃衆水中的應用。
[0012]該應用方法包括如下步驟:
[0013](I)將黃漿水在115_121°C滅菌；
[0014](2)按黃漿水體積計，接入3% -6%的解淀粉乳桿菌L6的種子液；
[0015](3)在35-47°C保溫酸化24_48h，將黃漿水的酸度值達到60° T以上。
[0016]優選地，所述滅菌的時間為15-30分鐘。
[0017]相對于現有技術，本發明具有的優點和有益效果:
[0018](I)將Lactobacillus amylolyticus L6種子液接入到滅菌的黃衆水中,進行純種發酵，獲得了一種新型的豆腐點漿劑，解決了自然發酵酸漿水中微生物生長雜亂的問題，提高了酸漿豆腐的質量安全性。
[0019](2)該菌株可以直接利用黃漿水中的低聚糖和淀粉等生長產酸，無需補充其它碳源和營養素即可達到點漿劑所需酸度，降低了生產成本。
[0020](3)該菌株產酸速度快，培養條件簡單，易于工業化生產，具有良好的開發應用前旦
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【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1a為本發明Lactobacillus amylolyticus L6菌株的菌落形態圖；
[0022]圖1b為本發明Lactobacillus amylolyticus L6菌株的菌體形態圖；
[0023]圖2為本發明Lactobacillus amylolyticus L6菌株對溫度的適應性曲線示意圖；
[0024]圖3為本發明Lactobacillus amylolyticus L6菌株根據16S rDNA序列所做的系統進化樹。
【具體實施方式】
[0025]為更好地理解本發明，下面結合附圖和實施例對本發明作進一步的說明，但實施例不構成對本發明要求保護范圍的限定。
[0026]實施例中需要說明的是:
[0027](I)革蘭氏染色、形狀觀察及常用生理生化鑒定培養基參考凌代文主編的《乳酸細菌分類鑒定及試驗方法》(1999年版)。
[0028](2)對溫度的適應性檢測按照以下方法:
[0029]取10mL三角瓶，加入50mL改良MRS液體培養基，121°C滅菌15min，冷卻后接種Lactobacillus amylolyticus L6菌株,37°C培養過夜,作為種子培養液備用。在滅菌的改良MRS液體培養基三角瓶中加入ImL種子培養物(發酵接種量為2% (V/V))，分別在22 V ,27 V, 32 V，37 °C，42 V，47 °C，52 V等溫度下恒溫培養，設置3組平行發酵，18h后，用紫外-可見分光光度計在600nm處測其OD值。
[0030](3)改良MRS液體培養基(用于乳酸菌的培養):
[0031]牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母浸粉5g，葡萄糖20g，吐溫_801mL，K2HPO4.3H202g，NaAc.3H20 5g，檸檬酸三銨 2g，MgSO4.7H20 0.58g，MnSO4.H2O 0.25g ;蒸餾水 1L，pH6.4±0.2 (MRS固體培養基在液體培養基的基礎上添加0.7_2 %的瓊脂)，121 °C滅菌15min。
[0032](4)對照用嗜酸乳桿菌為Lactobacillus acidophilus20272,購于中國工業微生物菌種保藏管理中心。
[0033](5)酸度測定參照GB541334-2010的方法進行測定。具體操作為:將樣品攪拌均勻，精確稱取1g樣品，加入20mL無CO2的蒸餾水，混勻，加入0.5mL酚酞指示劑，用0.1NNaOH標準溶液滴定至溶液呈微紅色，且在30s內不變色為終點，酸度的計算按照下面的公式:
[0034]X = (CXVX100)/(mX0.1)
[0035]X——樣品的酸度，單位。T ;
[0036]C——氫氧化鈉標準溶液的摩爾濃度，單位mol/L ；
[0037]V——消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，單位mL ；
[0038]m——樣品的質量，單位g。
[0039]實施例1菌株篩選
[0040](I)使用無菌采樣瓶，現場采樣自然發酵而成的酸漿水，低溫帶回。立即使用無菌水分別稀釋至10' 10_4、1-5倍，涂布于改良的MRS固體培養基上。然后放入37°C的恒溫培養箱中，培養48h。挑取疑似菌落，進行平板劃線分離，如此重復4~5次，直至獲得純的單菌落。將純化的單菌落用接種針插入含有MRS固體培養基的試管中心，于4°C冰箱內保存。
[0041](2)從自然發酵的酸漿水中分離出菌株L6，其在MRS培養基上的菌落呈圓形、直徑一般為l_3mm，灰白色、不透明狀，濕潤光滑(圖1a);進行革蘭氏染色和細胞形狀觀察，菌株L6的菌體呈短桿狀,成對或堆生(圖1b)。常規生理生化實驗結果(見表1,Lactobacillusamylolyticus L6菌株的生理生化特性表)表明菌株L6為革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性、同型發酵的無芽孢桿菌。葡萄糖同型發酵，生長溫域寬(30-47°C可正常生長，見圖2)，生長速度快；
[0042]表1
[0043]
【權利要求】
1.一種解淀粉乳桿菌L6,其特征在于，該解淀粉乳桿菌(Lactobacillusamylolyticus)L6 的保藏號為 CGMCC N0.9090。
2.根據權利要求1所述的解淀粉乳桿菌L6，其特征在于，解淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylolyticus) L6 的 16S rDNA 序列為 SEQ.1D.NOl?
3.權利要求1所述解淀粉乳桿菌L6在發酵豆腐黃漿水中的一種應用。
4.根據權利要求3所述的解淀粉乳桿菌L6在發酵豆腐黃漿水中的應用，其特征在于，該應用方法包括如下步驟: (1)將黃漿水在115-121°C滅菌； (2)按黃漿水體積計，接入3%-6%的解淀粉乳桿菌L6的種子液；
(3)在35-47°C保溫酸化24-48h，黃漿水的酸度值可達到60°T_110° T。
5.根據權利要求3所述的解淀粉乳桿菌L6在發酵豆腐黃漿水中的應用，其特征在于，所述滅菌的時間為15-30分鐘。
【文檔編號】C12R1/225GK104130956SQ201410277246
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年6月19日 優先權日:2014年6月19日
【發明者】李理, 劉力 申請人:華南理工大學