專利名稱：用于檢測egfr外顯子21多態性的引物組及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于檢測EGFR外顯子21多態性的引物組以及所述引物組的應用。
背景技術：
已經認為表皮生長因子受體(EGFR)在肺癌中起重要作用。能夠阻抑(suppress) EGFR功能的藥物已被用于肺癌治療的領域。被用于治療非小細胞肺癌患者的EGFR酪氨酸激酶抑制劑(如吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)等等)作為此類藥物已知。 這些藥物不僅被用于肺癌，也被嘗試用于腺癌。然而，在一些患者組中，EGFR酪氨酸激酶抑制劑的效果有時似乎不夠。另外，在另一組患者中，盡管EGFR酪氨酸激酶抑制劑在開始誘導反應，但是存在EGFR酪氨酸激酶抑制劑的效果逐漸降低的情況，這與預期相反。因為這些原因，已針對抑制劑的使用研究了預測EGFR酪氨酸激酶抑制劑效果的因素，并已發現EGFR基因突變是此類重要因素。已知的預測性因素的例子包括EGFR外顯子在密碼子 790 處的突變(T790M) (JP2008-529532, Cancer Research, Vol. 66，No. 16，2006， pp. 7854-7858)，外顯子 18 在密碼子 719 處的突變(G719X) (Cancer Research, Vol. 66， No.16，2006，pp.7854-7858)。EGFR外顯子21在密碼子858處由亮氨酸到精氨酸的突變(EGFR外顯子21L858R) 已被明確地認為能增強吉非替尼的腫瘤減小效應。因為在高百分比(約45%)的肺癌中發現了 EGFR突變，所以EGFR突變作為在給藥前要考慮的預測性因素來說是重要的。直接測序方法(J.Clin. Oncology, Vol 23，No 11 (April 10) ,2005 pp. 2513-2520)或 SMAP(SMart-Abplification Process)方法(Clin Cancer Res2007 ； Vol. 13 (17) September 1,2007 :pp. 4974-4983)已知是檢測 EGFR 外顯子 21L858R 的技術。同時，突變檢測方法已知是容易、靈敏并且可靠的檢測突變的方法，該方法包括， 通過在一個反應中既使用突變型又使用野生型(正常型)引物，來優先擴增具有突變的堿基的核酸序列(W0 2010/001969)。

發明內容
實際測試中使用的樣品是來自血漿或血清的可溶的DNA。在此類DNA中檢測突變需要高特異性。然而，在直接測序方法中，特異性通常被認為是約10%，這可能不足以檢測可溶DNA中的突變。同時，盡管SMAP方法在靈敏度的角度來看可能是足夠的，但是對材料 (例如引物)的設計可能不容易，實際的操作可能是復雜的。考慮這些情況進行了本發明。本發明涉及提供下述探針以及所述探針的應用，所述探針能夠以高靈敏度容易地檢測EGFR外顯子21多態性的探針。本發明第一方面的一個示例性實施方式是[1]用于檢測EGFR外顯子21中多態性的引物組，所述引物組包含Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸，并且能夠通過使用SEQ ID NO 1 中的區域作為模板進行擴增，所述區域包含SEQ ID NO 1的第172792個堿基，Pl寡核苷酸具有10個堿基到50個堿基的長度，并且具有胞嘧啶作為與SEQ IDNO 1的第172792個堿基互補的堿基，P2寡核苷酸具有10個堿基到50個堿基的長度，并且具有腺嘌呤作為與SEQ ID NO 1的第172792個堿基互補的堿基，和Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸滿足下述相關性中的至少一種P1寡核苷酸的解鏈溫度高于P2寡核苷酸的解鏈溫度；或Pl寡核苷酸比P2寡核苷酸長一個或多個堿基。本發明的第一方面的另一個示例性實施方式是[2] [1]的引物組，其中Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一個在不同于與SEQ ID NO :1的第172792個堿基互補的堿基位置的位置包含至少一個與SEQ ID NO :1的堿基序列不互補的堿基。本發明的第一方面的另一個示例性實施方式是[3] [1]或[2]的引物組，其中Pl 寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一個在不同于與SEQ ID NO :1的第172792個堿基互補的堿基位置的位置包含額外的序列，所述額外的序列由連續的2到10個與SEQ ID NO 1的堿基序列不互補的堿基形成，并且位于所述寡核苷酸鏈的5'末端。本發明的第一方面的另一個示例性實施方式是W] [1]到[3]中任一項的引物組，其中Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一個在不同于與SEQID NO 1的第172792個堿基互補的堿基位置的位置包含錯配堿基或包含與SEQ ID NO :1的堿基序列不互補的2到 20個錯配堿基的序列，所述位置。本發明的第一方面的另一個示例性實施方式是[5] [1]到[4]中任一項的引物組，其中Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一個在從其3'末端起的第1位到第3位中的一處包含與SEQ ID NO 1的第172792個堿基互補的堿基。本發明的第一方面的另一個示例性實施方式是W] [1]到[5]中任一項的引物組，其中，Pl寡核苷酸的解鏈溫度比P2寡核苷酸的解鏈溫度高0. 1°C到20°C。本發明的第一方面的另一個示例性實施方式是[7] [1]到W]中任一項的引物組，其還包含與下述序列同源的引物，所述序列處于SEQ ID NO :1堿基序列中較模板核酸序列更靠5'末端側的區域中，其中所述模板核酸序列與Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸互補。本發明的第一方面的另一個示例性實施方式是[8] [1]到[7]中任一項的引物組，其包含SEQ ID NO :2到SEQ ID NO :11的寡核苷酸中的至少一個作為Pl寡核苷酸，和 SEQ ID NO 12到SEQ ID NO 21的寡核苷酸中的至少一個作為P2寡核苷酸。本發明的第二方面的一個示例性實施方式是[9]用于檢測EGFR外顯子21中多態性的引物，所述引物能夠通過使用SEQ ID NO :1中的區域作為模板進行擴增，所述區域包含SEQ ID NO 1的第172792個堿基，并且所述引物是下述寡核苷酸，所述寡核苷酸具有10 個堿基到50個堿基的長度，并且具有胞嘧啶作為與SEQ ID NO 1的第172792個堿基互補的堿基。本發明的第二方面的另一個示例性實施方式是[10] [9]的引物，其在不同于與 SEQ ID NO 1的第172792個堿基互補的堿基位置的位置包含至少一個與SEQ ID NO 1的堿基序列不互補的堿基。本發明的第二方面的另一個示例性實施方式是[11] [9]或[10]的引物，其在不同于與SEQ ID NO 1的第172792個堿基互補的堿基位置的位置包含一個或多個與SEQ ID NO 1的堿基序列不互補的堿基，其中所述一個或多個不互補的堿基選自下組，所述組由額外的序列，其由連續的2到10個堿基形成，并且位于所述引物5'末端；
錯配堿基；和2到20個錯配堿基的序列組成。本發明的第二方面的另一個示例性實施方式是[12] [9]到[11]的引物，其在從其3'末端起的第1位到第3位中的一處包含與SEQ ID NO 1的第172792個堿基互補的堿基。本發明的第三方面的一個示例性實施方式是[13]檢測EGFR基因中多態性的方法，所述方法包括(I)通過使[1]到[8]中任一項的引物組與包含核酸的核酸樣品接觸并使用所述核酸作為模板，來進行擴增；(II)通過使單鏈核酸與探針接觸，獲得由所述單鏈核酸和探針形成的雜交體，所述單鏈核酸通過所述擴增獲得，所述探針能夠檢測EGFR外顯子21中的多態性；(III)通過改變包含所述雜交體的樣品的溫度從而解離所述雜交體，測量基于所述雜交體的解離的信號的改變；(IV)基于所述信號變化測定作為解鏈溫度的、所述雜交體解離的溫度；和(V)基于所述解鏈溫度檢查EGFR外顯子21L858R的存在或評價具有EGFR外顯子 21L858R的核酸的豐度比。本發明的第三方面的另一個示例性實施方式是[14] [13]的方法，其中所述擴增和所述雜交體的獲得同時進行。本發明的第四方面的一個示例性實施方式是[15]評價EGFR酪氨酸激酶抑制劑的方法，所述方法包括用[13]或[14]的方法檢測EGFR基因中的多態性；和基于所述檢測的結果評價核酸樣品來源對EGFR酪氨酸激酶抑制劑的抗性，或 EGFR酪氨酸激酶抑制劑的效果。本發明的第五方面的一個示例性實施方式是[16]可用于在[13]或[14]的方法中的引物，所述引物是SEQ ID NO :2到SEQ ID NO 11中任一的Pl寡核苷酸，或SEQ ID NO: 12到SEQ ID NO 21中任一的P2寡核苷酸。本發明的第六方面的一個示例性實施方式是[17]包含[1]到[8]中任一的引物組的試劑盒。本發明的第六方面的另一個示例性實施方式是[18] [17]的試劑盒，其還包含能夠檢測EGFR外顯子21L858R的探針。


圖IA是核酸混合物解鏈曲線的例子。圖IB是核酸混合物的差異解鏈曲線的例子。圖2是標準曲線的例子。圖3是通過與本發明的實施例相關的引物組獲得的、不具有突變的核酸混合物的解鏈曲線。圖4是通過與本發明的示例性實施方式相關的引物組獲得的、具有0. 突變含量的核酸混合物的解鏈曲線。圖5是通過與本發明的示例性實施方式相關的引物組獲得的、具有0.3%突變含量的核酸混合物的解鏈曲線。圖6是通過與本發明的示例性實施方式相關的引物組獲得的、具有突變含量的核酸混合物的解鏈曲線。
具體實施例方式引物組本發明一個方面的一個示例性實施方式的引物組檢測EGFR外顯子21中的多態性。引物組至少具有Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸，并且能夠通過使用SEQ ID N0:1中的區域作為模板進行擴增，其中所述區域至少具有SEQ ID NO 1的第172792個堿基。Pl寡核苷酸具有10個堿基到50個堿基的長度，并且具有胞嘧啶(C)作為與SEQ ID NO 1的第172792個堿基互補的堿基。P2寡核苷酸具有10個堿基到50個堿基的長度，并且具有腺嘌呤(A)作為與SEQ ID NO 1的第172792個堿基互補的堿基。Pl寡核苷酸的解鏈溫度(Tm)高于P2寡核苷酸的解鏈溫度，和/或Pl寡核苷酸比 P2寡核苷酸長一個或多個堿基。引物組具有下述Pl寡核苷酸和下述P2寡核苷酸，所述Pl寡核苷酸是突變型引物，其具有C作為與SEQ ID NO 1的第172792個堿基互補的堿基，并且可被用于檢測EGFR 外顯子21多態性，所述P2寡核苷酸是野生型引物，其具有A作為與SEQ ID NO :1的第 172792個堿基互補的堿基，其中Pl寡核苷酸的解鏈溫度高于P2寡核苷酸，或Pl寡核苷酸比P2寡核苷酸長一個或多個堿基。通過在一個反應體系中使用這兩種寡核苷酸作為引物， 可以容易地以高靈敏度檢測EGFR外顯子21的多態性。“EGFR外顯子21L858R”在本文中表示EGFR基因外顯子21中的突變，其中密碼子 858中的亮氨酸被突變成精氨酸。“EGFR外顯子21的多態性”在本文中表示“EGFR外顯子21L858R”。"EGFR外顯子21的堿基序列”在本文中表示SEQ ID NO 1的序列，其為GenBank 登記號 NC000007(版本:NC000007. 13)，55086724-55275030 的 Gene ID :1956。EGFR外顯子21L858R的突變在本文中表示下述突變，其中SEQ IDNO :1的第 172792個堿基從胸腺嘧啶(T)突變成鳥嘌呤(G)。SEQ ID NO=I中所示堿基序列的第172792位被特定地稱作“突變位點”。“模板核酸序列”在本文中表示SEQ ID NO=I中所示的堿基序列作為模板的部分， 引物退火到其上，從而進行核酸的擴增。“解鏈溫度(Tm) ”表示雙鏈核酸解離的溫度。所述溫度通常被定義為下述溫度在所述溫度下波長260nm處樣品的吸光度提高達到相對于通過提高樣品溫度所能夠到達的吸光度總提高而言的50%。即，加熱雙鏈核酸(例如DNA溶液)時，260nm處的吸光度提高。 這由于DNA的解鏈而發生，所述DNA的解鏈是這樣一種現象雙鏈DNA兩條鏈之間的氫鍵通過加熱而松開，隨后雙鏈DNA解離成單鏈DNA。當所有雙鏈DNA解離并變成單鏈DNA時，其吸光度可以是加熱開始時吸光度(僅雙鏈DNA的吸光度)的約1. 5倍，從而可以確定解鏈的完成。Tm以所述現象為基礎來定義。術語“步驟”不僅包括獨立的步驟，也包括不能與另一步驟清楚區分的步驟，前提條件是實現了所述步驟的預期效果。使用“從……到……”表示數字范圍在本文中表示下述數值范圍，所述范圍包括作為最小值被標明為范圍下限的數值，和作為最大值被標明為范圍上限的數值。除非另有說明，涉及組合物中組分含量時，如果組合物包含屬于組分范圍內的多種物質，則含量表示組合物中多種物質含量的總和。引物組引物組至少具有Pl寡核苷酸(其為突變型引物)和P2寡核苷酸(其為野生型引物)。Pl寡核苷酸能夠通過使用SEQ ID NO 1中的區域作為模板進行擴增，其中所述區域包括位于SEQ ID NO 1中第172792位突變位點處的堿基。Pl寡核苷酸具有10個堿基到50個堿基的長度，并且具有胞嘧啶作為與SEQ ID NO :1的第172792個堿基互補的堿基。P2能夠通過使用SEQ ID NO=I中的區域作為模板進行擴增，其中所述區域包括位于SEQ ID NO 1中第172792位突變位點處的堿基。P2寡核苷酸具有10個堿基到50個堿基的長度，并且具有腺嘌呤作為與SEQ IDNO 1的第172792個堿基互補的堿基。Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸需要處于下述相關性中的至少一種P1寡核苷酸具有高于P2寡核苷酸的Tm，或Pl寡核苷酸比P2寡核苷酸長一個或多個堿基。滿足上述相關性中的至少一種時，Pl寡核苷酸可比P2寡核苷酸對模板核酸序列具有更高的親和力，并且可具有對模板核酸序列更強的結合特性。因此，通過使用Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸二者作為引物在一個反應中擴增核酸時，使用Pl寡核苷酸的擴增可以是優先的，并且由此能夠容易地以高靈敏度檢測突變型EGFR外顯子21的多態性。可以滿足關于Tm的相關性和關于堿基長度的相關性之一或二者。當Pl寡核苷酸具有高于P2寡核苷酸的Tm時，Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸之間的 Tm差異不被特別限制。例如，其可優選地從0. 1°C到20°C，更優選地從0. 1°C到10°C，進一步更優選地從0. 1°C到5°C。在該范圍內，可以阻抑假陽性。Tm在本文中表示雜交體的Tm， 所述雜交體由具有基本完全互補性的堿基序列組成。通過GC含量調節Tm時，可通過例如相對遞增的GC含量建立相對高的Tm。在實施方式中，可優選將Pl寡核苷酸的GC含量設定為高于P2寡核苷酸的GC含量。或者，通過向寡核苷酸序列中并入例如修飾，來使用LNA作為RNA類似物、使用PNA作為肽核酸、使用 BNA作為交聯的核酸等等，可以將寡核苷酸的Tm設定為比不包括此類修飾的另一寡核苷酸相對更高。當Pl寡核苷酸比P2寡核苷酸長一個或多個堿基時，Pl寡核苷酸具有更高的對模板序列的親合力。因此，與使用P2寡核苷酸的擴增相比，使用Pl寡核苷酸的擴增可優先進行。可優選地如下實現關于Tm的相關性和關于堿基長度的相關性P1寡核苷酸或P2 寡核苷酸中的至少一個，在不同于與SEQ ID NO :1的第172792個堿基互補的堿基位置的位置上，具有至少一個與SEQ ID NO :1的堿基序列不互補的堿基。這可使得這些相關性能夠通過序列的構建被調節。
可以通過針對與突變位點不同的位置處的非互補性堿基，選擇寡核苷酸中插入或添加的位置、堿基數量、堿基類型等等，來調節寡核苷酸的Tm或堿基長度。基于此種考慮， 堿基可被置于Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸中，或置于二者中。添加一個或多個堿基以延長Pl寡核苷酸的長度時，可優選將堿基添加至突變位點的5’末端側的位點，以及，可更優選地將堿基添加至與Pl寡核苷酸的模板核酸序列互補的區域的5’末端側的位點，從而可例如阻抑假陽性。使得Pl寡核苷酸比P2寡核苷酸更長時，寡核苷酸之間的差異不受具特別限制。 在實施方式中，差異可以是1個堿基到20個堿基，優選地1個堿基到10個堿基，更優選地 1個堿基到5個堿基。被添加以延長Pl寡核苷酸長度的堿基可以與SEQ ID NO=I中所示堿基序列互補或不互補。當堿基與SEQ ID NO :1中所示堿基序列不互補時，堿基可與下文闡述的額外的序列連續或不連續。當每條寡核苷酸“能夠通過使用SEQ ID NO :1中的區域作為模板進行擴增，其中所述區域包含SEQ ID NO 1的第172792個堿基”時，這意味著使用寡核苷酸作為擴增反應例如PCR(聚合酶鏈式反應)的引物時，寡核苷酸退火至包括突變位點的預定區域上，并且能夠擴增與具有突變位點的序列互補的序列。因此，每條寡核苷酸可以是與SEQ ID NO 1 中所示堿基序列完全互補的序列，與SEQ ID NO :1中所示堿基序列部分互補的序列，或具有部分不互補的堿基(錯配堿基)的序列，只要其能夠退火至SEQ ID NO 1中所示堿基序列中包括突變位點的預定區域即可。錯配堿基表示不形成G-C或A-T的正確配對的核酸堿基， 并且特定地表示產生G-G、G-A、G-T、A-A、A_C、C_T、C-C或T-T的錯配堿基對的核酸堿基。例如，如下文所述，可優選每條寡核苷酸是部分互補的序列，或是具有部分錯配的堿基的序列，只要關于Tm的相關性或關于堿基長度的相關性不被破壞即可。使用此類序列時，例如，檢測突變的靈敏度可被提高，并且假陽性可被降低。每條寡核苷酸的長度可以在從10個堿基到50個堿基的范圍內，并且可優選地在從15個堿基到40個堿基的范圍內，并可更優選地在從18個堿基到25個堿基的范圍內，只要上文所述關于Tm的相關性或關于堿基長度的相關性不被損壞即可。在所述范圍內的長度例如可提高檢測靈敏度，并且高效地阻抑假陽性。堿基長度可與Pl寡核苷酸的其他結構特征一起被調節。不互補的堿基(不是與突變位點互補的堿基)可以是下述額外的序列，所述序列由連續的2到10個堿基形成，并且位于寡核苷酸鏈的5’末端。此類額外的序列例如可提高檢測靈敏度，或可阻抑假陽性。可被分別添加至Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸的額外的序列可以是與SEQ ID NO=I 中所示堿基序列不互補的3個堿基到10個堿基，優選地4個堿基到9個堿基，更優選地5 個堿基到7個堿基。對5’末端添加額外的序列時，例如可提高靈敏度，并且可高效地阻抑每條引物退火至每條其他模板核酸序列，或可提高擴增效率。另外，當額外的序列的長度在所述范圍內時，例如假陽性可被阻抑，或擴增效率可被提高。在Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸中，額外的序列可以具有相同或不同的長度，并且可具有相同或不同的堿基序列。在一些實施方式中，額外的序列具有不同的堿基序列可以是優選的。額外序列的堿基序列的GC含量可優選地從約40%到60%，但其不特別限于此。GC含量處于該范圍內時，例如可維持突變型序列或野生型序列的擴增效率。另外，對Pi寡核苷酸和P2寡核苷酸二者添加額外的序列時，Pl寡核苷酸的額外序列的GC含量可優選地更高。在這種情況下，突變型序列檢測的靈敏度可被提高。Pl寡核苷酸可在其3’區中具有堿基(胞嘧啶)作為與EGFR外顯子21L858R的突變位點互補的堿基。在Pl寡核苷酸中，可優選地，3’末端中第1個到第3個堿基中的任一是與突變位點處堿基互補的堿基。當與突變位點處堿基互補的堿基被置于此類位置中時， 例如檢測靈敏度可被提高，或假陽性可被阻抑。注意，“3’末端的第1個堿基”在本文中表示3’末端的堿基，“3’末端的第3個堿基”表示當3’末端被定義為第1個堿基時從3’到5’方向計數的第三個堿基。在另一方面，P2寡核苷酸可在其3’區具有堿基(腺嘌呤)作為與EGFR外顯子 21L858R的突變位點互補的堿基。在Pl寡核苷酸中，可優選地，3’末端中第1個到第3個堿基中的任一是與突變位點處堿基互補的堿基。當與突變位點處堿基互補的堿基被置于此類位置中時，例如，檢測靈敏度可被提高，或假陽性可被阻抑。Pl寡核苷酸中與突變位點互補的堿基與3’末端的距離(堿基位置)可與P2寡核苷酸中的相同或不同。在一些實施方式中，Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸中與突變位點互補的堿基到3’末端的距離可優選地是相同的。當Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸中的距離相同時，例如，檢測靈敏度可被提高或假陽性可被阻抑。在一些實施方式中，一個堿基或連續的2-20個堿基可以是錯配堿基，其為位于不是寡核苷酸鏈中突變位點之處的不互補的堿基。引入此類錯配堿基時，例如，檢測靈敏度可被提高或假陽性可被阻抑。盡管此類錯配堿基的總數可根據組成每條寡核苷酸的堿基序列而變化，但是總數可優選地為10個或更少、更優選地為5個或更少、進一步更優選地為3個或更少。當錯配堿基的數量在此類范圍內時，這可以是有利的，例如，檢測靈敏度可被提高或假陽性可被阻抑。此類錯配堿基可優選地被置于突變位點5’末端側的位置中。特別地，位于突變位點5’末端側第3個到第7個堿基中的至少1個堿基可優選地被制成錯配堿基，位于突變位點5’末端側第3個到第5個堿基中的至少1個堿基可更優選地被制成錯配堿基。使用此類位置時，例如，檢測靈敏度可被提高或假陽性可被阻抑。當Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸二者均具有錯配堿基時，可優選地，Pl寡核苷酸中錯配堿基的位置與P2寡核苷酸中錯配堿基的位置不彼此對應。錯配堿基的位置可以是不同的。其可優選地偏離1-6個堿基，更優選地偏離2-3個堿基。另外，例如當Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸均具有錯配堿基時，可優選地與P2寡核苷酸中錯配堿基的位置相比，Pl寡核苷酸中錯配堿基的位置處于更遠的3’末端側。當Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸中錯配堿基的位置這樣相關時，例如，假陽性可被阻抑。與SEQ ID NO=I中所示堿基序列不互補的任何堿基可被用作錯配堿基。在實施方式中，腺嘌呤㈧或胸腺嘧啶⑴可由于它們相對弱的結合活性而是優選的。使用“A”或 “T”時，例如，假陽性可被阻抑。注意在EGFR外顯子21的突變位點周圍存在多態性，這與本文要檢測的多態性不相關。需要時可向Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸二者中不是檢測靶標的堿基添加突變，從而使得由此類無關多態性導致的影響無效。此類堿基在本文中被稱作“無效突變”。可在Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸二者或之一中添加額外的序列。另外，可在Pl寡
核苷酸或P2寡核苷酸二者或之一中添加錯配堿基。用于多態性檢測的引物組包括至少一個Pl寡核苷酸和至少一個P2寡核苷酸。在
實施方式中，引物組中可包括兩個或更多的Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸二者或之一，只要上
文所述關于Tm的相關性或關于堿基長度的相關性通常不被破壞即可。Pl寡核苷酸的例子在表1中展示，P2寡核苷酸的例子在表2中展示。注意表1
和2中的下劃線的“A”或“T”表示錯配堿基，5’末端側的大寫字母表示額外的序列。表1
和表2中各寡核苷酸3’末端的堿基是與突變位點處的堿基互補的堿基。另外，表1和表2
中的“(a)，，表示無效突變。注意Tm用MELTCALC 計算。表 權利要求
1.用于檢測EGFR外顯子21中多態性的引物組，所述引物組包含Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸，并且所述引物組能夠通過使用SEQ ID NO :1中的區域作為模板進行擴增，所述區域包含SEQ ID NO 1的第172792個堿基，所述Pl寡核苷酸具有10個堿基到50個堿基的長度，并且具有胞嘧啶作為與SEQ ID NO 1的第172792個堿基互補的堿基，所述P2寡核苷酸具有10個堿基到50個堿基的長度，并且具有腺嘌呤作為與SEQ ID NO 1的第172792個堿基互補的堿基，和所述Pl寡核苷酸和所述P2寡核苷酸滿足下述相關性中的至少一種所述Pl寡核苷酸的解鏈溫度高于P2寡核苷酸的解鏈溫度；或所述Pl寡核苷酸比P2寡核苷酸長一個或多個堿基。
2.權利要求1所述的引物組，其中所述Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一個在不同于與SEQ ID NO :1的第172792個堿基互補的堿基位置的位置包含至少一個與SEQ ID NO 1的堿基序列不互補的堿基。
3.權利要求1所述的引物組，其中所述Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一個在不同于與SEQ ID NO :1的第172792個堿基互補的堿基位置的位置包含額外的序列，所述額外的序列由連續的2到10個不與SEQ IDNO 1的堿基序列互補的堿基形成，并且位于寡核苷酸鏈的5'末端。
4.權利要求1所述的引物組，其中所述Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一個在同于與SEQ ID NO 1的第172792個堿基互補的堿基位置的位置包含錯配堿基或包含與SEQ ID NO 1的堿基序列不互補的2到20個錯配堿基的序列。
5.權利要求1所述的引物組，其中所述Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一個在從其3'末端起的第1位到第3位中的一處包含與SEQ ID NO 1的第172792個堿基互補的堿基。
6.權利要求1所述的引物組，其中所述Pl寡核苷酸的解鏈溫度比所述P2寡核苷酸的解鏈溫度高0. 1°C到20°C。
7.權利要求1所述的引物組，所述引物組還包含與下述序列同源的引物，所述序列處于位于SEQ ID NO :1堿基序列中的模板核酸序列的5'末端側的區域中，其中所述模板核酸序列與所述Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸互補。
8.權利要求1所述的引物組，所述引物組包含SEQID NO 2到SEQID NO 11的寡核苷酸中的至少一個作為Pl寡核苷酸，和SEQ ID N0:12到SEQ ID NO :21的寡核苷酸中的至少一個作為P2寡核苷酸。
9.用于檢測EGFR外顯子21中多態性的引物，所述引物能夠通過使用SEQID NO :1中的區域作為模板進行擴增，所述區域包含SEQ ID NO :1的第172792個堿基，并且，所述引物是下述寡核苷酸，所述寡核苷酸具有10個堿基到50個堿基的長度，并且具有胞嘧啶作為與 SEQ ID NO 1的第172792個堿基互補的堿基。
10.權利要求9所述的引物，所述引物在不同于與SEQID NO :1的第172792個堿基互補的堿基位置的位置包含至少一個與SEQ ID NO :1的堿基序列不互補的堿基。
11.權利要求9所述的引物，所述引物在不同于與SEQID NO :1的第172792個堿基互補的堿基位置的位置包含一個或多個與SEQ ID NO :1的堿基序列不互補的堿基，所述一個或多個不互補的堿基選自由下組，所述組由額外的序列，所述序列由連續的2到10個堿基形成，且位于所述引物5'末端； 錯配堿基；和2到20個錯配堿基的序列組成。
12.權利要求9所述的引物，所述引物在從其3'末端起的第1位到第3位中的一處包含與SEQ ID NO 1的第172792個堿基互補的堿基。
13.檢測EGFR基因中多態性的方法，所述方法包括(I)通過使權利要求1到8中任一項所述的引物組與包含核酸的核酸樣品接觸并且使用所述核酸作為模板來進行擴增；(II)獲得單鏈核酸和探針形成的雜交體，這通過使所述單鏈核酸與所述探針接觸來實現，所述單鏈核酸通過所述擴增獲得，所述探針能夠檢測EGFR外顯子21中的多態性；(III)通過改變包含所述雜交體的樣品的溫度從而解離所述雜交體，測量基于所述雜交體解離的信號的改變；(IV)基于所述信號變化測定作為解鏈溫度的、所述雜交體解離的溫度；和(V)基于所述解鏈溫度檢查EGFR外顯子21L858R的存在或評價具有EGFR外顯子 21L858R的核酸的豐度比。
14.權利要求13所述的方法，其中所述擴增和所述雜交體的獲得同時進行。
15.評價EGFR酪氨酸激酶抑制劑的方法，所述方法包括 用權利要求13所述的方法來檢測EGFR基因中的多態性；和基于所述檢測的結果評價核酸樣品來源對EGFR酪氨酸激酶抑制劑的抗性，或EGFR酪氨酸激酶抑制劑的效果。
16.可用于權利要求13所述的方法中的引物，所述引物是SEQID NO :2到SEQ ID NO 11中任一條的Pl寡核苷酸，或SEQ ID NO 12到SEQ IDNO 21中任一條的P2寡核苷酸。
17.包含權利要求1到8中任一項所述的引物組的試劑盒。
18.權利要求17所述的試劑盒，其還包含能夠檢測EGFR外顯子21L858R的探針。
全文摘要
本發明提供了用于檢測EGFR外顯子21多態性的引物組及其應用。本發明提供了用于檢測EGFR外顯子21L858R中多態性的引物組。所述引物組具有P1寡核苷酸和P2寡核苷酸，并且可通過使用包括SEQ ID NO1的第172792個堿基的區域進行擴增。作為與SEQ ID NO1的第172792個堿基互補的堿基，P1寡核苷酸具有胞嘧啶，P2寡核苷酸具有腺嘌呤。P1寡核苷酸的解鏈溫度高于P2寡核苷酸的解鏈溫度，和/或P1寡核苷酸比P2寡核苷酸長一個或多個堿基。本發明還提供了多態性檢測引物，使用所述引物組的多態性檢測方法，使用所述引物組評價EGFR酪氨酸激酶抑制劑的方法，多態性檢測方法中使用的引物和包括所述引物組的試劑盒。
文檔編號C12N15/11GK102453764SQ20111034176
公開日2012年5月16日 申請日期2011年10月28日 優先權日2010年10月29日
發明者井口亞希 申請人:愛科來株式會社