專利名稱：一種水稻基因定位克隆的新方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物學的基因定位克隆方法，特別涉及一種水稻基因定位克隆的新方法。
背景技術：
水稻是最重要的糧食作物和模式植物。1991年，日本發(fā)起“水稻基因組計劃(Rice Genome Program, RGP) ”，先后美國、中國等國家和地區(qū)相繼加入，成為全球性大科學工程。 與此同時，中國于1992年8月宣布獨立開展自己的水稻基因組計劃。在1991-2011年這20 年中，先后繪制了水稻遺傳圖、物理圖、轉錄圖、序列圖。RGP對農業(yè)和作物改良的最大影響是定位、克隆基因，催生了設計育種(Breeding by design).定位基因(或QTL)后可以通過聚合育種或分子標記輔助選擇(MA 對品種進行改良?？寺』蚩梢詭椭N家理解基因功能或通過基因操作(基因工程或分子標記育種)用于新品種選育。迄今為止，定位或克隆的水稻基因約2000個?，F(xiàn)有的方法主要是，根據連鎖不平衡原理依據重組值確定分子標記與目標基因的遺傳距離實行基因定位。通常情況下，分子標記距離目標基因越遠，重組體越多，距離越近，重組體越少，直至為零。如果基因兩端的分子標記都符合這個規(guī)律，則稱 “Match”(即基因定位準確，為典型的孟德爾因子)如果圖位克隆，則經過精細定位、候選基因、基因功能互補實驗，實現(xiàn)反向遺傳學方法基因克隆。1995年，美國幾個實驗室合作，通過此方法克隆了水稻抗白葉枯病基因fe-21，那以后，克隆水稻基因一直沿用這種方法，在這16年中大約克隆了 300余個基因，定位了約 2000余個基因。現(xiàn)有的反向遺傳學方法(如上方法)的優(yōu)點在于(1)在不知道基因功能的條件下可以克服重要農藝性基因；( 技術流程確定，在中等或中等以上規(guī)模實驗室均可定位或克隆基因。其存在的主要問題及不足之處在于(1)基因效應較小時難以鑒定或克隆到基因；( 目標基因區(qū)多態(tài)性低或無多態(tài)性時難以實行此法；C3)在幾個或多個基因以單倍型的形式作用時難以通過此策略精確定位或克隆基因。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種水稻基因定位克隆的新方法。本發(fā)明要解決的問題是，(1)通過區(qū)間作圖或染色體片段代換系鑒定基因效應較小的基因；(2)通過篩選多態(tài)性親本、構建一套多態(tài)性材料進而構建作圖群體、定位群體、效應群體解決前述多態(tài)性問題；(3)通過設定“目標基因區(qū)”定位、克隆目標基因。本發(fā)明的技術方案是本發(fā)明一種水稻基因定位克隆的新方法包括如下主要方法和步驟(1)構建基因定位群體利用兩個多態(tài)性高的親本雜交或回交建立基因定位群體，群體指標為，1)多態(tài)性為80% ；2)育性正常；3)偏分離位點少于10%。
(2)以F5或BC2 Fl世代為基礎材料，構建基因定位群體、作圖群體(部分作圖)、 基因效應群體。(3)以性狀為導向，以區(qū)間作圖為基本方法確定目標基因區(qū)。(4)依據“Match”原理鑒定目標基因。(5)建立多個群體用于鑒定基因效應，以2-3個群體(必要情況下建立次級群體)。(6)當緊密連鎖的標記與基因的遺傳距離為0. 1-1CM時候選基因，進行功能互補實驗。本發(fā)明所帶來的優(yōu)點或有益效果本發(fā)明所使用的群體除目標基因區(qū)外，大部分區(qū)域(基因組的其它背景區(qū)域)為純合，在“基因組掃描”階段減少了實驗消耗，作圖效率提高、定位基因的時程縮短。因“以性狀分離鎖定雜合區(qū)”，所以，目標基因雜合，目標基因兩側區(qū)雜合，容易產生大的“次級群體”，更容易“逼近”目標基因。因為構建了基礎群體，其群體多態(tài)性高，目標基因多，如果需要構建新的定位群體，可以通過衍生或重新構建新群體。本發(fā)明適于定位、克隆多個基因。通過建立“染色體片段代換系群體”可以鑒定單一或少數幾個基因區(qū)，有利于揭示某些特定性狀的基因作用，克隆一個或幾個基因。


圖1是一種水稻基因定位克隆的新方法的基因定位的基本原理2是一種水稻基因定位克隆的新方法的實施例圖
具體實施例方式一種水稻基因定位克隆的新方法包括如下主要方法和步驟(1)構建基因定位群體，利用兩個多態(tài)性高的親本雜交或回交建立基因定位群體，群體指標為，1)多態(tài)性為80% ；2)育性正常；3)偏分離位點少于10%。(2)以F5或BC2 Fl世代為基礎材料，構建基因定位群體、作圖群體(部分作圖)、 基因效應群體。(3)以性狀為導向，以區(qū)間作圖為基本方法確定目標基因區(qū)。(4)依據“Match”原理鑒定目標基因。(5)建立多個群體用于鑒定基因效應，以2-3個群體(必要情況下建立次級群體)。(6)當緊密連鎖的標記與基因的遺傳距離為0. 1-1CM時候選基因，進行功能互補實驗?；蚨ㄎ坏幕驹韰⒁姼綀D1。
具體實施方式
參見附圖2.從Ml到M2之間為雜合區(qū)，目標基因雜合，基因兩側的區(qū)域都為雜合。此區(qū)域依據性狀分離確定。在集團分析(Bulk anylisns)時，由于該區(qū)域多態(tài)性高，由性狀分離鎖定， 所以該區(qū)域容易確定。該區(qū)域因候選基因的不同分為兩種情況，一種情況為主效基因，另一種情況為較大的QTL區(qū)間(M1-M2)。這是典型的情況。另外的特殊情況可分解處理。集團分析后實行精細基因定位。精細定位是重新構建次生群體，次生群體有 5000-10000個個體構成，用以基因精細定位。將基因精細定位于數Kb指數十Kb的候選基因區(qū)，采用生物信息學技術方法并根據基因定位、基因克隆等方面的知識確定候選基因。對確定的候選基因進行功能互補實驗，實驗完成后克隆得到目標基因。參考資料[l]Tian F, Li D J, Fu Q, Zhu Z F, Fu Y C, Wang X K, Sun C Q. Construction of introgression lines carrying wild rice(Oryzarufipogon Griff.) segments in cultivated rice (Oryza sativa L. ) background and characterization of introgressed segments associated with yield-related traits. Theoretical and Applied Genetics,2006,112 :570-580.2一種水稻數量性狀基因座(QTL)定位的方法中國CN101974620A號專利。3水稻秈粳分類控制基因PHRl及其應用中國CN1778815號專利。
權利要求
1. 一種水稻基因定位克隆的新方法，其特征在于方法和步驟(1)構建基因定位群體利用兩個多態(tài)性高的親本雜交或回交建立基因定位群體，群體指標為，1)多態(tài)性為80% ；2)育性正常；3)偏分離位點少于10% ；(2)以F5或BC2Fl世代為基礎材料，構建基因定位群體、作圖群體，部分作圖、基因效應群體；(3)以性狀為導向，以區(qū)間作圖為基本方法確定目標基因區(qū)；(4)依據“Match”原理鑒定目標基因；(5)建立多個群體用于鑒定基因效應，以2-3個群體，必要情況下建立次級群體；(6)當緊密連鎖的標記與基因的遺傳距離為0.1-1CM時候選基因，進行功能互補實驗。
全文摘要
一種水稻基因定位克隆的新方法。1.構建基因定位群體。2.構建基因定位群體、作圖群體、基因效應群體。3.以性狀為導向，以區(qū)間作圖為基本方法確定目標基因區(qū)。4.依據“Match”原理鑒定目標基因。5.建立多個群體用于鑒定基因效應。6.當緊密連鎖的標記與基因的遺傳距離為0.1-1cm時候選基因，進行功能互補實驗在“基因組掃描”階段減少了實驗消耗，作圖效率提高、定位基因的時程縮短。容易產生大的“次級群體”，更容易“逼近”目標基因。因為構建了基礎群體，其群體多態(tài)性高，目標基因多，如果需要構建新的定位群體，可以通過衍生或重新構建新群體。適于定位、克隆多個基因。有利于揭示某些特定性狀的基因作用，克隆一個或幾個基因。
文檔編號C12N15/10GK102382820SQ201110350059
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月8日 優(yōu)先權日2011年11月8日
發(fā)明者丁德亮, 亓娜, 孫津偉, 崔晶, 張欣, 施利利, 王松文 申請人:天津農學院