專利名稱：一種纖維素酶產生菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種纖維素酶產生菌及其應用，所本發明所涉及的纖維素酶產生菌，其具有較好的纖維素酶和半纖維素酶的產酶能力。
背景技術：
纖維素是自然界中含量最豐富的碳水化合物，是一類可再生的資源和能源。但是纖維素很難被分解利用，如何將纖維素轉化為能直接利用的資源和能源是擺在人們面前的一個難題。纖維素的降解有兩條途徑化學法和生物法，化學法的特異性差、純度低、污染環境，而生物酶法可克服這些缺點，因此，纖維素酶一經發現就受到了世界各國科學界的重視。纖維素酶是指能降解纖維素kta-1，4-葡萄糖苷鍵，使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖的一組酶的總稱，是起協同作用的多組分酶系。纖維素酶的主要組分是內切Beta-1， 4-葡萄糖酶、外切葡聚糖酶和Beta-葡萄糖苷酶。前兩種酶主要溶解纖維，后一種酶將纖維二糖轉化為葡萄糖，當這三種主要成分活性比例適當時，就能完成纖維素的降解。纖維素酶的應用現在已經擴展到醫藥、遺傳、紡織、日用化工、造紙、環境、食品發酵、飼料、工業洗滌、石油開采、資源再生、廢水處理、農業、生物能源等各個領域，尤其是在生物能源方面的應用，前景十分廣闊。纖維素酶的獲得是通過纖維素酶產生菌的發酵來得至IJ，而目前存在的主要問題是纖維素酶的酶活力不高，酶解效率不高。選育優良菌種是提高纖維素酶活力的關鍵。因此纖維素酶高產菌株的篩選具有重要的生態效益、經濟效益和社會效益。自然界微生物資源豐富，因而從自然界中獲得高產纖維素酶的菌株是很有必要的。

發明內容
本發明的目的在于，提供了一種纖維素酶產生菌。本發明的纖維素酶產生菌具有較好的纖維素酶和半纖維素酶的產酶能力，尤其是對Beta-葡萄糖苷酶具有良好的生產能力。本發明提供的技術方案為一種纖維素酶產生菌，纖維素酶產生菌的分類命名為檜狀青霉(Penicillium piceum)，菌株的18S rDNA基因序列如SEQ ID NOl所述，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏日期:2011年10月9日，保藏號CGMCC5314。優選的是，所述的纖維素酶產生菌的應用中，所述纖維素酶產生菌應用于生產纖維素酶和半纖維素酶。本發明所述的纖維素酶產生菌具有較好的纖維素酶和半纖維素酶的產酶能力，尤其是對Beta-葡萄糖苷酶具有良好的生產能力。本發明的纖維素酶產生菌以及所生產的纖維素酶和半纖維素酶在生物燃料、醫藥、日用化工、食品發酵等多個行業具有廣泛的應用前
景ο


圖1為本發明所述的纖維素酶產生菌的基因序列的進化樹。圖2為本發明所述的纖維素酶產生菌的菌株掃描電鏡照片。圖3為本發明的檜狀青霉9_3(在微晶纖維素上生長)的產酶曲線。圖4(a)為分別以三種纖維素生物質為底物，里氏木霉的粗酶液單獨水解、檜狀青霉9-3的粗酶液單獨水解以及里氏木霉的粗酶液和檜狀青霉9-3的粗酶液共同水解過程中的還原糖濃度變化情況圖。圖4(b)為分別以三種纖維素生物質為底物，里氏木霉的粗酶液單獨水解、檜狀青霉9-3的粗酶液單獨水解以及里氏木霉的粗酶液和檜狀青霉9-3的粗酶液共同水解過程中的葡萄糖濃度變化情況圖。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。本發明提供一種纖維素酶產生菌，纖維素酶產生菌的分類命名為檜狀青霉 (Penicillium piceum)，菌株的18S rDNA基因序列如SEQ ID NOl所述，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏日期2011年10月9日，保藏號CGMCC5314。所述的纖維素酶產生菌的應用中，所述纖維素酶產生菌應用于生產纖維素酶和半纖維素酶。一、纖維素酶產生菌的制備方法(1)將采集的可能含有菌種的樣品取適量添加到含有纖維素的富集培養基中，培養3-7天后測定纖維素酶的活性，從而確定含有可以產生纖維素酶的菌群的樣品；(2)針對上述步驟(1)所確定的含有可以產生纖維素酶的菌群的樣品，再篩選該樣品中能夠產生高活力的纖維素酶的菌株，即將該樣品的富集培養液稀釋涂布在土豆汁固體平板上，挑取平板上長出的各個菌落到產纖維素酶的產酶培養基中，培養3-7天后測定纖維素酶活，從中篩選出生產纖維素酶酶活力較高的菌株。二、纖維素酶產生菌的鑒定1、纖維素酶產生菌的基因序列的鑒定(1)利用發酵培養基培養過夜，收集菌絲，提取真菌的基因組。發酵培養基葡萄糖10g/l，玉米漿10 40g/l，(MM)2SO4 2 6g/l，甘油1 3g/ 1，KH2PO4 2 8g/l，MgS04 0 4g/l，CaC03 0 5g/l，Tween80 0 4g/l，pH4 7，121°C， 滅菌20min。(2)利用真菌18S rDNA的通用引物，以真菌基因組為模板，通過PCR擴增反應，擴增真菌的18S rDNA基因，并對PCR產物進行純化，送去測序，對該菌18S rDNA 的測序結果進行數據庫同源性比較。其中，真菌18S rDNA的通用上游引物序列為 GGAAGGGRTGTATTTATTAG ；通用下游引物序列為TCCTCTAAATGACCAAGTTTG。基于該菌株的18S rDNA序列已登錄GenBank數據庫，登錄號為⑶477623，基于該菌株的18S rDNA序列與GenBank數據庫中的序列進行比對，使用MEGA 4. 0軟件，制作進化樹(見圖1)。分析結果顯示該菌株與Penicillium piceum代表菌種的親緣關系最近，最終命名為檜狀青霉9-3。被比對分析序列右側為GenBank中的序列號。2、纖維素酶產生菌的菌株形態特征的表征圖2為本發明的纖維素酶產生菌的掃描電鏡照片。分生孢子梗發生于氣生菌絲， 孢梗莖短，帚狀枝雙輪生，彼此緊貼。梗基每輪6-10個，瓶梗每輪5-8個，披披針狀。分生孢子橢圓形或近球形，壁光滑。右圖為菌落在PDA平板上30°C生長7天，菌落邊緣的菌絲體薄，質地絮狀，邊緣兼絨狀。分生孢子面暗黃綠色，菌落表面有少量淡黃色滲出液，反面黃褐色。三、纖維素酶產生菌的應用接種該菌到50ml發酵培養基中J8°C，190rpm培養，在一定時間點取樣，離心，取上清測定胞外蛋白濃度和各個纖維素酶和半纖維素酶活力。以下實驗中，測定濾紙酶酶活、內切葡聚糖酶酶活、Beta-葡萄糖苷酶酶活和木聚糖酶酶活。其中，內切葡聚糖酶和 Beta-葡萄糖苷酶屬于纖維素酶，且通過濾紙酶活可以確定纖維素酶的存在，并且通過濾紙酶活力可以表征纖維素酶的活力水平；木聚糖酶屬于半纖維素酶，通過木聚糖酶測定可以確定半纖維素酶的活力水平。發酵培養基微晶纖維素20 50g/l，玉米漿10 40g/l，(MM)2SO4 2 6g/l， 甘油 1 3g/l, KH2PO4 2 8g/l, MgSO4 0 4g/l, CaCO3 0 5g/l, Tween80 0 4g/l, pH4 7，121°C 滅菌 20min。1、纖維素酶活測定方法(1)葡萄糖標準曲線的繪制配置10mg/ml葡萄糖母液，并稀釋成2. 0，3. 3，5. O和6. 7mg/ml的葡萄糖溶液樣品。取0. 5ml的葡萄糖溶液樣品加到Iml的0. 05M, ρΗ4· 8的檸檬酸緩沖溶液中，再加3ml 的DNS反應液，混勻，沸水浴加熱5min，冷卻至室溫。使用分光光度計測定0M40。以0M40 為縱坐標，對應葡萄糖濃度為橫坐標，繪制標準曲線。(2)木糖標準曲線的繪制配制O. OlM( = 0. 15g/100ml 緩沖液)，稀釋成 10,5,3. 33 禾口 2ymol/ml 的木糖溶液樣品，取0. 2ml加到1. 8ml的木聚糖底物溶液中，添加;3mlDNS反應液，混勻，沸水浴加熱 5min，冷卻并離心。使用分光光度計于波長MOnm下測定上清液吸光度0M40。以0D540為縱坐標，對應木糖濃度為橫坐標，繪制標準曲線。(3)BSA蛋白質標準曲線的繪制采用Bradford法測定蛋白濃度，制作BSA蛋白質標準曲線，即分別吸取10mg/ml 的BSA蛋白質標準液0、10、15、20、25、30μ 1，分別加水定容至lOOul，加入Iml Bradford 試劑，混勻，室溫靜置lOmin。以不含蛋白質的混合液為空白對照。使用分光光度計測定 0D595。測定三次求平均值。以0D595為縱坐標，對應蛋白質濃度為橫坐標，繪制標準曲線。(4)濾紙酶酶活測定試管內添加1. 0ml,0. 05M，pH4. 8檸檬酸鈉緩沖液。添加0. 5ml的稀釋酶液。加熱至50°C，添加一條濾紙條帶混合。50°C水浴反應60min，立即添加3. OmlDNS反應液混勻終止反應。沸水浴加熱5min后，轉移至冷水浴，冷卻。取0.45ml顏色反應后的混合液，加入2. Oml去離子水或蒸餾水，充分混勻。在MOnm下讀取吸光度。由標準曲線讀取樣品的葡萄
糖含量。(5)內切葡聚糖酶酶活測定添加0. 5ml的稀釋酶液至試管內。加熱至50°C，添加0. 5ml的底物溶液(用0. 05M, PH4. 8的檸檬酸緩沖液溶解，制備2%羧甲基纖維素(鈉)，取代度=0. 7)，50°C水浴反應 30min。添加3. Oml的DNS反應液，混勻。沸水浴加熱5min。轉移樣品至冷水浴，添加20ml 蒸餾水或去離子水，充分混勻。540nm處讀取樣品的吸光度。根據葡萄糖標準曲線，將測定管的樣品的吸光度轉換為葡萄糖的濃度。(6) Beta-葡萄糖苷酶酶活測定添加Iml酶液溶解于檸檬酸緩沖液中。加熱至50 °C，添加1.0ml的底物溶液 (15. OmM纖維二糖，溶解于0. 05M, pH4. 8的檸檬酸緩沖液，該反應液需要現用現配)，混勻。 50°C水浴反應30min。沸水浴加熱5. Omin，終止反應。冷卻，通過葡萄糖分析儀測定葡萄糖
的含量。(7)木聚糖酶酶活測定添加1. 8ml的底物溶液(用0. 05M，pH5. 3的檸檬酸緩沖液溶解，制備1 %木聚糖懸浮液)和添加0. 2ml的稀釋酶液至試管內。50°C水浴反應5min。添加3. Oml的DNS反應液，混勻。沸水浴加熱5min。轉移樣品至冷水浴，然后離心沉淀未反應的底物，上清液于 540nm處讀取樣品的吸光度。根據木糖標準曲線，將測定管的樣品的吸光度轉換為木糖的濃度。(8)蛋白質濃度測定使用Bradford方法測定蛋白質濃度，即將蛋白質樣品進行適當倍數的稀釋，取 100 μ 1加入Iml Bradford試劑，混勻，靜置lOmin，后使用分光光度計測定0D595。三次測定求平均值。后根據標準曲線和稀釋倍數計算出該樣品的蛋白質濃度。2、纖維素酶產生菌產酶的特性分析1、產酶曲線本發明的纖維素酶產生菌培養時間為8天，每隔24h取樣。分別測定不同培養時間下的濾紙酶酶活、Beta-葡萄糖苷酶酶活和蛋白濃度，繪制發酵過程曲線。圖3為本發明的檜狀青霉9-3(在微晶纖維素上生長)的產酶曲線(其中， 代表濾紙酶酶活，▲代表蛋白濃度，■代表Beta-葡萄糖苷酶酶活)。在下，檜狀青霉培養 3天時，此時已經具有較高的濾紙酶酶活(1. 47IU/ml)、Beta-葡萄糖苷酶酶活(12. 03IU/ ml)、蛋白濃度(1. 16mg/ml)。證明該菌的產酶周期較短，容易實現工業化生產。并且，由圖 3可以看出，檜狀青霉培養7天可達到最高產酶。2、纖維素酶產生菌產酶能力的比較將黑曲霉CGMCC 3. 316(購自于中國普通微生物菌種保藏中心)，里氏木霉RUT C-30 (CICC13052,購自中國工業微生物菌種保藏中心)和檜狀青霉9_3接種于微晶纖維素酶發酵培養基，培養溫度為25 30°C，搖床轉速為150 250轉/分進行震蕩培養，取發酵 5天時培養液，分別測定濾紙酶活、β -葡萄糖苷酶酶活、內切葡聚糖酶酶活、木聚糖酶活力以及蛋白濃度。表1檜狀青霉9-3與黑曲霉CGMCC 3. 316和里氏木霉RUT C-30的產酶能力比較
權利要求
1.一種纖維素酶產生菌，其特征在于，纖維素酶產生菌的分類命名為檜狀青霉 (Penicillium piceum)，菌株的18S rDNA基因序列如SEQ ID NOl所述，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏日期2011年10月9日，保藏號CGMCC5314。
2.如權利要求1所述的纖維素酶產生菌的應用，其特征在于，所述纖維素酶產生菌應用于生產纖維素酶和半纖維素酶。
全文摘要
本發明公開了一種纖維素酶產生菌，纖維素酶產生菌的分類命名為檜狀青霉(Penicillium piceum)，菌株的18S rDNA基因序列如SEQ ID NO1所述，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏日期2011年10月9日，保藏號CGMCC5314。本發明所述的纖維素酶產生菌具有較好的纖維素酶和半纖維素酶的產酶能力，尤其是對Beta-葡萄糖苷酶具有良好的生產能力。本發明的纖維素酶產生菌以及所生產的纖維素酶和半纖維素酶在生物燃料、醫藥、日用化工、食品發酵等多個行業具有廣泛的應用前景。
文檔編號C12R1/80GK102533563SQ20111035166
公開日2012年7月4日 申請日期2011年11月8日 優先權日2011年11月8日
發明者武改紅, 蔡鵬麗, 賈文娣, 陳樹林, 馬延和 申請人:中國科學院微生物研究所, 天津工業生物技術研究所