專利名稱：建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達載體及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物基因工程領域，具體涉及一種高效表達建鯉促性腺激素(&1RH) 的原核表達載體及其在&iRH蛋白的原核表達和制備抗&iRH多克隆抗體中的應用。
背景技術：
促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone, GnRH)前體蛋白由信號肽、GnRH十肽(decap印tide)、促性腺激素釋放激素相關肽(GnRHassociated peptide, GAP)構成，經酶切加工后釋放出有活性的&iRH十肽。&iRH在調節脊椎動物的生殖發育中起著非常重要的作用，是下丘腦-垂體性腺(hypothalamic-pituitary-gonadal，HPG)軸的關鍵信息分子，通過刺激垂體前葉釋放促性腺激素(Gonadotropin，GtH)，在脊椎動物的性腺發育、繁殖功能的維持中起著重要的作用。關于&iRH的免疫原理，目前還沒有確切說法。Meloen和Ook等文章中有所論述，認為是血液中的&iRH抗體特異性地中和了動物體內的&iRH，導致體內&iRH生物活性部分或完全喪失，引起內分泌系統平衡的改變，從而改變了 HPG軸系，減少或杜絕精子(或卵子)的生成與成熟及激素的合成與釋放。臨床上用免疫接種技術控制&iRH的釋放量來控制哺乳動物的性腺發育已經取得了成功，并表現出誘人的前景。Andersen與Riley等研究了抗虹鱒GnRH的免疫接種，提出了一種有望控制魚類性成熟的方法，認為免疫抑制技術在控制虹鱒生殖方面有一定的應用潛力。建鯉、Cyprinus carpiovar Jian)是鯉亞科鯉屬的一種。為長體型，比野鯉背高、 體寬，但比常見的雜交鯉體長，具有生長速度快、適合多種養殖方式飼養、抗病力強等優點。建鯉是以特定的荷包紅鯉和沅江鯉為親本，經6代定向自繁自育而形成的良種，因此對性腺發育具有調節作用的&iRH研究具有一定的生產意義。人源&iRH已經通過基因工程手段獲得了體外表達并在動物實驗中獲得了較好的免疫原性。高效表達&iRH基因的重組載體的制備可以高效獲取重組蛋白可以滿足其在魚類人工繁殖中的運用，同時制備的抗體在現有研究中還未見有報道。

發明內容
本發明的目的是提供一種&iRH六聚體的原核表達載體pMAL-GnRH，該載體含有T7啟動子和終止子、細菌核糖體結合位點RBS和六聚體&iRH基因、GAP基因及一個麥芽糖結合蛋白標簽，利用該載體轉化大腸桿菌，可實現&iRH蛋白的高水平表達，表達的重組蛋白質以可溶性形式存在于上清中(占大腸桿菌可溶性總蛋白45. 2%%)，通過親和層析純化很容易獲得高純度的重組蛋白質，用于蛋白質的制備。純化&iRH蛋白的操作相當簡單，成本也不高，極易重復使用。為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案
建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達載體，其特征在于所述的原核表達載體由表達載體pMAL-c^^Q建而得，該載體含有T7啟動子和終止子、細菌核糖體結合位點PBS、 6個串聯多聚體&iRH基因序列與一個GAP基因序列、及一個麥芽糖結合蛋白標簽序列。進一步說明所述的建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達載體，其特征在于所述6個串聯多聚體&1RH基因的上游依次連接有麥芽糖結合蛋白標簽序列、起始密碼子、T7啟動子ATG、細菌核糖體結合位點RBS、T7啟動子；6個串聯多聚體&iRH基因的下游依次連接有GAP基因序列、可被IPTG誘導的操作子序列、終止子。所述的建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達載體的構建方法，其特征在于由下述方法構建而得
(1)從GeneBank中查找建鯉GnRH的全長基因序列，并采用I^rimerS.0設計了一對特異性引物
上游引物 1 5' -ACTGAGGGAAACTTGGACTGAT-3 ‘ 下游引物 2 5，-CAAGGCAGAAATAGAAAGGAAG-3 ‘ 反轉錄隨機引物AP;
以提取自建鯉的丘腦總RNA為模板，進行反轉錄合成第一鏈cDNA，以反轉錄產物為模板及上述的上下游引物進行PCR擴增，反應條件為94°C預變性:3min，94°C預變性30s， 55°C退火 45s，72°C延伸 lmin，30 個循環，72°C延伸 7min ；
(2)PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后用凝膠回收試劑盒回收，將回收產物與 PMD18-T載體，16°C連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌JM109，隨機挑取細菌，提取質粒后用I、Λ /7 /ΙΙΙ雙酶切初步鑒定后，將陽性克隆進行DNA測序，測序結果用生物軟件 DNAstar、CLUSTAL X 等進行分析；
(3)合成六聚體&iRH基因并與GAP基因相連接，并在其兩端加上I,Hindlll酶切位點，將其和原核表達質粒PMAL-C2X分別用I ,Hindlll 37°C雙酶切，用凝膠回收試劑盒回收&1RH/GAP片段和線性化pMAL質粒，按照T4 DNA連接酶的說明書設計連接反應體系，構建表達質粒pMAL-GnRH/GAP，并轉化大腸桿菌JM109，篩選陽性克隆，隨機挑取1_2 個克隆進行酶切鑒定，獲得建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達載體PMAL-GnRH/ GAP。建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達載體在制備重組&1RH蛋白中的應用。建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達載體在制備&1RH抗體的抗原中的應用。建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達載體制備&1RH重組蛋白的方法， 將pMAL-GnRH/GAP轉化大腸桿菌TB1，挑取陽性克隆接種含50 μ g/mL的氨芐青霉素的LB 液體培養基中，37°C搖振培養過夜，取培養菌液以1/10的比例接種于新鮮的LB液體培養基(含氨芐青霉素)中，分別以0. 5、lmol/L濃度的IPTG誘導，37°C搖振培養4h后， 收集菌體，加入溶菌酶至終濃度為lmg/mL，冰浴30min ；最后加入DNA酶和RNA酶至終濃度為5μ g/mL，4°C孵育10 min,9000g離心30 min,將上清轉移備用，上清即為表達的融合蛋白；將上清蛋白質上樣于平衡緩沖液平衡好的Amylose-sepharose親和柱中其中所述平衡緩沖液為 20mmol/L Tris-HCL, 200mmol/LNaCl, lmmol/LEDTA, pH7 · 4，用緩沖液平衡至基線后，開始用洗脫緩沖液，所述的洗脫緩沖液為平衡緩沖液+lOmmol/L麥芽糖中洗脫，洗脫液中即為純化后的融合蛋白，最后SDS-PAGE電泳檢測。在純化好的蛋白中加入 Factor Xa至終濃度為200 μ g/mL，室溫作用4h，同上過Amylose- sepharose親和柱，用平衡緩沖液洗脫下的即為&iRH重組蛋白。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果1、構建的建鯉六聚體&1RH基因的原核表達載體能高效的表達目的蛋白，并滿足相關實驗的需要。2、用重組蛋白免疫小鼠制備的多克隆抗血清具有較高的效價，該抗體能特異性的與建鯉&iRH蛋白反應，具有較高的效價，特異性也較好。3、本發明中&iRH蛋白高效價抗體的成功制備表明6聚體&iRH具有較強的免疫原性，能夠刺激機體產生免疫應答，為&iRH調控魚類性生殖的研究提供了一個新的方法。


圖IGnRH基因的TA克隆策略； 圖2&iRH原核表達載體的構建策略；
圖 3 建鯉 GnRH 基因的檢測，M: DNAmarker ； 1: Product of RT-PCR ； 圖4重組質粒pMD18-T-GnRH的限制性酶切分析M:DNA分子量標記1 :pMD18-T_GnRH 經EcoRI和Hind III雙酶切；
圖5鑒定大腸桿菌中&1RH/GAP融合蛋白的SDS-PAGE分析M:蛋白質分子量標記；1 TBl/pMAL-GnRH/GAP 分別經 0. 3M IPTG 誘導 4h 后表達的 MBP-GnRH/GAP 蛋白；2 TBl/pMAL 分別經0. 3M IPTG誘導4h后產生的MBP蛋白；3: E. coli TBI。
具體實施例方式
儀器與設備
試劑主要為分子生物學試劑，TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、AMV反轉錄試劑盒、凝膠回收試劑盒、I ,Hind III,大腸桿菌JM109，pMD18_T載體，反轉錄隨機引物AP ；
原核表達質粒pMAL-ch為大連寶生物公司產品，聚丙烯酰胺、RNase抑制劑等購自上海生工生物工程公司，Factor Xa、Amylose-s印harose柱、抗麥芽糖結合蛋白(MBP)單抗均購自紐英倫生物技術(北京)公司，其他生化試劑均為國產分析純。弗氏完全、不完全佐劑，ELISA反應板等均購自上海申能博彩生物有限公司。儀器PCR儀購自BioRad公司，實驗結果記錄和蛋白分析使用的是柯達公司的凝膠成像系統，DNA序列分析使用DNAstar軟件，全自動測序工作由上海生工生物工程公司完成。酶標測定儀購自TECAN公司。所有引物和DNA序列均在上海生工合成。本發明實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例1 :GnRH基因的擴增與TA克隆
GnRH基因的擴增及TA克隆的策略如圖1所示，首先從GenBanK中查找&iRH的全長基因序列(GenBanK號AY148223)，采用ft~imer5. O設計了一對特異性引物 引物 1 5，-ACTGAGGGAAACTTGGACTGAT-3 ‘，見 kqNO. 2 ； 引物 2 5，-CAAGGCAGAAATAGAAAGGAAG-3 ‘，見 kqNO. 3 ；
采用RNA抽提試劑盒提取建鯉(取自淡水漁業研究中心實驗魚場)丘腦總RNA進行純度鑒定后合成第一鏈cDNA，以反轉錄產物為模板及合成的上下游引物進行PCR擴增，反應條件為94°C預變性3 min，94°C預變性30s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，30個循環，72°C延伸5 min0 PCR產物的克隆與鑒定PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后用凝膠回收試劑盒回收，將回收產物與PMD18-T載體連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌JM109，隨機挑取細菌，提取質粒后用&oR I、歷^i/III雙酶切初步鑒定后，將陽性克隆送交上海生工進行DNA測序。測序結果用DNAstar、CLUSTAL X等軟件進行分析。實驗結果表明擴增到了預期大小即約400bp的目的cDNA片段見kqNO. 1 (圖3)，將其進行BLAST檢索，進行同源性比對，結果表明其同源性為97.6%。實施例2 原核表達載體PMAL-GnRH的構建
在獲得正確的&iRH序列后到生物公司合成串聯六聚體&iRH與GAP序列，將其和原核表達質粒pMAL-ch分別用I ,Hind III 37°C雙酶切，用凝膠回收試劑盒回收GnRH片段(包含串聯六聚體&iRH與GAP序列)和線性化pMAL質粒，按照T4 DNA連接酶的說明書設計連接反應體系，構建表達質粒pMAL- GnRH (圖2)，并轉化大腸桿菌JM109，篩選陽性克隆，隨機挑取10個克隆提取質粒，提取的質粒經I和歷‘/^ III雙酶切鑒定，酶切結果表明pMAL-GnRH酶切后有一條約400 bp的條帶(圖4)，說明GnRH/GAP成功克隆入T 載體中，將重組質粒PMAL-GnRH送測序公司測序，測序結果表明成功的將&iRH cDNA克隆到表達載體中。實施例3 重組GnRH蛋白的表達與鑒定
將pMAL-GnRH轉化大腸桿菌TB1，挑取陽性克隆接種含50 μ g/mL的氨芐青霉素的LB 液體培養基中，37°C搖振培養過夜，取培養菌液以1/10的比例接種于新鮮的含氨芐青霉素的LB液體培養基中，分別以0. 5、1 mol/L濃度的IPTG誘導，37°C搖振培養4h后，收集菌體，重懸于100 μ L SDS-PAGE上樣緩沖液中，離心后加上樣緩沖液煮沸破碎細胞，參照《分子克隆》及試劑手冊進行1 濃度的SDS-PAGE電泳(圖5)鑒定蛋白的表達量。由圖 5可知，加入IPTG誘導后，轉入載體pMAL的細菌總蛋白提取物中出現了分子量約為42kD 的蛋白條帶(圖5泳道2中)，而轉入重組質粒的細菌總蛋白提取物中出現了新的蛋白質， 分子量約為55. 5kD (圖5泳道1中)。由于pMAL表達質粒本身可編碼42. 5kD的麥芽糖結合蛋白(Maltosebinding protein, MBP),而GnRH及相關肽分子量約為13. 5 kD,理論上融合蛋白的分子量約*^.5kD。這與預期結果相一致，重組表達載體經IPTG誘導后，融合蛋白得到表達，而大腸桿菌TBl沒有相應的蛋白表達。目的蛋白表達量經軟件分析，約達到了細菌表達蛋白總量的45.2%。以抗MBP蛋白的抗血清進行的Western blot試驗表明在大小為55. 5kD和42kD可見兩條清楚的蛋白條帶。實施例4 重組&iRH蛋白的大量表達與純化
取過夜培養的10 mL細菌于IL LB (含葡萄糖)中，37°C搖振培養3h，加入IPTG至終濃度為0. 5mmol/L再繼續培養濁，4000g離心20min收集菌體，重懸于50mL柱緩沖液中。 加入溶菌酶至終濃度為lmg/mL，冰浴30min。最后加入DNA酶和RNA酶至終濃度為5 μ g/ mL, 4°C孵育10 min。9000g離心30min，將上清轉移備用，上清即為表達的融合蛋白。將上清蛋白質上樣于平衡緩沖液 OOmmol/LTris-HCL, 200mmol/LNaCl, lmmol/LEDTA, ρΗ7 ·4) 平衡好的Amylose-sepharose親和柱中，用緩沖液平衡至基線后，開始用洗脫緩沖液(平衡緩沖液+lOmmol/L麥芽糖中)洗脫，洗脫液中即為純化后的融合蛋白，最后SDS-PAGE 電泳檢測。在純化好的蛋白中加入factor )(a至終濃度為200 μ g/mL，室溫作用4h，同上過Amylose-s印harose親和柱，用平衡緩沖液洗脫下的即為GnRH蛋白。同樣作SDS-PAGE電泳檢測。檢測結果表明純化蛋白為單一條帶，分子量為55. 5kD左右，相對于未融合蛋白MBP的分子量明顯偏大。取純化好的蛋白經lector X酶切4h后，經SDS-PAGE電泳檢測，目的蛋白為兩個條帶即分子量為42kD的為MBP，分子量為13.5kD的&iRH蛋白。再經 Amylose sepharose過柱后，得到純化的GnRH蛋白。實施例5:對ICR小鼠免疫原性試驗結果
(1)疫苗準備與免疫程序取重組菌37°C培養、純化后，與完全弗氏佐劑以1: 1的比例混合均勻，免疫15只小鼠，每只小鼠腹腔注射SOyg純化蛋白進行免疫，初免后小鼠每間隔2周以與初免相同的劑量加強免疫4次。每次免疫后1周尾靜脈采血，制備血清。 同時以生理鹽水腹腔注射10只小鼠為空白對照。最后大量取血制備抗血清。(2)間接ELISA檢測GnRH血清抗體通過間接ELISA方法測定GnRH特異的血清抗體效價=ELISA按常規方法進行。將純化的重組蛋白4°C過夜包被，PBST (含0. 02% Tween-20的PBS)洗滌3次后，用含10%FCS的PBS加滿各孔4°C封閉Mh，PBST洗滌3次。 樣品血清作倍比稀釋(IOOyL/孔)，同時設立陰性對照(1 :100稀釋的免疫前小鼠血清) 和空白對照(PBS)，37°C水浴孵育2h，PBST洗滌3次，每孔加入100 μ L 1 25000稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG酶標二抗，37°C水浴孵育2h，PBST洗滌3次，每孔加入100 μ L OPD 底物進行，測定0D490值，以Ρ/Ν (待檢樣品0D490/陰性樣品0D490)彡2. 1判為陽性。(3)初免1周后，免疫組小鼠的血清中就能檢測到重組蛋白誘導產生的特異抗體，在加強免疫后第6周抗體滴度為1.763士0.015，達到峰值，而空白對照組不能產生特異抗體，且免疫組與空白組抗體效價值差異顯著(Ρ<0.05)。通過上述的實驗，本發明達到了如下的結果利用本發明的原核表達栽體 pMAL-GnRH。該載體是含有建鯉促性腺激素釋放激素的原核表達載體。本發明采用RT-PCR 方法從丘腦中擴增出長約400bp的目的序列&iRH基因，克隆至T載體中，經酶切鑒定和序列測定分析確認序列的正確性后以此片段為模板人工合成六聚體&iRH及GAP，并克隆到表達載體pMAL-c2x中構建重組表達質粒pMAL-GnRH，并在大腸桿菌TBI中獲得了高表達，目的蛋白約占菌體總蛋白的45.2%。菌體經溶菌酶裂解，制備無細胞抽提液，Amylose-s印harose柱層析后得到分子量為55.5kD單一條帶的目的蛋白。目的蛋白經!^actoriCa酶切裂解，Amylose-s印harose過柱純化后得到純化的GnRH前體蛋白。以 80 μ g/只的劑量4次免疫ICR小鼠，免疫小鼠可以檢測到特異性針對&iRH前體蛋白的血清抗體應答，免疫組抗體水平顯著高于空白組(p<0.(^)，且加強免疫第6周后抗體效價為 1.763士0.015，達到高峰值，說明表達產物具有免疫原性，可以刺激機體產生免疫應答。
權利要求
1.建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達載體，其特征在于所述的原核表達載體由表達載體PMAL-Wx構建而得，該載體含有T7啟動子和終止子、細菌核糖體結合位點 PBS、6個串聯多聚體&iRH基因序列與一個GAP基因序列、及一個麥芽糖結合蛋白標簽序列。
2.如權利要求1所述的建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達載體，其特征在于所述6個串聯多聚體&iRH基因的上游依次連接有麥芽糖結合蛋白標簽序列、起始密碼子、T7啟動子ATG、細菌核糖體結合位點RBS、T7啟動子；6個串聯多聚體&iRH基因的下游依次連接有GAP基因序列、可被IPTG誘導的操作子序列、終止子。
3.如權利要求1所述的建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達載體的構建方法，其特征在于由下述方法構建而得(1)從GeneBank中查找建鯉GnRH的全長基因序列，并采用ft~imer5.0設計了一對特異性引物上游引物 1 5' -ACTGAGGGAAACTTGGACTGAT-3‘下游引物引物 2 5' -CAAGGCAGAAATAGAAAGGAAG-3 ‘以提取自建鯉的丘腦總RNA為模板，進行反轉錄合成第一鏈cDNA，以反轉錄產物為模板及上述的上下游引物進行PCR擴增，反應條件為94°C預變性:3min，94°C預變性30s， 55°C退火 45s，72°C延伸 lmin，30 個循環，72°C延伸 7min ；(2)PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后用凝膠回收試劑盒回收，將回收產物與 PMD18-T載體，16°C連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌JM109，隨機挑取細菌，提取質粒后用I、Λ /7 /ΙΙΙ雙酶切初步鑒定后，將陽性克隆進行DNA測序，測序結果用生物軟件 DNAstar、CLUSTAL X 等進行分析；(3)合成六聚體&iRH基因并與GAP基因相連接，并在其兩端加上I,Hindlll酶切位點，將其和原核表達質粒PMAL-C2X分別用I ,Hindlll 37°C雙酶切，用凝膠回收試劑盒回收&1RH/GAP片段和線性化pMAL質粒，按照T4 DNA連接酶的說明書設計連接反應體系，構建表達質粒pMAL-GnRH/GAP，并轉化大腸桿菌JM109，篩選陽性克隆，隨機挑取1_2 個克隆進行酶切鑒定，獲得建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達載體PMAL-GnRH/ GAP。
4.建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達載體在制備重組&iRH蛋白中的應用。
5.建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達載體在制備&iRH抗體的抗原中的應用。
6.根據權利要求4建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達載體制備&iRH重組蛋白的方法，將pMAL-GnRH/GAP轉化大腸桿菌TB1，挑取陽性克隆接種含50 μ g/mL的氨芐青霉素的LB液體培養基中，37°C搖振培養過夜，取培養菌液以1/10的比例接種于新鮮的 LB液體培養基(含氨芐青霉素)中，分別以0.5、lmol/L濃度的IPTG誘導，37°C搖振培養4h后，收集菌體，加入溶菌酶至終濃度為lmg/mL，冰浴30min ；最后加入DNA酶和RNA 酶至終濃度為5μ g/mL，4°C孵育10 min，9000g離心30 min,將上清轉移備用，上清即為表達的融合蛋白；將上清蛋白質上樣于平衡緩沖液平衡好的Amylose-s印harose親和柱中其中所述平衡緩沖液為 20mmol/LTris-HCL, 200mmol/LNaCl, lmmol/LEDTA, ρΗ7 ·4,用緩沖液平衡至基線后，開始用洗脫緩沖液，所述的洗脫緩沖液為平衡緩沖液+lOmmol/L麥芽糖中洗脫，洗脫液中即為純化后的融合蛋白，最后SDS-PAGE電泳檢測；在純化好的蛋白中加入Factor Xa至終濃度為200 μ g/mL,室溫作用4h，同上過Amylose- s印harose親和柱，用平衡緩沖液洗脫下的即為&iRH重組蛋白。
全文摘要
本發明公開了一種高效表達多聚體促性腺激素釋放激素的原核表達載體pMAL-GnRH。本發明采用RT-PCR方法從建鯉丘腦中擴增出長約400bp的目的序列GnRH基因，克隆至T載體中，經酶切鑒定和序列測定分析確認序列的正確性后通過人工合成GnRH串聯六聚體并與GAP蛋白偶聯后將此片段克隆到表達載體pMAL-c2x中構建重組表達質粒pMAL-GnRH；表達產物具有免疫原性，可以刺激機體產生免疫應答。
文檔編號C12N15/66GK102382854SQ20111035341
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月10日 優先權日2011年11月10日
發明者丁煒東, 曹麗萍, 曹哲明, 邴旭文 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業研究中心