青蝦性腺抑制激素基因、加速卵巢發育的試劑盒及方法
【專利摘要】本發明涉及一種青蝦性腺抑制激素基因、力口速卵巢發育的試劑盒及方法，屬于發育調控領域。該方法步驟如下：1.根據NCBI上公布的青蝦GIH基因序列的開放閱讀框設計RNA干擾的引物；2.提取青蝦總RNA并反轉為cDNA，通過上述引物進行PCR擴增及純化；3.將上述純化產物進行體外轉錄合成dsRNA；4.將dsRNA注射到雌性青蝦的圍心腔后，可以顯著加速青蝦卵巢發育。本發明為培育發育快、生長好的青蝦優良品種提供新的思路和有效手段。
【專利說明】青蝦性腺抑制激素基因、加速卵巢發育的試劑盒及方法
[0001]

【技術領域】
[0002] 本發明涉及一種青蝦性腺抑制激素基因、加速卵巢發育的試劑盒及方法，屬于發 育調控領域。
[0003]

【背景技術】
[0004] 青奸，學名日本沼奸，俗稱河奸，隸屬十足目 (Decapoda)、長臂奸科（Palaemonidae)、沼奸屬（Macrobrachium),廣泛分布于我國各地水 域，生長快、適應性強、養殖經濟效益高，是我國重要的淡水養殖蝦類。據2012年《中國漁業 年鑒》記載，全國養殖青蝦年產量超過23萬噸，年產值超過150億元，青蝦養殖已在我國水 產養殖中發揮了舉足輕重的作用。近年來，隨著規模化養殖的不斷擴大和消費需求的不斷 提高，培育出發育快、生長好的性狀更加優良的新品種是當前青蝦遺傳育種的關鍵。
[0005] 性腺抑制激素（gonad-inhibting hormone, GIH)，又稱為卵黃發生抑制激素 (vitellogensis inhibiting bormone，VIH)，是甲殼動物眼柄中合成分泌的甲殼動物高血 糖激素 （crustacean hyperglycemic hormone,CHH)家族中一種重要的神經肽，具有調控甲 殼動物生殖、發育活動的作用。有多項生理學及遺傳學研究發現，性腺抑制激素能夠抑制性 腺的發育，是甲殼動物生殖發育調控中一種重要激素。
[0006] RNAi (RNA interference, RNAi)技術是一種由雙鏈RNA誘發的基因沉默技術。 在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的mRNA被降解，從而抑制了該基因的表達。RNAi被認 為是在基因功能研究中最有效的方法之一，已成為甲殼動物重要基因的功能的研究等很多 領域中的重要工具。
[0007]


【發明內容】

[0008] 本發明的目的在于提供一種青蝦性腺抑制激素基因、加速卵巢發育的試劑盒及方 法。利用本發明提供的方法可以有效的加速青蝦卵巢的發育，為培育發育快、生長好的青蝦 優良品種提供新的思路和有效手段。
[0009] 青蝦性腺抑制激素基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
[0010] 由上述的青蝦性腺抑制激素基因所合成的dsRNA。
[0011] 一種利用RNA干擾技術加速青蝦卵巢發育的試劑盒，包括有如SEQ ID NO. 1?2 所示的上、下游引物。
[0012] 上述的試劑盒中還包括有體外轉錄合成dsRNA試劑盒。
[0013] 一種非治療目的的利用RNA干擾技術加速青蝦卵巢發育的方法，包括如下步驟： 第1步、提取青蝦的RNA，反轉錄為cDNA，通過SEQ ID NO. 1?2所示的上、下游引物對cDNA 進行PCR擴增，得到擴增產物；第2步、將擴增產物轉錄合成dsRNA ;第3步、將dsRNA注射 至青奸體內。
[0014] 第2步中PCR反應程序如下：94°C總變性3 min ;30個循環：94 °C變性30 s， 55°C 退火 30 s，72°C 延伸 2 min，72 °C總延伸 10 min。
[0015] 第3步的注射劑量是4 μ g/g。
[0016] 有益效果 采用本發明的方法可以顯著加速卵巢發育，且卵巢發育周期比對照組明顯縮短；本發 明為培育發育快、生長好的青蝦優良品種提供新的思路和有效手段。
[0017]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1.處于卵巢發育I期的雌性青蝦注射不同濃度的（0. 4μ g/μ 1和4μ g/μ 1) dsRNA-Ι注射蒸餾水后測量得到的性腺發育指數的對比示意圖。
[0019] 圖2.處于卵巢發育I期的雌性青蝦注射不同濃度的（0. 4μ g/μ 1和4μ g/μ 1) dsRNA-Π 和注射蒸餾水后測量得到的性腺發育指數的對比示意圖。
[0020] ld，5d, 9d, 13d, 15d分別為注射后1天，5天，9天，13天和15天（N = 3)不同 字母代表差異顯著（P〈 0.05)，圖中的a、b、c、d用于標識對照組和試驗組之間差異的顯著 性，當顯示為相同字母時代表差異不顯著（P > 0.05)。對照組注射相同劑量的蒸餾水。
[0021]

【具體實施方式】
[0022] 下面通過【具體實施方式】對本發明作進一步詳細說明。但本領域技術人員將會理 解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技 術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件（例如參考J.薩姆布魯克等著，黃 培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社）或者按照產品說明書進行。所用試 劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
[0023] 實施例1青蝦GIH基因的dsRNA的獲得 1.青奸總cDNA的獲得 選取成熟雌性青蝦4只，解剖并獲得卵巢，迅速置于液氮中速凍，并放于-80°C冰箱中 保存待用。
[0024] RNA提取，具體操作步驟參照Takara Trizol試劑盒。
[0025] 參照Takara M-MLV反轉錄試劑盒進行第一鏈cDNA的合成。
[0026] 2.青蝦GIH基因 dsRNA弓丨物的設計 在NCBI上搜索GIH序列，獲得青蝦GIH基因 （Accession No. HQ724326)。采用NCBI 在線序列分析軟件（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html)確定 GIH 基因的開 放閱讀框位置為206-521bp。根據上述結果，采用NCBI在線dsRNA引物設計軟件（http:// www. f lyrnai. org/cgi_bin/RNAi_find_primers· pi )，在青奸 GIH 開放閱讀框內設計 dsRNA 引物，并在其前面添加 T7啟動子序列5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，組成dsRNA合成引物， 其引物序列分別為：確定引物組I :上游引物SEQ ID NO. 1和下游引物SEQ ID NO. 2;引物 組II:上游引物SEQ ID NO. 3和下游引物SEQ ID NO. 4;引物組III:上游引物SEQ ID NO. 5 和下游引物SEQ ID NO. 6。所有引物均在鉬尚生物技術(上海）有限公司合成。
[0027] 引物組序列如下： SEQ ID NO. 1 TAATACGACTCACTATAGGGTCTCAACAAAGCTTTCACGC SEQ ID NO. 2 TAATACGACTCACTATAGGGACTTGCGTCCGACTCGTATT SEQ ID NO. 3 TAATACGACTCACTATAGGGGATAACCATGGCTGTGTTCG SEQ ID NO. 4 TAATACGACTCACTATAGGGGTCGACCATGTCTTGGGAGT SEQ ID NO. 5 TAATACGACTCACTATAGGGCCTTCCGAGTCTTTGTCGAAAA SEQ ID NO. 6 TAATACGACTCACTATAGGGCGACTCGTATTATGCTCATCGC 3.青蝦GIH基因dsRNA的合成 采用上述青蝦引物組I、Π和III在青蝦總cDNA上進行PCR擴增，獲得PCR產物。
[0028] PCR反應程序如下： 94°C總變性3 min, 30個循環：94 °C變性30 s，55°C退火30 s，72°C延伸2 min, 72 °C總延伸 10 min. PCR擴增反應體系如下： cDNA 模板 1μ1，10μΜ 引物各 1μ1，5υ/μ1 Taq 酶 0.2yl，10XTaq 酶 Buffer 2.5 μ 1，2· 5 mM dNTP 4μ L，25mM MgCl2 2μ 1，補 CldH2O 至總體積 25μ 1。
[0029] 引物組I產物條帶清晰唯一，引物組II產物模糊且暗淡，引物組III無產物條帶。 對引物組I和II產物進行純化并測序，分別獲得SEQ ID NO. 7和序列SEQ ID NO. 8. 測序結果如下： SEQ ID NO: 7 TTCAGAAATTAACATATGTTGCGATAACCATGGCTGTGTTCGGAATACTACTAGTGGATCAGACTTCGGCCC GGTTTTTGGACGACGAGTGTCGAGGAGTCATGGGAAATCGTGACTTGTACGAATACGTCGTCAGGATATGCGACGAC TGCGAAAACATATTCAGGAAAAGCAACGTTGGACCCAAATGCAAGAAAAACTGCTTCTACAACATGGACTTCATGTG GTGCGTCCATGCCACTGAGCGAACCGACGAGCTGGAACATCTGAACCGAGCGATGAGCAT SEQ ID NO: 8 GATAACCATGGCTGTGTTCGGAATACTACTAGTGGATCAGACTTCGGCCCGGTTTTTGGACGACGAGTGTCG AGGAGTCATGGGAAATCGTGACTTGTACGAATACGTCGTCAGGATATGCGACGACTGCGAAAACATATTCAGGAAAA GCAACGTTGGACCCAAATGCAAGAAAAACTGCTTCTACAACATGGACTTCATGTGGTGCGTCCATGCCACTGAGCGA ACCGACGAGCTGGAACATCTGAACCGAGCGATGAGCATAATACGAGTCGGACGCAAGTGAGAATCGCCCAAAACTTC AGCCATCGAGAGACACACTACCGCCCCCGCCACCGCCGCTACGACTAATGCCTCACCCAACTCCCAAGACATGGTCG AC 引物組I和II產物經過生工生物工程(上海）股份有限公司的SanPr印柱式PCR 產物純化試劑盒純化后，按照 Transcript AidTM T7 High Yield Transcription kit (Fermentas, Inc.，USA)試劑盒說明進行體外轉錄合成dsRNA，兩組PCR擴增產物制備得 到的 dsRNA 分別命名為 dsRNA-I、dsRNA_II。dsRNA 濃度米用 BioPhotometer (Eppendorf, Hamburg, Germany)在260 nm進行測定，并至終濃度分別為0. 4 μ g/ μ 1和4 μ g/ μ 1。
[0030] 實施例2注射青蝦GIH基因的dsRNA對青蝦卵巢發育的影響 1.試驗用蝦的選擇 根據青蝦生物學研究結果及卵巢發育不同階段顏色變化，將青蝦卵巢發育分為5個時 期。分別是：ι期(卵原細胞增殖期，透明Hi期(初級卵黃發生期，黃色HII期(次級卵黃發 生期，草綠色）IV期(成熟期，墨綠色）和V期(消退期，灰色)。為達到卵巢發育同步觀察的 研究目的，本研究統一采用卵巢處于I期、體重在1. 26?2. 85g之間的雌性青蝦200只，平 均分成5組。5組均飼養于相同的戶外大塘的網箱內，同池飼養(實時水溫28°C ±1°C)，塘 內輔以充氧設備，每天早晚各投喂1次蝦用混合飼料。
[0031] 2.青蝦GIH基因的dsRNA的注射和檢測 根據每克體重注射1μ I dsRNA的劑量(即4 μ g/g和0.4 μ g/g)，以內徑為1.2mm的毛 細管尖端拉細作為注射針，將dsRNA溶液從青蝦頭胸甲基部注入圍心腔內，對照組注射蒸 餾水。共分為：dsRNA-1-O. 4 注射組，dsRNA-I-4 注射組，dsRNA-11-O. 4 注射組，dsRNA-II-4 注射組和蒸餾水注射組(對照組).采樣分別于注射后第1天、第5天、第9天、第13天和第 15天，每個采樣點設計3個生物重復，采集卵巢迅速置于液氮中速凍，并放于-80°C冰箱中 保存待用。采樣前記錄每只蝦的體重和性腺重(均為濕重)。
[0032] 3.青蝦GIH基因 dsRNA對卵巢發育的影響 性腺指數是評價動物性腺發育狀況的重要指標。根據性腺發育指數（Gonad Somatic Index, GSI)計算雌性青奸的GSI。計算公式GSI=性腺濕重/體重濕重X 100%。
[0033] 4.結果分析 如圖1所示，在注射后第5天開始，dsRNA-1-O. 4組和對照組的GSI無顯著差異。 dsRNA-I-4組和對照組的GSI出現顯著差異，處理組的卵巢發育顯著快于對照組。在第9天 時處理組的GSI約為對照組的2倍。在第13天時dsRNA-I-4組和對照組的GSI仍有顯著 差異。第15天時，dsRNA-I-4組青蝦已排空卵巢，進入消退期，卵巢已完成一輪發育周期， 且有71. 4% (10/14)的雌蝦抱卵，而對照組仍處于發育成熟期。而dsRNA-Π 的兩組處理組 和對照組的GSI均沒有顯著差異。
[0034] 由以上結果可知，與對照組相比，以每克體重注射4 μ g的dsRNA的劑量，一次注射 青蝦GIH基因的dsRNA-Ι后，青蝦卵巢發育的速度顯著加快。該干擾作用能持續約13天， 在第5天時干擾效果達到最大，在13天后已沒有干擾效果。本實驗研究采用直接注射合成 的dsRNA，與以往研究將合成的dsRNA轉化到大腸桿菌中增殖再抽提純化獲得干擾物相比， 更加便捷，一樣能夠達到顯著的干擾效果。本實驗研究結果表明，本發明提供一種利用RNA 干擾技術加速青蝦卵巢發育的方法可以有效的加速青蝦卵巢的發育，為培育青蝦性狀優良 品種提供新的思路和有效手段。
【權利要求】
1. 青蝦性腺抑制激素基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
2. 由權利要求1所述的青蝦性腺抑制激素基因所合成的dsRNA。
3. -種利用RNA干擾技術加速青蝦卵巢發育的試劑盒，其特征在于：包括有如SEQ ID NO. 1?2所示的上、下游引物。
4. 根據權利要求3所述的利用RNA干擾技術加速青蝦卵巢發育的試劑盒，其特征在于： 還包括有體外轉錄合成dsRNA試劑盒。
5. -種非治療目的的利用RNA干擾技術加速青蝦卵巢發育的方法，其特征在于，包括 如下步驟：第1步、提取青蝦的RNA，反轉錄為cDNA，通過SEQ ID NO. 1?2所示的上、下游 引物對cDNA進行PCR擴增，得到擴增產物；第2步、將擴增產物轉錄合成dsRNA ;第3步、將 dsRNA注射至青蝦體內。
6. 根據權利要求5所述的非治療目的的利用RNA干擾技術加速青蝦卵巢發育的方法， 其特征在于：第2步中PCR反應程序如下：94°C總變性3 min ;30個循環：94 °C變性30 s, 55°C 退火 30 s，72°C 延伸 2 min，72 °C總延伸 10 min。
7. 根據權利要求5所述的非治療目的的利用RNA干擾技術加速青蝦卵巢發育的方法， 其特征在于：第3步的注射劑量是4 μ g/g。
【文檔編號】C12Q1/68GK104212813SQ201410488035
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月22日 優先權日:2014年9月22日
【發明者】喬慧, 傅洪拓, 張文宜, 熊貽偉, 蔣速飛, 金舒博, 龔永生 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業研究中心