專利名稱：玉米逆境誘導型啟動子的克隆及活性分析的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程技術領域，涉及一段DNA序列，在低溫、干旱和鹽害逆境脅迫下它可以作為啟動子調控基因的表達，具體來說，本發明涉及一種來源于玉米脂氧合酶(lipoxygenase)基因(ZmLOXlO)，并在植物中高度表達的多重逆境誘導型啟動子序列。
背景技術：
在全球氣候變化加劇，資源環境壓力增大，金融危機影響加重，糧食供給下行趨勢不斷深化的背景下，保障我國糧食安全始終是一項緊迫而重要的戰略任務。逆境脅迫是目前農業生產中影響糧食產量最重要的因素和挑戰之一。每年直接由鹽堿、干旱、低溫等逆境脅迫造成的農作物減產超過總產的20%左右。玉米是我國三大糧食品種之一，種植面積和產量均居世界前列，對保障國家糧食安全，提高主要農產品供給能力非常重要。玉米屬于逆境敏感型植物，生育期內極易受低溫、干旱、鹽漬等多元逆境脅迫的干擾和傷害。解決玉米生產中嚴重的多元逆境脅迫問題， 提高玉米產量，除了常規育種技術以外，基于基因遺傳轉化的生物育種技術是一個重要的選擇。雖然已有許多基因工程方法培育出抗性品種，但存在明顯的缺陷，即在基因工程中， 用來控制目的基因表達的啟動子主要以CaMV35S、玉米WDiquitin等組成型表達啟動子為主。該啟動子雖能使目的基因過量表達，但它是無環境、組織和時間特異性的組成型表達的啟動子。利用組成型表達啟動子控制抗性相關基因的過量表達雖然可以提高植物在逆境條件下的抗逆能力，但正常環境條件下細胞內也會過量表達抗逆蛋白，對植物來說是一種能量浪費，而且正常環境下細胞內的抗逆蛋白長時間過量的積累可能妨礙植物的正常生長代謝，引起植物的形態發生改變，造成轉基因植物生長發育嚴重停滯甚至死亡。因此，利用逆境誘導型啟動子實現高效、可控和特異(定點、定時、定量)的調控抗逆基因在改良作物的抗性中成為當前研究的熱點。非生物脅迫，如干旱、高鹽、低溫和高溫等，可以誘導植物體內相關基因表達，其轉錄調節的主要機制之一是逆境脅迫有關的轉錄因子(調節蛋白)與基因上游啟動子中關鍵順式元件特異結合，增強啟動子的活性，提高目的基因的表達量。國內外有一些關于逆境啟動子的報道，rd29A啟動子是脅迫誘導型啟動子，受ABA、干旱、高鹽及低溫等逆境誘導，是目前抗逆植物基因工程中應用最廣泛的誘導型啟動子(李新玲等，2007 ；楊春霞等，2008 ； 吳梅花等，2005 ;Yamaguchi_Shinozaki and Shinozaki, 1993)。Yamaguchi-Shinozaki 等 (2001)分別利用CaMV 35S組成型啟動子和rd29A逆境誘導型啟動子獲得了 DREB IA的轉基因植株，結果顯示rc^9A: :DREB IA轉基因植株的脅迫耐性明顯高于35S: :DREB1A的轉基因植株，表明rd29A啟動子能更有效地提高植物對低溫、干旱和高鹽等逆境脅迫的適應性。 Brown等Q001)首次在冬麥中發現了受低溫誘導的bltlOl. 1基因啟動子，并通過漸變缺失鑒定到了一個高度保守的TCA like元件(TCATCTTCTT)，表明該元件與誘導目的基因在低溫脅迫下高效表達密切相關。Takumi等在小麥種分離到一個低溫應答基因Wcor 15上游1. 7kb的啟動子序列，結果顯示該區段內包含有4個CRT/DRE like序列，包括CCGAC核心基序，實驗證明該啟動子受低溫和光誘導。利用逆境誘導型啟動子驅動抗逆基因的高效表達，從而改良作物對逆境脅迫的適應性已成為目前的研究熱點。然而，目前能應用于轉基因研究的誘導型啟動子仍然很少。因此，對于新的逆境相關啟動子的克隆、順式作用元件具體序列的確定、各元件之間的相互作用，以及與這些元件互作的轉錄因子的研究仍然是今后啟動子研究的重點。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種逆境誘導型啟動子序列，該啟動子序列能夠誘導目標基因高水平表達，而且該啟動子來源于玉米脂氧合酶基因(ZmLOXlO)。本發明的第二個目的是提供一種用于植物轉化的逆境誘導型啟動子載體，該載體指導高水平表達目標基因ZmLOXlO的逆境誘導型啟動子序列和5’非翻譯區。本發明的第三個目的是提供一種檢測啟動子活性的瞬時表達體系，該體系能反映啟動子誘導活性的高低。為實現上述目的，本發明克隆了玉米脂氧合酶基因(ZmLOXlO)的啟動子區，并構建了用于轉化的植物表達載體，所述載體中包含帶有SiiLOXIO基因的5’非翻譯區的上述啟動子。隨后利用所述載體在玉米胚中進行誘導表達，并觀察到該啟動子與逆境誘導性相關的高水平活性。本發明提供了一種獲得的玉米逆境誘導型啟動子序列，包含相對于SEQ ID NO 1 的轉錄起始位點的-Ibp至_127;3bp區(見序列表)的DNA核苷酸序列，低溫、干旱和鹽害可以在植物中誘導本發明所述的啟動子的高水平活性。獲得的玉米逆境誘導型啟動子序列源自玉米脂氧合酶基因(ZmLOXlO)。一種克隆得到的玉米脂氧合酶基因(ZmLOXlO)的5’非翻譯區包含相對于SEQ ID NO 1的轉錄起始位點的+Ibp至+170bp區(見序列表)的DNA核苷酸序列，本發明所述的非翻譯區能通過增強導入植物中的目標外源基因的翻譯效力，而誘導目標基因的高水平表達。為實現另一個目的，本發明提供一種用于玉米轉化的低溫、干旱和鹽害誘導型的植物表達載體，所述植物表達載體包含玉米逆境誘導型啟動子序列和玉米脂氧合酶基因 (ZmLOXlO)的5，非翻譯區。上述用于玉米轉化的逆境誘導型載體是指能夠在轉基因植物中持久表達外源基因的二元載體。所述二元載體可以是任何包含T-DNA (轉移DNA)的RB (右邊界序列)和 LB (左邊界序列)，能夠在根癌農桿菌(Agrobaterium tumefaciens) Ti質粒存在下轉化植物的二元載體。該載體可以是經常用于相關領域的二元載體，例如PCAMBIA1301載體、 PBI121 載體。本發明提供SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的PCR引物，適于擴增包含SEQ ID NO 1的序列DNA片段。關于本發明所述的用于植物的誘導型載體(PCAMBIA1301)，所述的玉米玉米脂氧合酶基因(ZmLOXlO)的啟動子和5’非翻譯區在植物表達載體中位于外源基因的前面。本發明提供通過插入本發明所述的玉米脂氧合酶基因(ZmLOXlO)的啟動子和5’非翻譯區至含有GUS報告基因的載體中而構建的PCAMBIA1301。但是，所述GUS報告基因是外源基因，并預期可以用任意其它有用的外源基因來代替。本發明提供一種應用逆境誘導型二元載體的轉基因植物，以及一種應用本發明所述進行瞬時表達的玉米成熟胚。本發明提供來自玉米脂氧合酶基因(ZmLOXlO)的逆境誘導型啟動子和5’非翻譯區，根據本發明的啟動子和5’非翻譯區使得能夠在植物中進行低溫、干旱和鹽害誘導型表達。本發明有益效果在于可用于啟動逆境相關基因的高效表達，應用于耐冷、耐旱和耐鹽的轉基因植物中，對于解決寒冷、干旱和鹽害地區糧食危機、生態惡化等問題都有積極意義。


圖 1 為 ZmLOXlO-pro PCR 電泳圖其中，M為 DL2000Marker，自上而下大小依次為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、 250bp和IOObp, 1-3為目的條帶圖2為ZmL0X10-pro回收電泳3為ZmLOX 10-pro連T載體后菌液PCR圖其中，M為DL2000Marker，1-6為菌液PCR檢測結果圖4為ZmL0X10-pro酶切電泳圖M 為 DL2000Marker圖5為大腸桿菌jToplO中pCAMBIA1301: JmLOXlOPro菌液PCR鑒定電泳圖其中，M為DL2000Marker，1-4為菌液PCR檢測結果圖6為pCAMBIA1301 ZmLOXlOPro轉農桿菌后菌液PCR檢測電泳圖上述圖中M為DL2000Marker，1-5為農桿菌菌液PCR結果。圖7為植物表達載體構建示意8為ZmLOXlO啟動子的⑶S染色圖(正面)圖9為ZmLOXlO啟動子的⑶S染色圖(背面)其中，圖8和圖9中從左至右依次為pCAMBIA1301未處理、ZmLOXlO未處理、 ZmLOXlO經低溫誘導、ZmLOXlO經PEG誘導、SnLOXlO經NaCl誘導
具體實施例方式下面結合附圖介紹具體實施例本發明的實施將能夠使本領域技術人員更清楚地理解如何實施本發明。盡管已經結合本發明的優選的具體實施方式
來對本發明進行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本發明的范圍。實施例1 玉米脂氧合酶基因(ZmLOXlO)的啟動子的克隆玉米脂氧合酶基因(ZmLOXlO)的啟動子(啟動子序列包含相對于SEQ ID NO=I的轉錄起始位點的-Ibp至-127;3bp區的DNA核苷酸序列)，在玉米脂氧合酶基因(ZmLOXlO) 的5’非翻譯區序列中得到鑒定。ZmLOXlO登錄在NCBI GenBank (登錄號NM_001112510)，序列表顯示本發明上述基因的玉米逆境誘導型啟動子和5，非翻譯區的DNA序列。在SEQ ID NO. 1中，翻譯起始密碼子 ATG 帶有下劃線,利用 http //www, fruitfly. org/seg tools/promoter, html 網站預測轉錄起始位點，用+1標注。并用啟動子分析網站(http //bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/)分析了啟動子的核心元件。CTAB方法提取玉米基因組DNA，以基因組DNA為模板擴增得到目的片段，經1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，擴增出長度為1443bp的特異條帶(圖1)，并利用膠回收試劑盒進行回收(圖2)，回收片段與PMD18-T載體連接得到重組質粒pMD18-T: ZmLOXlOftx)，轉化大腸桿菌ToplO，挑取單菌落后搖菌，并進行菌液PCR檢測(圖3)，呈陽性的菌液保存并送公司測序。更具體地說，通過PCR擴增克隆的玉米脂氧合酶基因(ZmLOXlO)的啟動子和170bp 的5’非翻譯區(見序列表)，上述PCR所用引物詳細顯示在表1中。對于PCR擴增，其反應程序為95°C 3min ；95°C 30s, 58°C 30s, 72°C 2min，31 個循環；72°C IOmin ； 16°C停止。表1:引物
權利要求
1.一種獲得的玉米逆境誘導型啟動子序列，其特征在于所述啟動子序列包含相對于 SEQID NO 1的轉錄起始位點的-Ibp至_127;3bp區的DNA核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的獲得的玉米逆境誘導型啟動子序列，其特征在于所述啟動子序列源自玉米脂氧合酶基因ZmLOXlO。
3.根據權利要求2所述的獲得的玉米逆境誘導型啟動子序列，其特征在于一種克隆得到的玉米脂氧合酶基因ZmLOXlO的5’非翻譯區包含相對于SEQ ID NO=I的轉錄起始位點的+Ibp至+170bp區的DNA核苷酸序列。
4.一種用于玉米轉化的逆境誘導型的植物表達載體，其特征在于所述植物表達載體包含權利要求1所述的玉米逆境誘導型啟動子序列和權利要求3所述的玉米脂氧合酶基因 ZmLOXlO的5，非翻譯區。
5.SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 3的PCR引物，其特征在于所述引物適于擴增包含SEQ IDNO 1的序列DNA片段。
全文摘要
玉米逆境誘導型啟動子的克隆及活性分析屬植物基因工程技術領域，本發明提供一種獲得的玉米逆境誘導型啟動子序列，包含相對于SEQ ID NO1的轉錄起始位點的-1bp至-1273bp區的DNA核苷酸序列；同時提供用于玉米轉化的逆境誘導型的植物表達載體，包含玉米逆境誘導型啟動子序列和玉米脂氧合酶基因的5’非翻譯區；SEQ ID NO2和SEQ ID NO 3的PCR引物，其特征在于所述引物適于擴增包含SEQ ID NO1的序列DNA片段；本發明可用于啟動逆境相關基因的高效表達，應用于耐冷、耐旱和耐鹽的轉基因植物中，對于解決寒冷、干旱和鹽害地區糧食危機、生態惡化等問題都有積極意義。
文檔編號C12N15/84GK102373208SQ201110355029
公開日2012年3月14日 申請日期2011年11月10日 優先權日2011年11月10日
發明者劉金亮, 張世宏, 李桂華, 潘洪玉, 胡瑞學, 賈承國 申請人:吉林大學